班雨函，王利文，楊兵兵，馬愛進(jìn)，桑亞新，孫紀(jì)錄,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

蝦醬是一種將小型蝦類或蝦類加工副產(chǎn)品經(jīng)過發(fā)酵后制成的黏稠醬狀食品[1]，具有獨(dú)特的鮮香風(fēng)味，是我國沿海地區(qū)和東南亞地區(qū)常見的一種調(diào)味料[2-3]。但是，傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬含鹽量較高，一般在25%～30%，高鹽量容易導(dǎo)致高血壓等心腦血管疾病，已經(jīng)不符合健康消費(fèi)潮流。低鹽豆醬[4]、低鹽魚露[5]、低鹽醬油[6]等低鹽發(fā)酵食品逐漸成為研究熱點(diǎn)。近年來，新型的低鹽蝦醬也已在一些地區(qū)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。但是，低鹽蝦醬存在耐儲性低、貨架期短等缺點(diǎn)[7]，因此，生產(chǎn)商品化低鹽蝦醬的企業(yè)占比較少。河北黃驊地區(qū)生產(chǎn)的低鹽蝦醬是將捕撈的新鮮蜢子蝦經(jīng)過攪碎加鹽（約12%）后，裝入發(fā)酵缸中，在低于20 ℃的條件下自然發(fā)酵約145 d而成。目前，對低鹽蝦醬的研究報道較少，且主要集中于實(shí)驗(yàn)室水平的低溫發(fā)酵[8]和酶法分解快速制備[9]，而對工廠化生產(chǎn)的自然發(fā)酵的低鹽蝦醬研究罕見報道。

微生物在發(fā)酵食品中起著至關(guān)重要的作用，低鹽蝦醬的發(fā)酵過程屬于自然發(fā)酵，通常會含有來自原料以及與蝦的生長環(huán)境相關(guān)的微生物。Sang Xue等[10]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)渤海不同地區(qū)生產(chǎn)的蝦醬產(chǎn)品的微生物多樣性有明顯差異，可能是受到地理位置以及氣候的影響。Ohshima等[11]對泰國兩個工廠生產(chǎn)商品化魚露發(fā)酵過程多樣性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)原料來源會影響產(chǎn)品的微生物群落組成。Dai Lingying等[12]對蝦醬發(fā)酵過程細(xì)菌群落多樣性變化進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)主要細(xì)菌菌群在發(fā)酵不同階段的變化，Lv Xinran等[13]對探究錦州蝦醬細(xì)菌群落變化與風(fēng)味形成的關(guān)系，對蝦醬多樣性分析的已知研究中，主要集中于對蝦醬細(xì)菌群落的研究，對真菌群落的研究相對匱乏。

因此，本研究為探究商品化低鹽蝦醬發(fā)酵過程中微生物群落和品質(zhì)變化，從黃驊工廠采集商品化低鹽蝦醬發(fā)酵過程中不同階段的樣品作為研究對象，測定蝦醬的生物胺、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮等理化指標(biāo)，通過高通量測序分析蝦醬的真菌和細(xì)菌的菌落組成及多樣性，并對理化性質(zhì)和微生物多樣性進(jìn)行相關(guān)性分析，以期揭示商品化低鹽蝦醬的發(fā)酵過程中的微生物群落演變規(guī)律，為改善商品化低鹽蝦醬工藝提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品化低鹽蝦醬樣品 黃驊眾信水產(chǎn)有限公司。

乙腈、甲醇（均為色譜級） 美國Fisher Chemical公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（組胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、β-苯乙胺鹽酸鹽、色胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽、精胺鹽酸鹽、亞精胺鹽酸鹽）、丹磺酰氯（純度均不小于99%） 上海源葉生物科技有限公司；E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 美國OMEGA公司；Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；TaqDNA Polymerase 美國Thermo公司；Agencourt AMPure XP美國Beckman公司；一般理化指標(biāo)測定試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜系統(tǒng)（包括二元泵、2998紫外-可見光檢測器、1500柱溫箱） 沃特世科技（上海）有限公司；色譜柱WondaSil C18（4.6 mm×250 mm） 日本GL Science公司；PHS型pH計(jì) 合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司；TGL-16MC低溫冷凍離心機(jī) 長沙湘銳離心機(jī)有限公司；Qubit?2.0熒光計(jì) 美國Invitrogen公司；ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦醬樣品的采集

蝦醬樣品均采自黃驊眾信水產(chǎn)有限公司，工廠位于環(huán)渤海地區(qū)的河北省黃驊市，將從黃驊港捕撈的新鮮蜢子蝦，加鹽（添加量約12%）攪拌，自然發(fā)酵150 d左右（2020.10.26—2021.03.18）。整個發(fā)酵周期主要處在中國北方的冬季和春季，氣溫較低。在發(fā)酵過程的不同時間段取樣，樣品采集后裝入無菌袋內(nèi)，在－80 ℃的冰箱保存，待用。樣品采集信息見表1。

表1 商品化低鹽蝦醬樣品采集信息Table 1 information about commercial low-salt shrimp paste samples collected in this study

1.3.2 理化指標(biāo)分析

理化指標(biāo)分析時，所測定樣品均為濕質(zhì)量樣品。

1.3.2.1 丙二醛的測定

根據(jù)GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》中的分光光度法測定[14]。

1.3.2.2 氨基酸態(tài)氮的測定

根據(jù)GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的比色法測定[15]。

1.3.2.3 pH值測定

稱取5 g（精確到0.01 g）蝦醬樣品，加蒸餾水至50 mL，16 000 r/min均質(zhì)1 min，浸漬30 min，取能浸沒pH計(jì)電極的液體在100 mL燒杯中。將電極插入試樣中，待讀數(shù)穩(wěn)定后，進(jìn)行讀數(shù)，每種樣品重復(fù)3 次[16]。

1.3.2.4 揮發(fā)性鹽基氮測定

根據(jù)GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量凱氏定氮法[17]。

1.3.2.5 水分的測定

采用直接干燥法測定。

1.3.2.6 含鹽量的測定

根據(jù)SC/T 3011—2001《水產(chǎn)品中鹽分的測定》中的直接滴定法測定[18]。

1.3.2.7 生物胺的測定

用高效液相色譜法測定蝦醬中生物胺的含量，色譜柱為WondaSil C18（4.6 mm×250 mm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1 moL/L乙酸銨，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，紫外檢測器波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。采用梯度洗脫程序，洗脫程序參照李大偉等[19]的方法。

1.3.3 微生物多樣性分析

1.3.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取方法參考李文亞等[20]的方法，使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌使用ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）在ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃終延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。

PCR體系：5×FastPfuBuffer緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足雙蒸水至20 μL。每個樣本3 個重復(fù)[21]。

1.3.3.2 Illumina MiSeq測序和數(shù)據(jù)處理

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化參考文獻(xiàn)[22]，純化后用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量，按照樣品的測序要求，按照相應(yīng)比例混合。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫。用Trimmomatic軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH（version1.2.11）軟件進(jìn)行拼接，得到優(yōu)質(zhì)的Tags數(shù)據(jù)。使用的Uparse（version7.0.1090）以97%的相似度對序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類鑒定并剔除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列。利用RDP classifier對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，并基于Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋[23]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個理化指標(biāo)都進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將得到的數(shù)據(jù)用Origin 2018處理；高通量測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性分析均使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行，樣品的α多樣性指數(shù)用Mothur（version1.30.2）計(jì)算，隨后使用R軟件（version 3.3.1）可視化樣品間Venn圖、稀釋曲線圖、環(huán)境因子相關(guān)性分析和優(yōu)勢屬的堆疊柱狀圖；利用LEfSe進(jìn)行物種差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化

圖1 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化Fig. 1 Changes in physicochemical indexes of low-salt shrimp paste during fermentation

由圖1可知，蝦醬發(fā)酵pH值、丙二醛含量、揮發(fā)性鹽基氮含量、氨基酸態(tài)氮含量、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、含鹽量變化范圍分別為7.19～6.90、3.09～5.56 mg/kg、44.81～175.05 mg/100 g、1.42～1.63 g/100 g、59.19%～62.40%、11.02%～12.04%。蝦醬發(fā)酵是一個受多種因素影響的過程。由圖1A可見，pH值在發(fā)酵前期上升，可能是由于鹽含量低，大多數(shù)微生物活性不會受到抑制，蛋白質(zhì)分解導(dǎo)致氨類物質(zhì)的產(chǎn)生[24]。發(fā)酵第34天pH值降低到6.90，隨后基本穩(wěn)定在6.90～6.94之間，這與Cai Luyun等[25]研究的低鹽蝦醬中pH值變化結(jié)果類似，但是低于吳小禾等[16]研究的黃驊傳統(tǒng)蝦醬。蝦醬通常含有高含量的多不飽和脂肪酸，這些脂肪酸容易氧化。在發(fā)酵過程中，丙二醛含量從發(fā)酵初期（D0）3.09 mg/kg升高到（D64）5.56 mg/kg，在發(fā)酵中后期（D145）逐漸降低至3.68 mg/kg。蝦醬中丙二醛含量的變化可能是由于發(fā)酵過程中脂肪的氧化和初級氧化產(chǎn)物的降解造成[26]，這與Cai Luyun等[25]研究的低鹽蝦醬理化指標(biāo)變化趨勢相同，但高于Li Wenya等[27]研究的黃驊傳統(tǒng)蝦醬，這可能也是低鹽蝦醬相較于傳統(tǒng)蝦醬貨架期短的原因。氨基酸態(tài)氮在低鹽蝦醬發(fā)酵前期呈上升趨勢，在發(fā)酵第64天基本穩(wěn)定在1.57 g/100 g，高于Li Wenya等[27]研究的黃驊傳統(tǒng)蝦醬。這表明，相較于傳統(tǒng)發(fā)酵而言，低鹽蝦醬的蛋白質(zhì)分解更加充分。發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮呈上升趨勢，發(fā)酵第128天達(dá)到最高值175.05 mg/100 g，低于Sang Xue等[10]研究的盤錦地區(qū)工廠生產(chǎn)的傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬，可能是由于本研究中生產(chǎn)季節(jié)處在冬、春低溫條件下，不易發(fā)生腐敗變質(zhì)。

本研究的蝦醬樣品在發(fā)酵過程中含鹽量范圍在12.12%～11.72%之間，低于謝主蘭等[28]采用低鹽技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)的蝦醬，其含鹽量為15%～18%，相較之下，更符合低鹽發(fā)酵的要求。蝦醬發(fā)酵過程中，發(fā)酵前中期，蝦醬水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從62.40%下降至59.19%（第34天），之后基本保持穩(wěn)定（約59%），符合我國蝦醬行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于60%的要求。發(fā)酵后期，水分含量發(fā)生小幅度增加，可能是由于隨著春季的到來，空氣的相對濕度增加，導(dǎo)致蝦醬吸收了少量環(huán)境中的水蒸氣。

2.2 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中的生物胺變化

生物胺是蝦醬中氨基酸在氨基脫羧酶的作用下產(chǎn)生的小分子含氮物質(zhì)，含量過高會影響蝦醬的安全性[29]。對蝦醬樣品進(jìn)行了8種生物胺的測定，分別是色胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺。如圖2所示，共檢測出4種生物胺：色胺、苯乙胺、組胺和酪胺，與Li Wenya等[27]研究的黃驊市售蝦醬中主要生物胺結(jié)果相似。其中，組胺是一種對人體健康有害的化合物[30]。蝦醬樣品中的組胺在第145天含量達(dá)到最高（4.27 mg/kg），但仍遠(yuǎn)低于我國限量標(biāo)準(zhǔn)200 mg/kg。在發(fā)酵過程中，4種生物胺的含量及總量整體呈上升趨勢，生物胺含量范圍0～113.29 mg/kg。在發(fā)酵第100天時，生物胺含量發(fā)生降低，這可能是由于生物胺產(chǎn)生菌的生長繁殖受到抑制，脫羧酶活性降低，生物胺降解菌的生長繁殖增快，導(dǎo)致生物胺含量變化發(fā)生波動。結(jié)合氨基酸態(tài)氮含量變化（圖1C），后續(xù)生產(chǎn)加工中，或許可以考慮縮短發(fā)酵時間。

圖2 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中生物胺變化Fig. 2 Changes in biogenic amines contents in low-salt shrimp paste during fermentation

2.3 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中的細(xì)菌多樣性分析

2.3.1α多樣性分析

表2 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性Table 2 Bacterial diversity in low-salt shrimp paste during fermentation

低鹽蝦醬細(xì)菌群落的豐富度、多樣性和覆蓋率見表2。Simpson指數(shù)和Shanno指數(shù)常用于表征群落物種多樣性，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)是分析物種豐富度的指數(shù)[31]。發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)明顯下降趨勢，在發(fā)酵中后期，細(xì)菌群落的多樣性和豐富度明顯減少。覆蓋率是反映群落覆蓋率的指數(shù)，細(xì)菌群落的覆蓋率均大于0.99，且基于OTU水平的稀釋曲線（圖3A）表明測序結(jié)果獲得的數(shù)據(jù)足夠可靠，足夠支撐后續(xù)的數(shù)據(jù)分析[32]。

細(xì)菌群落上共獲得572 842 條有效序列，30 838 個OTU。由圖3B可見，不同發(fā)酵階段都有其特有的微生物，其中，蝦醬樣品在發(fā)酵前期的細(xì)菌群落獨(dú)有的OTU最多，為443，3 個階段共有的OTU為61，說明細(xì)菌群落的組成相似度較高。

圖3 低鹽蝦醬不同發(fā)酵時期的細(xì)菌稀釋曲線（A）和Venn圖（B）Fig. 3 Bacterial rarefaction curve (A) and Venn diagram (B) of low-salt shrimp paste at different fermentation periods

2.3.2 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的演替分析

圖4 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵時期的細(xì)菌群落組成Fig. 4 Bacterial community composition of low-salt shrimp paste in different fermentation periods

如圖4A所示，在細(xì)菌群落門水平上，檢測出5 個優(yōu)勢菌門（相對豐度＞1%），分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、螺旋菌門（Spirochaetota）。厚壁菌門在整個發(fā)酵過程中一直都是優(yōu)勢菌屬，與Li Wenya等[27]研究的黃驊傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中主要優(yōu)勢菌門是厚壁菌門的結(jié)果相類似。在發(fā)酵中后期，D34（99.10%）、D64（98.68%）、D100（99.20%）、D128（99.35%）、D145（97.84%）厚壁菌門的相對豐度都達(dá)到95%以上，在整個發(fā)酵群落中占絕對優(yōu)勢。

如圖4B所示，在細(xì)菌屬水平上，鑒定出5 個優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞5%），四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、Christensenellaceae_R-7_group、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和UCG-005。四聯(lián)球菌屬在發(fā)酵后期的平均相對豐度達(dá)到了98%，與Yao Yunping等[33]研究的北塘蝦醬中的優(yōu)勢菌屬相同，但本研究中并未發(fā)現(xiàn)泰式傳統(tǒng)蝦醬[34]中的優(yōu)勢菌屬Salimicrobium。Christensenellaceae_R-7 group和UCG-005都是常見的腸道微生物，鏈球菌屬和乳酸桿菌屬都是常見的乳酸菌。四聯(lián)球菌屬是豆醬[35]、腐乳[36]、魚露[37]等發(fā)酵食品中常見的優(yōu)勢菌屬，可能與有機(jī)酸、氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)，同時發(fā)酵的低氧環(huán)境有利于四聯(lián)球菌的生長[38]。Sang Xue等[39]研究發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌可作為蝦醬發(fā)酵的潛在發(fā)酵劑。Udomsil等[40]采用嗜鹽四聯(lián)球菌作為發(fā)酵劑，從而改善鹽發(fā)酵鳀魚醬的風(fēng)味。

圖5 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵時期細(xì)菌OTU水平上的PCAFig. 5 PCA plot of bacterial OTU levels of low-salt shrimp paste in different fermentation periods

樣品細(xì)菌群落在OTU水平上主成分分析（principal component analysis，PCA）（圖5）表明，細(xì)菌的PCA得分圖顯示PC1和PC2的方差分別為97.6%和2.37%，發(fā)酵中后期樣品明顯聚集，說明到發(fā)酵中后期的細(xì)菌群落基本保持穩(wěn)定。

2.3.3 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵階段的差異細(xì)菌菌群分析

采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)對發(fā)酵不同階段細(xì)菌屬上的差異菌群比較分析，由圖6可見，除四聯(lián)球菌屬外，鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和紅球菌屬（Rhodococcus）都是發(fā)酵前期與發(fā)酵中后期的主要差異菌屬。鏈球菌屬和乳酸桿菌屬都屬于乳酸菌，常作為添加劑改善發(fā)酵食品品質(zhì)，如Prihantoab等[41]利用植物乳桿菌改善印尼蝦醬的感官特性。紅球菌屬是一種廣泛存在于環(huán)境當(dāng)中的微生物。也是高產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的微生物[42]，邱楚雯等[43]發(fā)現(xiàn)在蝦腸道以及養(yǎng)殖環(huán)境中的優(yōu)勢菌屬是紅菌屬。在本研究中，紅球菌可能是蝦體及環(huán)境內(nèi)存在的微生物。

圖6 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵階段的差異菌屬Fig. 6 Differential bacterial genera in low-salt shrimp paste during different fermentation stages

2.4 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中真菌多樣性分析

2.4.1 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中真菌的α多樣性分析

表3 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中真菌多樣性Table 3 Fungal diversity in low-salt shrimp paste during fermentation

低鹽蝦醬群落的豐富度、多樣性和覆蓋率見表3。真菌群落上所有序列在97%的相似水平下進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)分析，共獲得533 300 條有效序列，42 696 個OTU。與細(xì)菌群落相比，低鹽蝦醬中真菌群落多樣性下降趨勢緩慢。各個發(fā)酵階段的豐富度都低于細(xì)菌群落，其中，發(fā)酵前期的真菌多樣性小于細(xì)菌多樣性，到發(fā)酵中后期，真菌群落多樣性大于細(xì)菌群落，且下降趨勢緩慢。真菌群落的覆蓋率均大于0.99，且基于OTU水平上的稀釋曲線（圖7A），表明測序結(jié)果獲得的數(shù)據(jù)是足夠可靠的，足以支撐后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。真菌群落Venn圖（圖7B）顯示，發(fā)酵前期的OTU最多，為115，3 個階段共有的OTU為10，表明3 個階段的真菌群落組成相似度不高。

圖7 低鹽蝦醬不同發(fā)酵時期真菌稀釋曲線（A）和Venn圖（B）Fig. 7 Fungal rarefaction curve (A) and Venn diagram (B) of low-salt shrimp paste during different fermentation periods

2.4.2 低鹽蝦醬發(fā)酵過程中真菌群落的演替分析

圖8 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵時期真菌群落的組成Fig. 8 Fungal community composition of low-salt shrimp paste during different fermentation periods

由圖8A可見，對發(fā)酵過程中蝦醬樣品的真菌群落組成進(jìn)行分析，鑒定出6 個主要菌門（相對豐度＞1%），即子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）和unclassified_k__Fungi，與Sang Xue等[10]研究的環(huán)渤海地區(qū)蝦醬的主要真菌門類似，蝦醬在發(fā)酵過程中，擔(dān)子菌門的相對豐度逐漸由85.64%減少到3.13%。子囊菌門的相對豐度由D0的12.87%增加到了D145的95.73%，這與張皓[44]研究南美白對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的優(yōu)勢菌門相同。

在屬水平上，共鑒定出13 個主要菌屬（相對豐度＞5%），包括假絲酵母菌屬（Candida）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、酵母菌屬（Saccharomyces）、鏈格孢菌（Alternaria）、Cutaneotrichosporon、Tausonia、unclassified_k__Fungi、Apiotrichum、油壺菌屬（Olpidium）、枝孢屬（Cladosporium）、帚枝霉屬（Sarocladium）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和Hannaella。發(fā)酵前期以絲孢酵母屬為優(yōu)勢菌屬，到發(fā)酵中期，假絲酵母菌屬和鏈格孢菌成為優(yōu)勢菌屬，發(fā)酵后期階段，假絲酵母菌屬成為優(yōu)勢菌屬。發(fā)酵過程中，酵母菌類都是主要優(yōu)勢菌屬，酵母菌不僅有助于產(chǎn)品風(fēng)味的形成，還有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的代謝產(chǎn)物有利于乳酸菌的生長[45]，后續(xù)研究可以綜合代謝組學(xué)探究蝦醬發(fā)酵過程中代謝通路。

圖9 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵時期真菌OTU水平上的PCAFig. 9 PCA plot of fungal OTU levels of low-salt shrimp paste during different fermentation periods

樣品在真菌群落OTU水平上PCA（圖9）表明，PC1和PC2的方差分別為90.47%和8.56%，且3 個階段的樣品能分離開，表明發(fā)酵不同階段的真菌群落有類似性。

2.4.3 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵階段差異的真菌菌群分析

如圖10所示，對發(fā)酵不同階段真菌屬上的差異菌群比較分析，整體而言，真菌群落相對豐度差異不顯著，但是，絲孢酵母屬（Trichosporon）和酵母屬（Saccharomyces）在不同發(fā)酵階段差異較明顯。Wei Guanmian等[46]發(fā)現(xiàn)，腐乳中的絲孢酵母屬與多種醇類風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，絲孢酵母屬可能是發(fā)酵前期醇類風(fēng)味物質(zhì)形成的主要微生物。酵母屬能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，常用作發(fā)酵劑添加到食品中。Gao Pei等[47]將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）31菌株作為發(fā)酵劑添加到酸魚中，發(fā)現(xiàn)該菌株能促進(jìn)酸魚中脂肪分解和氧化，促進(jìn)酸魚中風(fēng)味的形成。因此，發(fā)酵后期，蝦醬風(fēng)味的形成可能與酵母屬有關(guān)。

圖10 低鹽蝦醬在不同發(fā)酵階段的差異菌屬Fig. 10 Differential fungal genera in low-salt shrimp paste during different fermentation stages

2.5 低鹽蝦醬中優(yōu)勢菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過Spearman相關(guān)性分析評估細(xì)菌群落和真菌群落的優(yōu)勢菌屬與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。

2.5.1 優(yōu)勢細(xì)菌菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性

由圖11可見，理化指標(biāo)和細(xì)菌群落中的大多數(shù)優(yōu)勢菌屬都表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性。揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮、丙二醛和生物胺和四聯(lián)球菌均呈正相關(guān)，與其他優(yōu)勢菌屬均呈負(fù)相關(guān)。有研究表明，乳酸菌和四聯(lián)球菌是主要的產(chǎn)生生物胺的微生物[48-50]。本研究中，鏈球菌與生物胺呈顯著負(fù)相關(guān)（r=－0.72；P=0.04），但四聯(lián)球菌和其他乳酸菌屬并沒有與生物胺表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。在復(fù)雜的發(fā)酵系統(tǒng)中，某一菌株產(chǎn)生生物胺的能力不僅受到環(huán)境的影響，也可能會受到其他微生物的作用，使它們無法在發(fā)酵過程中發(fā)揮作用。

圖11 低鹽蝦醬中優(yōu)勢細(xì)菌菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性Fig. 11 Correlation analysis between dominant bacteria and physicochemical properties

2.5.2 優(yōu)勢真菌菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性

圖12 低鹽蝦醬中優(yōu)勢真菌菌屬水平與理化指標(biāo)的相關(guān)性Fig. 12 Correlation analysis between dominant fungi and physicochemical properties

真菌群落與理化指標(biāo)相關(guān)性熱圖（圖12）與細(xì)菌群落（圖11）相比，細(xì)菌群落的相關(guān)性熱圖顏色更深，說明細(xì)菌群落與蝦醬發(fā)酵過程的理化指標(biāo)變化相關(guān)性更強(qiáng)。真菌群落中只有幾個菌屬與理化指標(biāo)呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性，其中，Purpureocillium與揮發(fā)性鹽基氮表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（r=0.91，P=0.000 76），與生物胺呈顯著正相關(guān)（r=0.82，P=0.006 73），表明Purpureocillium可能與生物胺的產(chǎn)生有關(guān)，這在之前的研究中鮮見報道，需要深入地研究。

3 結(jié) 論

采用高通量測序技術(shù)對商品化低鹽蝦醬微生物群落進(jìn)行探究，群落演替分析結(jié)果表明，在細(xì)菌門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和螺旋菌門為主要優(yōu)勢菌門，在細(xì)菌屬水平上，四聯(lián)球菌屬、鏈球菌屬和乳酸桿菌屬為主要優(yōu)勢菌屬。四聯(lián)球菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和紅球菌屬為3 個發(fā)酵階段的差異菌屬。在真菌門水平上，子囊菌門、擔(dān)子菌門、油壺菌門、被孢霉門和羅茲菌門為主要優(yōu)勢菌門，在真菌屬水平上，主要優(yōu)勢菌屬為假絲酵母菌屬、絲孢酵母屬、酵母菌屬和鏈格孢菌，且真菌屬在3 個階段上并無顯著差異。通過Spearman分析了商品化低鹽蝦醬發(fā)酵期間細(xì)菌群落與主要理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。理化指標(biāo)和細(xì)菌群落中的大多數(shù)優(yōu)勢菌屬都表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮、丙二醛和生物胺和四聯(lián)球菌均呈正相關(guān)，與其他優(yōu)勢細(xì)菌屬均呈負(fù)相關(guān)，除揮發(fā)性鹽基氮與Purpureocillium表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)，其他理化指標(biāo)與真菌屬的相關(guān)性較弱。在發(fā)酵第64天時，理化指標(biāo)和細(xì)菌群落基本保持穩(wěn)定，工廠加工可考慮縮短蝦醬發(fā)酵時間。目前，低鹽發(fā)酵蝦醬中微生物的代謝機(jī)制尚不明確。在以后的研究中，可以綜合利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)手段探究蝦醬的代謝機(jī)制，挖掘影響蝦醬中產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的功能性菌株。本研究結(jié)果為改良商品化低鹽蝦醬生產(chǎn)工藝提供了理論支持。