萬小琪， 竇維卉， 楊 雪， 謝 洋， 張 寧， 武春成

(河北科技師范學院園藝科技學院/河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點實驗室，河北秦皇島 066004)

黃瓜(CucumissativusL.)是我國主要栽培的設(shè)施蔬菜，具有產(chǎn)量高、經(jīng)濟效益好的特點。但隨著設(shè)施黃瓜栽培年限的增加，導致了土壤化學性質(zhì)和土壤微生物環(huán)境的惡化，降低了黃瓜的產(chǎn)量，制約了設(shè)施黃瓜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展。

目前設(shè)施蔬菜連作土壤改良方面的研究較多，如采用土壤消毒，或者施入微生物菌肥、有機物料、生物炭等均能起到一定的改良效果。微生物菌肥通過微生物的生命活動，產(chǎn)生植株所需的特定養(yǎng)分，從而促進土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和調(diào)控植株生長[1]。田偉等研究表明，微生物菌肥能促進植株生長，促進土壤中有益微生物的繁殖[2-4]。張玉博等研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌是一類重要的生防菌[5]，能促進幼苗生長，提高植株的抗性[6-7]。生物炭能改善土壤性質(zhì)和土壤微生物環(huán)境，進而促進植物生長，被廣泛關(guān)注[8-9]。王彩云等研究表明，施用添加質(zhì)量比為5%的生物炭能促進黃瓜植株生長，提高果實產(chǎn)量[10]。涂玉婷等研究發(fā)現(xiàn)，生物炭可通過改變土壤理化性質(zhì)和微生物環(huán)境，達到促生、增產(chǎn)、提質(zhì)的效果[11]。雖然目前該方面的研究較多，但由于不同地域環(huán)境及土壤類型，各種措施的改良效果不盡相同。本研究以課題組在其他區(qū)域設(shè)施連作土壤改良方面表現(xiàn)較好的4種農(nóng)藝型措施為試驗處理，在秦皇島市昌黎縣溫室秋冬茬黃瓜上進行試驗，綜合分析其對黃瓜產(chǎn)量、土壤化學性質(zhì)以及土壤微生物多樣性等方面的影響，以期探索出適合當?shù)販厥尹S瓜連作土壤的改良方法。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

田間試驗于2020年9月至2021年3月在河北省秦皇島市昌黎縣新集鎮(zhèn)小營村(119°10′E、39°42′N，海拔22 m)日光溫室進行，試驗土壤為溫室連續(xù)栽培黃瓜15年的土壤，基本理化性質(zhì)為pH值7.32，電導率(EC值)609.10 μS/cm，有機質(zhì)含量 55.04 g/kg，堿解氮含量196 mg/kg，速效磷含量49.82 mg/kg，速效鉀含量239.02 mg/kg。

1.2 試驗材料

供試黃瓜品種為田驕八號，由青島碩豐源種業(yè)有限公司培育。微生物菌肥由山東友邦肥業(yè)科技有限公司提供，有機質(zhì)含量≥40%，有效活菌數(shù)≥0.20億個/g。微生物菌劑由甘肅鴻遠生物科技有限公司提供，有效活菌數(shù)≥108CFU/g。高碳堆肥由寧夏農(nóng)林科學院園藝研究所提供，主要成分為檸條、雞糞和生物炭混合發(fā)酵而成，有機質(zhì)含量> 35.2%，基本理化性質(zhì)為pH值6.53，EC值 7.23 μS/cm，速效磷含量269.13 mg/kg，速效鉀含量2 370.36 mg/kg。生物炭以玉米秸稈為原料，由遼寧省的生物炭工程技術(shù)研究中心提供，基本性質(zhì)為平均孔徑 16.27 mm，粒徑1.5～2.0 mm，全碳含量70.38%，全氮含量1.53%，全磷含量0.78%，全鉀含量1.68%，pH值8.97。木霉菌為木霉復合粉劑，由黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院、黑龍江田利保生物科技有限公司和黑龍江牧康牧業(yè)生物有限公司提供，有效活菌數(shù)≥10億個/g。有機肥由昌黎縣嘉誠實業(yè)集團有限公司提供，主要成分為菇渣和牛糞，有機質(zhì)含量>52%。

1.3 試驗設(shè)計

田間試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，以每畦(每畦為1個小區(qū)，每個小區(qū)3次重復，畦長6 m，畦面寬1 m，畦間距20 cm)單施有機肥20.0 kg為對照(CK)，以課題組前期在不同區(qū)域試驗過的4個農(nóng)藝型改良措施為處理。(1)微生物菌肥配施有機肥(MF)：每畦微生物菌肥13.0 kg配施有機肥20.0 kg，有機肥散施深翻，與土壤混合均勻后做畦，微生物菌肥在定植時平均施入定植穴；(2)高碳堆肥配施有機肥(CF)：每畦高碳堆肥 35.0 kg 配施有機肥10.0 kg，各施入物散施深翻，與土壤混合均勻后做畦；(3)微生物菌劑配施有機肥(MA)：每畦微生物菌劑73.6 g配施有機肥 20.0 kg，有機肥散施深翻，與土壤混合均勻后做畦，微生物菌劑在定植時平均施入定植穴；(4)生物炭和木霉菌配施有機肥(BT)：每畦生物炭20.0 kg、木霉菌100 g配施有機肥20.0 kg，各施入物散施深翻，與土壤混合均勻后做畦。于2020年10月9日定植，1葉1心黃瓜靠接苗，雙行定植，每畦定植46株，畦面覆蓋黑色地膜，膜下鋪設(shè)滴灌管，日常管理同常規(guī)。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 土壤取樣方法 于黃瓜盛瓜期(2021年1月6日)采集黃瓜根區(qū)土樣，每個處理采用五點法采集0～20 cm耕層土壤。將土壤樣品分別裝于無菌塑料袋中，立刻帶回實驗室處理。一份放置在 -80 ℃ 的超低溫冰箱中待測土壤微生物多樣性，另一份在室內(nèi)自然風干過2 mm的網(wǎng)篩后測定土壤化學性質(zhì)。

1.4.2 小區(qū)產(chǎn)量測定 采用稱量法定期按小區(qū)進行單獨采摘，測定黃瓜質(zhì)量，拉秧后統(tǒng)計小區(qū)總產(chǎn)量。

1.4.3 土壤化學性質(zhì)測定 土壤pH值和EC值均用DZS-708型水質(zhì)分析儀(上海雷磁公司)測定；土壤有機質(zhì)含量用重鉻酸鉀容量-稀釋熱法測定；土壤堿解氮含量用堿解擴散法測定；土壤速效鉀含量用醋酸銨-火焰光度計法測定；土壤速效磷含量用鉬銻抗比色法測定；土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定[12-13]。

1.4.4 土壤微生物多樣性測定 土壤細菌使用引物338F(A C T C C T A C G G G A G G C A G C A G)和806R(G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T)對16S rRNA 基因 V3～V4區(qū)進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。土壤真菌使用引物ITS1F(C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T A A)和ITS2R(G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C)對 ITS1F～ITS2R區(qū)進行PCR擴增，并根據(jù)上海美吉生物有限責任公司(上海)的標準方案在Illumina MiSeq 平臺上進行測序，細菌和真菌高通量測序數(shù)據(jù)分析均是基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的云服務結(jié)果進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 9.01軟件中的新復極差法分析。根據(jù)操作分類單元(OTU)聚類，采用Mothur軟件進行alpha多樣性分析；群落組成分析基于tax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用Excel 2010作表；用R語言進行層級聚類分析繪制樹狀圖；常采用歐氏距離(Euclidean distances)進行基于距離的冗余分析(db-RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對黃瓜小區(qū)產(chǎn)量的影響

如圖1所示，不同處理均提高了黃瓜的小區(qū)產(chǎn)量，表現(xiàn)為BT>CF>MA>MF>CK處理，其中CF和BT處理均顯著高于CK，較CK分別提高了4.69%、5.94%。

2.2 不同處理對土壤化學性質(zhì)的影響

由表1可知，MF處理的有機質(zhì)、全氮和堿解氮含量與CK相比均顯著提高；MF處理的pH值顯著高于CF，MF處理的全氮含量顯著高于MA和BT處理；除BT處理外，其他處理的土壤EC值均高于CK，但差異不顯著；各處理間速效磷含量和速效鉀含量均差異不顯著。

表1 不同處理對土壤化學性質(zhì)的影響

2.3 不同處理對土壤細菌和真菌群落多樣性的影響

由表2可知，在細菌群落中，各處理的OTU數(shù)量和Shannon指數(shù)并無顯著差異，MF處理的Simpson指數(shù)顯著低于BT處理。在真菌群落中，CF處理的OTU數(shù)量顯著高于其他處理和CK；除MA處理外，各處理的Shannon指數(shù)均顯著高于CK，各處理的Simpson指數(shù)均顯著低于CK。

表2 不同處理對土壤細菌和真菌群落的多樣性分析

2.4 不同處理對土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由表3可知，對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同處理改變了土壤細菌門水平的相對豐度。各處理均降低了放線菌門的相對豐度，MA處理顯著提高了厚壁菌門和髕骨細菌門的相對豐度；BT處理與CK相比顯著降低了放線菌門的相對豐度，顯著提高了浮霉菌門的相對豐度。

表3 不同處理對土壤細菌門水平主要菌群相對豐度的影響

在屬水平上，選取各處理土壤前10個相對豐度較高菌屬。由表4可知，MF、MA處理與CK相比，變形菌門MND1菌屬的相對豐度顯著提高；各處理與CK相比，均顯著提高了Dongia屬的相對豐度。

表4 不同處理對土壤細菌屬水平主要菌群相對豐度的影響

由表5可知，在門水平上對土壤真菌群落分析發(fā)現(xiàn)，MF和CF處理均顯著提高了擔子菌門的相對豐度；MF、CF處理與CK相比顯著提高了未知真菌門的相對豐度；各處理間子囊菌門、被孢霉門和壺菌門的相對豐度差異不顯著。

由表6可知，各處理均顯著降低了腐質(zhì)霉屬的相對豐度；與CK相比，MF處理顯著降低了嗜熱毀絲霉屬的相對豐度，顯著提高了錐蓋傘屬的相對豐度。BT處理的曲霉屬相對豐度較CK顯著提高。

表5 不同處理對土壤真菌門水平主要菌群相對豐度的影響

表6 不同處理對土壤真菌屬水平主要菌群相對豐度的影響

2.5 不同處理對土壤細菌和真菌群落層級聚類分析

如圖2所示，土壤細菌群落門水平上，BT和MF、MA和CF分別在1個分枝，CK單獨在1個分枝上。說明與CK相比，各處理改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。土壤真菌門水平上，BT、CK和MA聚合在一起，MF和CF聚合在另一個分枝上，說明各處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有一定的影響。

2.6 不同處理的土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)對土壤化學性質(zhì)的響應

如圖3所示，通過冗余分析發(fā)現(xiàn)，影響程度排前2位的土壤環(huán)境因子依次為有機質(zhì)和速效磷含量。細菌群落中AN含量與AK、OM、TN含量和EC值呈正相關(guān)，pH值與OM含量呈負相關(guān)。真菌群落中AK含量與pH值呈正相關(guān)，EC值與AP、OM含量呈正相關(guān)，AP含量和OM含量呈正相關(guān)。

3 討論

已有研究表明微生物肥料和生物炭對連作土壤具有明顯的改良作用。微生物肥料是通過其自身攜帶的多種有益微生物將土壤中的營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化為可以被植株吸收利用的形式來促進養(yǎng)分吸收[14-15]，本試驗結(jié)果與之相似。微生物菌肥配施有機肥施入土壤后，明顯提高了速效鉀含量，顯著提高了有機質(zhì)和堿解氮含量。研究發(fā)現(xiàn)生物炭施入土壤后能提高有機質(zhì)含量，改善土壤的速效養(yǎng)分含量[16-17]。本試驗中生物炭和木霉菌配施有機肥處理提高了土壤pH值、有機質(zhì)和速效鉀含量，降低了土壤EC值。

不同施肥處理會引起土壤化學環(huán)境的改變，從而影響微生物物種的多樣性[18]。Ding等研究表明，施入有機肥能改善土壤的生物多樣性[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，各處理細菌群落多樣性與對照相比差異明顯，這可能與施肥時間、施入量有關(guān)。本試驗中有機肥和微生物菌肥、高碳堆肥、微生物菌劑、生物炭、木霉菌等的施入時間較短，因此對土壤細菌群落的生物多樣性產(chǎn)生的影響較小[20]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，土壤細菌群落在門水平上的主要優(yōu)勢菌群有變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門，這些菌群在其他植物連作土壤研究中也被認為是優(yōu)勢種群[21-22]。已有研究表明，酸桿菌門可以產(chǎn)生多種代謝物，分解難降解物質(zhì)，從而促進生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[23-25]。在本試驗中微生物菌肥配施有機肥、生物炭和木霉菌配施有機肥處理的土壤變形菌門和酸桿菌門的相對豐度較高，說明微生物菌肥和生物炭施入土壤后加速了土壤中物質(zhì)的分解和代謝，提高了土壤的有機質(zhì)含量，增加了作物抗病能力，促進了作物生長。放線菌門是有機質(zhì)礦化的主要微生物，能在營養(yǎng)較低或有難降解碳的土壤中生長，促進土壤中動植物殘體分解[26-28]。在本試驗中生物炭和木霉菌配施有機肥處理較對照相比，顯著降低了放線菌門的相對豐度，說明生物炭和木霉菌施入土壤提高了土壤養(yǎng)分含量增加，從而抑制了放線菌門細菌的生長。

本試驗發(fā)現(xiàn)真菌群落門水平土壤中相對豐度最高的是子囊菌門，子囊菌門是最大的病原菌構(gòu)成群體，黃瓜連作土壤中子囊菌門豐度的增加極有可能與黃瓜病害的發(fā)生有關(guān)，是黃瓜連作障礙發(fā)生的原因之一[29]。在本試驗中，微生物菌肥配施有機肥(MF)處理降低了子囊菌門真菌的相對豐度，從而降低了黃瓜病害的發(fā)生。多數(shù)研究表明有機質(zhì)、全氮、速效磷含量和pH值是驅(qū)動溫室黃瓜連作土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化的環(huán)境因子[30-31]，本試驗發(fā)現(xiàn)在細菌群落和真菌群落在所選環(huán)境因子中，有機質(zhì)含量的解釋度最高，其次是速效磷含量。

4 結(jié)論

微生物菌肥配施有機肥處理提高了土壤pH值、EC值、有機質(zhì)、全氮、堿解氮和速效鉀含量；生物炭和木霉菌配施有機肥處理提高了土壤pH值、有機質(zhì)和速效鉀含量，降低了土壤EC值。土壤細菌群落門水平下，微生物菌肥配施有機肥處理提高了變形菌門的相對豐度；生物炭和木霉菌配施有機肥處理提高了酸桿菌門的相對豐度，顯著降低了放線菌門的相對豐度。土壤真菌門水平下微生物菌肥配施有機肥處理降低了子囊菌門的相對豐度。由于不同處理對土壤化學性質(zhì)的改良和土壤微生物環(huán)境條件的改善，從而促進黃瓜產(chǎn)量的提高。通過冗余分析，本試驗發(fā)現(xiàn)有機質(zhì)和速效磷含量是影響溫室黃瓜連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子。綜合分析認為，微生物菌肥配施有機肥和生物炭、木霉菌配施有機肥處理更有利于改善土壤化學性質(zhì)和土壤微生物環(huán)境，促進黃瓜的生長和產(chǎn)量的提高。