葉欣悅， 閆見敏，2， 楊雪蓮， 李云洲，2， 須 文，2

(1.貴州大學農(nóng)學院，貴州貴陽 550025； 2.貴州大學蔬菜研究院，貴州貴陽 550025)

褪黑素(melatonin)化學名為N-乙?；?5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，分子式為C13H16N2O2，相對分子質(zhì)量為232.27，是一種高度保守的小分子色氨酸吲哚類衍生化合物。由褪黑素及其代謝產(chǎn)物組成的持續(xù)性清除活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的過程被稱為自由基清除級聯(lián)(free radical scavenging cascade)[1]。據(jù)估計，通過這種自由基級聯(lián)清除，1分子的褪黑素可以清除多達10個ROS或RNS分子，這使得褪黑素能夠在較低的劑量下也能夠有效保護生物免受氧化應激[2-3]。研究表明，外源褪黑素的應用可以減緩不同非生物脅迫誘導的衰老，因此也被稱為植物非生物脅迫的通用調(diào)節(jié)劑[4-6]。除此之外，褪黑素還作為一種多功能信號分子，參與植物晝夜節(jié)律[7]、外植體生長、開花[8]和種子萌發(fā)[9]等生理過程。

近年來，植物褪黑素合成途徑已被闡明。植物褪黑素的合成主要由6種不同的酶參與，包括色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，簡稱TDC)、色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，簡稱TPH)、色胺5-羥化酶(tryptamine 5-hydroxylase，簡稱T5H)、血清素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(serotoninN-acetyltransferase，簡稱SNAT)、乙酰5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶(acetylserotonin methyl transferase，簡稱ASMT)、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶 (caffeic acidO-methyltransferase，簡稱COMT)[8]。根據(jù)Byeon 等的研究[10]，COMT與ASMT同屬于O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族，能夠甲基化苯丙烷類化合物、黃酮類化合物和生物堿，而能夠甲基化N-乙酰血清素的COMT則被重新命名為COMT1。過表達番茄咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(SlCOMT1)提高了番茄內(nèi)源褪黑素的含量，并通過提高抗壞血酸(ASA)-谷胱甘肽(GSH)循環(huán)減輕多菌靈帶來的藥害[11]。而通過病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術(shù)沉默SlCOMT1基因減少了內(nèi)源褪黑素的含量，并加劇了番茄在高溫脅迫下誘導的衰老[12]。

番茄(Solanumlycopersicum)是我國重要的經(jīng)濟作物，同時也是茄科的模式作物。Micro-Tom作為一種小型栽培品種具有株型小和生長周期短等特點，被廣泛用作番茄研究的模式作物[13]。目前，關(guān)于SlCOMT1基因的研究主要集中在番茄栽培變種Ailsa Craig中[14]。本試驗以研究較少的番茄品種Micro-Tom作為試驗材料，通過設(shè)計特異性引物，克隆SlCOMT1基因。利用qRT-PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫法探討SlCOMT1基因在不同組織器官、不同生育時期的表達模式和褪黑素含量變化，以期為深入研究SlCOMT1基因的功能以及番茄的抗逆育種和栽培提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 番茄幼苗的培養(yǎng)

2021年9月，于貴州大學農(nóng)學院園藝系實驗室將番茄(Lycopersiconesculentumvar. Micro-Tom)種子經(jīng)過50 ℃的無菌水溫湯浸種10 min后，在恒溫25 ℃的黑暗條件下進行催芽。2 d后將萌發(fā)的種子置入裝滿基質(zhì)的50穴穴盤中，并置入培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，2葉1心后將番茄幼苗移栽至10 cm寬的圓形營養(yǎng)缽中，并置于貴州大學農(nóng)學院園藝系溫室中，每5 d施用1次霍格蘭德營養(yǎng)液，培養(yǎng)室溫度為恒定25 ℃，光暗周期為16 h/8 h。

1.2 樣品的取樣分析

分別取4葉1心番茄幼苗的同一葉位的幼葉、成熟葉和衰老葉為待測葉片樣品；在花期分別取花苞、正在開放的花和開放后5 d衰老的花為待測花樣品；在結(jié)果期分別取綠熟期、破色期、紅熟期的番茄果實為待測果實樣品。所有樣品從正常生長的番茄植株上取下后迅速用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 番茄總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

使用RNA提取試劑盒(DP432，北京天根)對番茄樣品進行總RNA的提取，通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量。使用cDNA第一鏈合成試劑盒(KR118，北京天根)完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄。獲得的cDNA保存在-20 ℃的冰箱中待用。

1.4 SlCOMT1基因的克隆

從番茄基因組數(shù)據(jù)庫(https：//solgenomics.net/)中獲得SlCOMT1基因(Solyc03g080180)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)序列，通過Primer 5.0設(shè)計全長引物并使用Primer-BLAST進行檢測引物特異性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以番茄葉片cDNA為模板，在BIO-RAD T100 Thermal Cycler平臺進行RT-PCR克隆SlCOMT1基因序列，反應總體系為20 μL，其中cDNA 2 μL，正、反引物各 0.5 μL，2×TaqPCR 10 μL，ddH2O 7 μL；PCR反應程序：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收所需的條帶并連接到pMD18-T克隆載體上交由北京擎科生物科技有限公司進行測序。SlCOMT1基因克隆所使用的引物見表1。

表1 本研究中使用的引物

1.5 SlCOMT1蛋白的生物信息學分析

通過番茄基因組數(shù)據(jù)庫(https：//solgenomics.net/)獲得SlCOMT1(Solyc03g080180.2.1)編碼的堿基序列和氨基酸序列；使用NCBI中的Batch CD-Search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索COMT1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，擬南芥和西瓜的COMT1蛋白序列分別參考Byeon[10]、Chang等的序列[15]，經(jīng)過MUSLE多序列比對后使用Tbtools MSA trimmer修剪后進行可視化；使用ExPASy(https：//web.expasy.org/)分析SlCOMT1蛋白的理化性質(zhì)；使用TMHMM 2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/)預測SlCOMT1蛋白的跨膜區(qū)域；使用NCBI的Protein BLAST工具尋找同源蛋白序列，通過ClustalW進行多序列比對后使用MEGA(V.10.2.6) 采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap=1 000)；使用Plant-mPloc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/)預測亞細胞定位；用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)預測SlCOMT1的二級及三級結(jié)構(gòu)。

1.6 番茄內(nèi)源性褪黑素含量的檢測

分別精確稱取0.3 g番茄各組織樣品，添加 3 mL 磷酸緩沖溶液，在冰上研磨成勻漿，3 000 r/min 離心10 min取上清液。按照植物褪黑素(MT)ELISA試劑盒(深圳子科生物科技有限公司)說明書上的方法檢測褪黑素含量，在多功能酶標儀Multiskan FC(賽默飛世爾科技公司)測定 450 nm 波長下上清反應液的吸光度，計算不同組織中內(nèi)源性褪黑素的含量，每個組織部位含3次生物學重復。結(jié)果通過DPS軟件采用最小顯著性差異(LSD)法檢驗不同組織內(nèi)源性褪黑素含量的差異顯著性(α=0.05)。

1.7 SlCOMT1基因的表達模式分析

用qRT-PCR檢測SlCOMT1基因在不同組織的表達情況。以Actin(Solyc03g078400)為內(nèi)參基因，用SYBR-Green染料在FQD-96A(BIOER，杭州)平臺進行qRT-PCR。體系及步驟參照周露等的方法[16]，用2-ΔΔCT法計算相對表達倍數(shù)。每個處理3次生物學重復，每次生物學重復3次技術(shù)重復。結(jié)果通過DPS軟件用LSD法檢驗不同組織或處理間SlCOMT1基因相對表達量的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlCOMT1基因克隆及序列分析

為了從番茄中獲得SlCOMT1基因，以成熟Micro-Tom番茄葉片的cDNA為模板，使用特異性的SlCOMT1引物(表1)進行PCR，在1.2%的瓊脂糖凝膠上檢測到預期大小的條帶(圖1)，并對其進行測序和特征分析。SlCOMT1基因全長為1 074 bp，編碼357個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，與其他COMT1類似，番茄SlCOMT1蛋白序列在第28～79氨基酸和第134～338氨基酸處分別含有二聚化保守結(jié)構(gòu)域和甲基轉(zhuǎn)移酶2保守結(jié)構(gòu)域，屬于SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員(圖2)，表明該基因在不同物種中較為保守。多序列比對結(jié)果(圖3)表明，番茄SlCOMT1的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合位點、催化殘基和酚類底物結(jié)合位點，都顯示出較高保守性。根據(jù)ExPASy預測對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，SlCOMT1蛋白分子量為38.95 ku，結(jié)構(gòu)式為 C1 746H2 740N448O513S23，理論等電點(PI)為5.63，負電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)41個，正電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)33個。不穩(wěn)定系數(shù)為29.20，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為88.26，表明SlCOMT1蛋白脂溶性很強。

2.2 SlCOMT1蛋白親水性分析

用ProtScale對SlCOMT1蛋白親水性預測結(jié)果(圖4)表明，SlCOMT1的親水性均值(GRAVY)為0.020，表明該蛋白為疏水性蛋白。其中，多肽鏈第120位的脯氨酸具有最高的疏水性(2.344)，第324位的精氨酸具有最高的親水性(-2.700)。

2.3 SlCOMT1跨膜結(jié)構(gòu)預測

通過TMHMM 2.0對番茄SlCOMT1進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預測，結(jié)果(圖5)表明SlCOMT1蛋白不含有跨膜區(qū)域，屬于非跨膜蛋白。

2.4 SlCOMT1蛋白磷酸化位點預測

使用NetPhos預測了SlCOMT1蛋白的磷酸化位點，結(jié)果(圖6)表明，SlCOMT1含有預測的磷酸化位點31個，其中絲氨酸磷酸化位點18個；蘇氨酸磷酸化位點11個；酪氨酸磷酸化位點2個。

2.5 SlCOMT1亞細胞定位預測

使用Plant-mPloc預測SlCOMT1的亞細胞定位，結(jié)果表明，SlCOMT1定位于葉綠體中。

2.6 SlCOMT1蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預測

使用SOPMA預測SlCOMT1蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖7)，在SlCOMT1的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占45.10%，無規(guī)則卷曲占32.77%，延展鏈占15.41%，β轉(zhuǎn)角占6.72%，推測SlCOMT1蛋白主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。使用SWISS-MODEL預測SlCOMT1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖8。

2.7 SlCOMT1的系統(tǒng)發(fā)育樹及保守基序分析

通過系統(tǒng)發(fā)育樹及MEME保守基序分析SlCOMT1，結(jié)果(圖9)表明，番茄SlCOMT1與同科的辣椒和馬鈴薯具有較高的親緣關(guān)系且具有相同的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量。

2.8 SlCOMT1在番茄不同組織器官中的表達模式及褪黑素含量變化

采用qRT-PCR技術(shù)，筆者檢測了不同發(fā)育階段的番茄葉片、花和果實中SlCOMT1基因的相對表達量、內(nèi)源性褪黑素的含量。結(jié)果(圖10)表明，SlCOMT1基因在番茄幼葉、成熟葉、衰老葉、花苞、開放當天的花、開放后5 d的花、綠熟果、破色期果實、紅熟果等不同組織器官中都有表達，而且表達量不同。在葉片和果實的不同發(fā)育階段，SlCOMT1的表達隨著葉片和果實器官的發(fā)育其相對表達量顯著降低。不同組織器官中內(nèi)源褪黑素的含量變化也表現(xiàn)出類似的變化趨勢，表明番茄葉片和果實中SlCOMT1基因的表達與內(nèi)源褪黑素的生物合成密切相關(guān)。而在花器官中，SlCOMT1的表達隨著花的發(fā)育呈現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢，并在衰老花(開放后5 d的花)中表達量最高。而衰老花的內(nèi)源褪黑素含量與其他時期的花之間沒有顯著差異，表明褪黑素在花發(fā)育進程中發(fā)揮的功能可能有別于其他組織。

3 討論與結(jié)論

褪黑素是一種重要的信號分子，在植物響應非生物和生物脅迫中具有多種生理功能[19]。番茄SlCOMT1是與擬南芥褪黑素合成相關(guān)的AtCOMT1核苷酸序列最相似的基因，通過過表達和基因沉默技術(shù)證明了SlCOMT1與番茄褪黑素合成有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)SlCOMT1在Micro-Tom不同時期的組織器官中表達水平與內(nèi)源性褪黑素的含量存在一定的關(guān)聯(lián)，并在幼嫩組織中SlCOMT1的相對表達和褪黑素含量最高，這可能與SlCOMT1參與組織發(fā)育以及褪黑素的代謝水平有關(guān)，因為這些組織的代謝活動較高。Okazaki 等采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)方法[20]，在Micro-Tom所有器官中均檢測到褪黑素含量在1.5～66.6 ng/g之間，種子中褪黑素的含量最高，其次是發(fā)芽后生長4 d的幼苗，葉片中的含量高于花中的含量。Liu等采用實時熒光定量PCR方法[14]檢測Ailsa Craig番茄中SlCOMT1的時空表達情況。結(jié)果表明，SlCOMT1在番茄的根、芽、葉、花、果實等組織中具有時空特異性，在這些組織中表達水平不同。在根中表達量最低，在果實中表達量最高，說明SlCOMT1可能參與了果實發(fā)育的調(diào)控。本研究結(jié)果是Micro-Tom正在開放的花和開放后5 d的花中褪黑素含量高于成熟葉片，紅熟果中的褪黑素含量顯著低于綠熟果，這與Liu等的研究結(jié)果[14，19]不太一致，這可能與分析的樣品、植株生長發(fā)育的狀態(tài)不同有關(guān)。Okazaki等的研究是取包括花苞到開放了的花，也就是全部花的混合樣品進行分析；他們對不同成熟階段的果實褪黑素含量分析結(jié)果表明，進入綠熟階段后，隨著果實的進一步成熟，果實中褪黑素含量有所增加，但是差異并不顯著[19]。Liu等沒有對SlCOMT1的表達量進行差異顯著性分析[14]。本研究和Okazaki等的研究[19]一致表明在番茄葉、花、果實中均檢測到褪黑素，且褪黑素在幼葉中的積累量高于成熟葉，并和Liu等的研究[14]一致表明，褪黑素在番茄花中的積累量高于葉片。褪黑素的濃度因番茄發(fā)育階段的不同而不同，表明褪黑素在番茄發(fā)育過程中起著作用，可能參與番茄成熟的一些過程。

番茄SlCOMT1蛋白具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶超家族典型的保守結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)，是一種穩(wěn)定的高脂溶性蛋白。SlCOMT1基因及褪黑素在矮生型番茄Micro-Tom的葉片、花、果實等不同組織器官中都有表達和積累，SlCOMT1的表達和內(nèi)源褪黑素生物合成在番茄不同發(fā)育時期的葉片和果實之間存在一定的相關(guān)性，并在幼嫩組織中檢測到SlCOMT1較高表達和褪黑素積累，這可能與SlCOMT1參與組織發(fā)育以及褪黑素的代謝水平有關(guān)，SlCOMT1在花發(fā)育過程中的生物學功能將是進一步研究的重點。