劉蘭香，李 想,2，唐保山，譚 瑞,2，徐 涓，馬金菊，張 弘,*

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，國家林業(yè)和草原局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650233；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

鐵是各種生物所必需的微量元素之一，幾乎每一個生化過程中都需要，包括細(xì)胞呼吸、細(xì)胞增殖、攜帶氧分子的生物合成、核酸的合成和修復(fù)以及作為許多其他酶反應(yīng)的輔助因子[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏鐵會導(dǎo)致多種癥狀貧血[2-4]，同時會引起哺乳動物的神經(jīng)發(fā)育遲緩和認(rèn)知缺陷[5]，也可能引起局部的病理損傷等[6]。通過食物攝入是補(bǔ)充每日所需微量元素鐵的最簡單而有效的方式，例如，人們頗為喜愛的食物蘑菇中就富含鐵元素。然而，鐵同時具有神經(jīng)毒性作用，鐵累積會產(chǎn)生活性氧從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。因此，對食物進(jìn)行微量鐵元素檢測，對于每日合理膳食具有重要的指導(dǎo)意義。目前，電感耦合離子質(zhì)譜法[7]、電化學(xué)分析法[8]、火焰原子吸收法[9-10]等多種檢測方法可以實現(xiàn)食物中微量鐵元素的檢測[11]，這些方法具有靈敏度高、檢測限低、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點，但是存在儀器設(shè)備昂貴、測試成本高的問題。近年來，基于熒光傳感器的分析方法因其具有較高的選擇性和穩(wěn)定性，且操作簡單、分析迅速而受到廣泛的關(guān)注。

胭脂蟲紅酸是天然染料胭脂蟲紅色素的主要成分，其結(jié)構(gòu)中包含1 個α-糖苷基團(tuán)和1 個多羥基蒽醌結(jié)構(gòu)（圖1），被廣泛用于食品、藥品以及高端化妝品等領(lǐng)域[12-14]。胭脂蟲紅酸中在水、甲醇、丙酮等溶劑中可發(fā)射波長約為600 nm的紅色熒光，在金屬離子檢測、生物蛋白識別、農(nóng)殘檢測等方面具有較大的應(yīng)用潛力[15-19]。然而，以胭脂蟲紅酸為熒光傳感器用于分析檢測，存在熒光強(qiáng)度低和靈敏度有待提高等問題，從而限制其實際應(yīng)用。據(jù)報道，芳香族化合物中加入合適的氧化劑在高溫高壓的條件下會發(fā)生脫氫氧化以及脫水縮合反應(yīng)，得到具有更大共軛程度的π-π結(jié)構(gòu)且熒光性能更優(yōu)異的物質(zhì)，從而提高其作為熒光傳感器的靈敏度而應(yīng)用于熒光分析檢測[20-22]。

本研究以胭脂蟲紅酸為原料，高碘酸鉀為氧化劑，通過乙醇/水共混熱溶劑法制備氧化胭脂蟲紅酸（oxidized carminic acid，OCA），然后對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和應(yīng)用，期望將熒光性能優(yōu)異的OCA開發(fā)為熒光傳感器用于蘑菇中金屬離子的檢測，進(jìn)一步拓展天然色素胭脂蟲紅酸在熒光分析檢測方面的應(yīng)用。

圖1 胭脂蟲紅酸的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of carminic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇、白菇和杏鮑菇購買于本地超市。

胭脂蟲紅酸（純度≥95%）由中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所提取和純化；高碘酸鉀 美國Adamas公司；羅丹明B、氯化鈉、亞硝酸鈉、氯化鐵等無機(jī)鹽（均為分析純） 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙醇（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；實驗室用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S型精密型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；C-MAGHS-7型磁力攪拌器 德國IKA公司；KOFD1-10/3高壓反應(yīng)釜 煙臺招遠(yuǎn)松嶺儀器設(shè)備有限公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；UV-4802S紫外-可見分光光度計（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）尤尼柯上海儀器有限公司；TENSON27型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)T-IR）儀 德國布魯克光譜儀器有限公司；ST20PH測試筆 奧豪斯儀器有限公司；Nano ZS90動態(tài)光散射儀（dynamic light scattering，DLS） 英國Malvern儀器有限公司；Scientific K-Alpha X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國Thermo公司；Tecnai G2 F20透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 OCA制備

準(zhǔn)確稱取5.0 mg胭脂蟲紅酸于燒杯中，加入6 mL去離子水使其充分溶解后將溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，并用15.0 mL乙醇洗滌燒杯并轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜，然后加入30.0 mg高碘酸鉀，將混合溶液密閉后在180 ℃條件下于馬弗爐中反應(yīng)1 h。待反應(yīng)混合溶液自然冷卻至室溫經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾，所得濾液即為OCA。

1.3.2 熒光量子產(chǎn)率測定

以熒光量子產(chǎn)率為89%的羅丹明B作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，通過測定OCA溶液和羅丹明B溶液在波長336 nm下的熒光發(fā)射峰的面積和對該波長光的吸光度，按式（1）計算熒光量子產(chǎn)率[20]：

式中：Ф、S、A分別為OCA的熒光量子產(chǎn)率、熒光發(fā)射峰面積及吸光度；ФR、SR和AR分別指參比物羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率、熒光發(fā)射峰面積及吸光度；η為乙醇/水混合溶劑的折射率1.362 1；ηR為溶劑水的折射率1.332 5。

1.3.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 FT-IR測定

將15 mL OCA溶液經(jīng)80 ℃減壓蒸餾2 h，得到干燥的OCA固體粉末。然后，采用溴化鉀壓片法分別將干燥的OCA和原料胭脂蟲紅酸與溴化鉀混合壓片進(jìn)行測試，掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。

1.3.3.2 XPS測定

OCA測試用的靶材為Al，Kα，X射線束能為100 W，測試光柵直徑為100 mm，光斑為400 μm。數(shù)據(jù)分析時，以C1s吸附碳C—C/C—H結(jié)合能284.8 eV對所有譜峰進(jìn)行校準(zhǔn)，使用Avantage軟件對XPS數(shù)據(jù)進(jìn)行分峰擬合。

1.3.3.3 TEM測定

樣品測試點分辨率為0.24 nm，信息分辨率為0.14 nm，最高加速電壓為200 kV。

1.3.4 環(huán)境pH值對OCA熒光性能的影響

分別配制pH 3、5、9、11和13的鹽酸和氫氧化鈉溶液，考察不同pH值溶液對OCA熒光性能的影響。測試時，取1.0 mL不同pH值的溶液與3.0 mL OCA溶液混合15 min，然后超聲15 min后在激發(fā)波長為336 nm，光電倍增管電壓（photomultiplier tube，PMT）為700 V的條件下檢測溶液的熒光性能。

1.3.5 離子對OCA熒光性能的影響

準(zhǔn)確配制濃度均為1.0 mmol/L的氯化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鈉、醋酸鈉、亞硫酸鈉、硫酸鈉、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、草酸鈉、磷酸二氫鈉溶液共10種陰離子不同的溶液；氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、氯化亞銅、氯化銅、氯化鋇、二氯化汞、氯化鋅、氯化鎂、氯化鈣、氯化鎳、氯化錳、氯化鉛、氯化亞鐵、氯化鐵、氯化鋁和氯化鉻17種常見的金屬氯鹽溶液。然后，分別準(zhǔn)確量取1.0 mL鹽溶液與3.0 mL OCA溶液混合并超聲15 min；同時設(shè)置添加1.0 mL的去離子水的樣品為空白樣，將所得樣品在PMT為700 V，激發(fā)波長為336 nm條件下進(jìn)行熒光檢測，考察不同陰離子和陽離子對OCA熒光性能的影響。

1.3.6 抗干擾性實驗

將4.0 mL OCA溶液和1.0 mL濃度為1.0 mmol/L的氯化鐵溶液混合，然后分別加入1.0 mL濃度為1.0 mmol/L的其他金屬離子溶液，混合15 min后再超聲15 min，然后在PMT為700 V、激發(fā)波長為336 nm條件下測定溶液的最大熒光強(qiáng)度，同時設(shè)置空白對照。

1.3.7 OCA檢測Fe3+的工作曲線

準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為56.0 mg/L的FeCl3儲備液，然后逐級稀釋至質(zhì)量濃度分別為11.2、22.4、33.6 mg/L和44.8 mg/L。測試時，分別準(zhǔn)確量取1.0 mL不同濃度的Fe3+溶液與3.0 mL OCA溶液混合均勻15 min后再超聲15 min，然后將混合液在激發(fā)波長為336 nm，PMT為700 V條件下進(jìn)行熒光檢測。記錄被檢測樣品位于發(fā)射波長380～620 nm區(qū)間的熒光發(fā)射峰積分面積為S，空白樣品為S0。最后，以Fe3+的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，（S0-S）/S0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.8 OCA檢測Fe3+的應(yīng)用

將新鮮的香菇、白菇和杏鮑菇分別置于組織研磨機(jī)進(jìn)行粉碎后在105 ℃條件下干燥1 h，然后分別準(zhǔn)確稱取50.0 mg樣品置于消化管中，加入2.0 mL硝酸放置1 h，然后進(jìn)行熱消解。待樣品消解完全后將酸除盡，冷卻后加入10.0 mL水，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶然后用去離子水定容，得香菇（A）、白菇（B1）和杏鮑菇（C1）溶液，將香菇溶液稀釋5、3 倍和2 倍，即得香菇供試品溶液A1、A2和A3；白菇和杏鮑菇溶液分別稀釋2 倍和3 倍，即得白菇供試品溶液B2、B3和杏鮑菇供試品溶液C2、C3。熒光方法檢測時，將1.0 mL供試品溶液與3.0 mL OCA熒光傳感器溶液混合，按照1.3.7節(jié)的方法進(jìn)行熒光檢測。同時，所有供試品溶液進(jìn)行ICP-MS檢測，以驗證熒光方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OCA的表征

2.1.1 FT-IR分析

圖2 胭脂蟲紅酸和OCA的FT-IR光譜Fig. 2 FT-IR spectra of CA and OCA

如圖2所示，F(xiàn)T-IR光譜顯示，原料胭脂蟲紅酸其在3 400 ～2 500 cm-1范圍內(nèi)有一個寬而強(qiáng)的羥基（—O—H）引起的伸縮振動吸收峰，這是由于其分子結(jié)構(gòu)中含有α-糖苷基團(tuán)；而其氧化產(chǎn)物OCA在3 372 cm-1處的O—H伸縮振動吸收峰明顯變?nèi)踝冋f明與胭脂蟲紅酸相比，OCA結(jié)構(gòu)中的—OH數(shù)目減少；同時，OCA在2 921 cm-1和2 858 cm-1處的甲基或亞甲基的C—H的伸縮振動吸收峰明顯增強(qiáng)；OCA在1 731 cm-1的吸收峰是典型的C＝O伸縮振動，1 196 cm-1和1 100 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別是由C—O—C引起的伸縮振動和彎曲振動，說明OCA中可能含有羰基和酯基，而胭脂蟲紅酸在1 717 cm-1處的C＝O吸收峰是其分子中的羰基和羧基引起的伸縮振動。此外，OCA在1 594 cm-1處的吸收峰是芳香族化合物C＝C的典型伸縮振動，1 373 cm-1和1 337 cm-1處是C—H的伸縮振動，886 cm-1和770 cm-1是芳香族化合物C—H的伸縮振動吸收峰。FT-IR光譜分析結(jié)果表明OCA結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)、羥基、羰基和酯基等基團(tuán)[23-24]。

2.1.2 XPS分析

如圖3所示，胭脂蟲紅酸基OCA的XPS圖顯示其在283.6 eV和532.2 eV處分別有C1s和O1s的特征峰，說明OCA主要由C和O元素組成；而在620.5 eV和630.0 eV處有碘元素的3d5和3d3特征峰，這可能是氧化劑高碘酸鉀的無機(jī)還原產(chǎn)物摻雜在OCA引起的。C1s分峰擬合表明存在C—C/C—H（284.82 eV）、C—O（286.54 eV）和C＝O（288.81 eV），O1s分峰擬合表明存在C＝O（532.40 eV）和C—O（533.49 eV）。XPS鑒定的OCA組分與FT-IR結(jié)果一致，表明OCA的結(jié)構(gòu)具有芳香族化合物的結(jié)構(gòu)，其表面含有羰基、酯基和羥基等官能團(tuán)，可為金屬離子或者小分子的識別提供位點[25-26]。

圖3 OCA的XPS（A）及C1s（B）、O1s（C）的XPS擬合分峰圖Fig. 3 XPS spectra of OCA and fitted curves of peaks C1s and O1s

2.1.3 TEM和DLS分析

如圖4所示，TEM和DLS測試結(jié)果表明OCA呈橢圓形球狀的納米顆粒，粒子分布較為均一，這些微粒的平均粒徑約為（7.5±1.3）nm。這是因為胭脂蟲紅酸分子結(jié)構(gòu)中含有α-糖苷和多羥基蒽醌基團(tuán)，在強(qiáng)氧化劑高碘酸鉀的作用下，分子中的鄰二羥基的碳碳鍵斷裂，醇羥基轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛、酮和羧酸；進(jìn)一步，在高溫高壓條件下，醛、酮、羧酸基團(tuán)脫水縮合并聚合形成納米顆粒，即目標(biāo)產(chǎn)物OCA[21-22]。

圖4 OCA的TEM和粒徑分布圖Fig. 4 TEM and particle size distribution of OCA

2.2 OCA的光學(xué)性質(zhì)

如圖5所示，UV-vis光譜顯示OCA的最大吸收峰位于225 nm處，這可能歸因于其表面官能團(tuán)的n→π*躍遷。熒光測試結(jié)果表明，OCA的熒光最大激發(fā)波長（λEx）和最大發(fā)射波長（λEm）分別位于336 nm和445 nm處；在最大發(fā)射波長處，OCA的熒光強(qiáng)度為8 989，在室內(nèi)自然光下，OCA呈淺黃色溶液，在365 nm光照射下發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。以熒光產(chǎn)率為89%的羅丹明B作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，測得OCA的熒光量子產(chǎn)率為5.2%。

圖5 OCA的光學(xué)性質(zhì)Fig. 5 Optical properties of OCA

2.3 環(huán)境pH值對OCA熒光性能的影響

圖6 環(huán)境pH值對I-CDs熒光性能的影響Fig. 6 Effect of pH on fluorescence intensity of I-CDs

如圖6所示，與空白對照組（pH 7）相比，OCA在酸性環(huán)境下熒光發(fā)射的最大波長均為445 nm左右，發(fā)射范圍位于380～620 nm區(qū)間，且熒光強(qiáng)度稍有增強(qiáng)；然而，當(dāng)其在pH值大于9的堿性環(huán)境中，熒光強(qiáng)度顯著降低，熒光發(fā)射峰寬度明顯縮小且發(fā)射范圍減小至390～605 nm區(qū)間。OCA在不同pH值環(huán)境中呈現(xiàn)的熒光差異可能是由于其表面有大量酚羥基，該基團(tuán)在酸性溶液中不會電離，但是在堿性溶液中容易電離導(dǎo)致電荷的分布改變而影響其共軛結(jié)構(gòu)，致使其熒光減弱[27]，因此，當(dāng)以O(shè)CA為熒光傳感器用于檢測時使用的pH值范圍應(yīng)控制在1～9之間。

2.4 陰離子對OCA熒光的影響

如圖7所示，與空白組相比，所考察的10種常見陰離子對OCA溶液的熒光強(qiáng)度沒有明顯改變，說明OCA在不同陰離子溶液中穩(wěn)定性良好。

圖7 陰離子對OCA熒光性能的影響（各陰離子濃度均為1.0 mmol/L）Fig. 7 Effect of anions on fluorescence intensity of OCA (at anion concentration of 1.0 mmol/L)

2.5 OCA對鐵離子（Fe3+）的選擇性

圖8 OCA對Fe3+離子的選擇性（各陽離子濃度均為1.0 mmol/L）Fig. 8 Selectivity of OCA toward iron ions (at cation concentration of 1.0 mmol/L)

如圖8所示，考察蘑菇中常見的17種陽離子對OCA熒光的影響，結(jié)果表明，除Fe3+加入后溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低外，其他陽離子均未能使OCA的熒光發(fā)生明顯的改變，說明所合成的OCA對Fe3+離子具有較高的選擇性[27]。這可能是因為Fe3+離子與OCA的表面酚羥基絡(luò)合，在光照條件下二者發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，OCA表面的電子云密度發(fā)生變化從而導(dǎo)致其熒光減弱，且這種減弱趨勢與Fe3+濃度有關(guān)，因此，OCA對Fe3+具有選擇性。

為了進(jìn)一步考察其他金屬離子對Fe3+的干擾作用，進(jìn)行抗干擾實驗。如圖9所示，與空白樣相比，在含有Fe3+的OCA溶液中加入其他金屬離子時并未明顯改變體系的熒光強(qiáng)度，說明OCA對Fe3+選擇性識別的抗干擾性較強(qiáng)，具有開發(fā)成為熒光傳感器用于檢測Fe3+的潛在應(yīng)用。

圖9 其他金屬離子對OCA識別Fe3+的影響（各金屬離子濃度均為1.0 mmol/L）Fig. 9 Effects of other metal ions at a concentration of 1.0 mmol/L on iron ion recognition by OCA

如圖10所示，向3.0 mL OCA溶液中加入1.0 mL濃度為1.0 mmol/L的Fe3+溶液，溶液熒光立即減弱，但隨著二者混合作用時間的延長溶液的熒光強(qiáng)度略有增加，當(dāng)反應(yīng)時間至30 min，二者的熒光體系趨于穩(wěn)定，且穩(wěn)定時間超過2 h。因此，當(dāng)以O(shè)CA為熒光傳感器檢測Fe3+時，應(yīng)按照1.3.7節(jié)方法將OCA與被測樣品混合15 min，然后再超聲15 min后再進(jìn)行熒光檢測。

圖10 OCA與Fe3+作用時間對體系熒光強(qiáng)度的影響（PMT為750 V）Fig. 10 Effect of reaction time between OCA and Fe3+ on fluorescence intensity of the system (PMT was 750 V)

2.6 OCA應(yīng)用于Fe3+的檢測

如圖11所示，OCA溶液中加入氯化鐵溶液后熒光強(qiáng)度明顯降低，且隨著Fe3+質(zhì)量濃度增加，OCA的熒光強(qiáng)度逐漸減小，但是最大發(fā)射峰位置沒有發(fā)生改變，說明Fe3+加入后只與OCA表面的基團(tuán)發(fā)生了相互作用而改變電荷分布，但是沒有改變OCA的內(nèi)部共軛結(jié)構(gòu)，因此，可以開發(fā)OCA作為熒光傳感器用于Fe3+的檢測。OCA位于380～620 nm處的熒光發(fā)射峰積分面積減小率與Fe3+質(zhì)量濃度在11.2～56.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.998），對線性擬合可得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程y=0.549x-0.039，檢出限為2.5 mg/L（RSN=3）。

圖11 不同質(zhì)量濃度Fe3+條件下OCA的熒光譜圖Fig. 11 Fluorescence spectra of OCA at different concentrations of Fe3＋

基于Fe3+對OCA熒光減弱作用，采用熒光分析法測定香菇、白菇和杏鮑菇的Fe3+含量。如表1所示，與ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)方法相比較，基于OCA作為熒光傳感器的熒光檢測方法用于實際樣品中Fe3+的檢測，樣品回收率在95.3%～110.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～4.6%之間，表明該方法可用于香菇、白菇和杏鮑菇等蘑菇中Fe3+的含量檢測，方法可靠。

表1 實際樣品中Fe3+的檢測結(jié)果（n=3）Table 1 Results of detection of Fe3+ in real samples (n = 3)

3 結(jié) 論

以胭脂蟲紅酸為原料，高碘酸鉀為氧化劑，在乙醇/水熱法一步合成水溶性的可發(fā)射藍(lán)色熒光的OCA，通FT-IR和XPS分析結(jié)構(gòu)表明OCA結(jié)構(gòu)中含有共軛的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和大量含氧官能團(tuán)；TEM和DLS分析結(jié)果表明OCA的平均粒徑約為7.5 nm。

光學(xué)性質(zhì)測試結(jié)果表明，OCA的熒光最大激發(fā)波長為336 nm，最大發(fā)射波長為445 nm，發(fā)射范圍位于380～620 nm區(qū)間；UV-vis測試結(jié)果顯示其在波長225 nm處有最大吸收峰；當(dāng)以O(shè)CA為熒光傳感器用于檢測時使用的pH值范圍應(yīng)控制在1～9之間，且OCA在不同陰離子溶液中穩(wěn)定性良好。

OCA對Fe3+有良好的選擇性，加入Fe3+會導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度明顯降低，位于380～620 nm區(qū)間的熒光發(fā)射峰積分面積減小率與Fe3+質(zhì)量濃度在11.2～56.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為2.5 mg/L。應(yīng)用結(jié)果表明，基于OCA作為熒光傳感器的熒光檢測方法用于實際樣品中Fe3+的檢測，樣品回收率在95.3%～110.4%之間，RSD在2.3%～4.6%之間，表明該方法可用于香菇、白菇和杏鮑菇等蘑菇中Fe3+的含量檢測，方法可靠。