陳家琛， 陳 鋼，戴嘉豪， 范福金，曹光球 ，曹世江

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福州 350002；3.林木逆境生理生態(tài)及分子生物學(xué)福建省高校重點實驗室，福州 350002； 4.洋口國有林場，福建 順昌 353211)

【研究意義】光不僅是植物生長發(fā)育所必須的環(huán)境因子，而且是光合作用的能源[1]。植物的生長發(fā)育一方面受制于光子通量密度(PFD，Photon flux density)或光量，另一方面也受到不同波長的光即光質(zhì)、光輻射與二者之間不同組分比例的影響?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】太陽光譜大致上可分為紫外光譜(UV<400 nm)、可見光譜即光合有效輻射(PAR，Photosynthetically active radiation，400～700 nm)和紅外光譜(700～800 nm)，由于同溫層(平流層)內(nèi)O3的作用，大部分UV-B以及全部的UV-C無法到達(dá)地球表面，而到達(dá)地球表面的UV-B則因經(jīng)緯度、日時間、季節(jié)變化、云層厚薄和其他環(huán)境因素而有所差異。例如，在自然條件下，照射在植物體上的光譜和光質(zhì)會因天氣而有所差別，陰天環(huán)境下藍(lán)光最多，晴朗天氣或傍晚紅光最多[2]。植物會對生長環(huán)境的光質(zhì)、光照時間長短、光強強弱，光照方向做出微妙反應(yīng)，一旦光照條件發(fā)生變化，植物形態(tài)及光合作用便會產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答，并且不同發(fā)育階段，不同植物的應(yīng)答機理不一致[2-3]。藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅外在調(diào)控植物光合生理和光形態(tài)中處于關(guān)鍵地位。光敏蛋白、隱花素、向光蛋白這些光受體接受光刺激，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起植物細(xì)胞激素水平、基因表達(dá)模式發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)植物物質(zhì)代謝和水分代謝。已有研究證實，藍(lán)光和紅光處理下植物氣孔導(dǎo)度會提高，而綠光則會降低氣孔導(dǎo)度[4],大多數(shù)高等植物光合速率紅光下最高[5]。由于光敏素能感受藍(lán)光和紫外光、隱花素能感受藍(lán)光和UV-A，因而藍(lán)光下植物葉面積增大，有利于葉綠體的發(fā)育[6]?？傊?，不同光質(zhì)或波長的光具有明顯不同的生物學(xué)效應(yīng)，不僅影響到植物萌發(fā)[7]，干物質(zhì)積累和營養(yǎng)器官的生長，還影響葉片衰老[8]、抗逆性、基因表達(dá)[9]等。【本研究切入點】杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.]作為中國特色樹種之一，廣泛種植于長江以南地區(qū)，具備生長快速、高經(jīng)濟價值的特點，應(yīng)用范圍涉及家具、建筑、纖維工業(yè)，同時兼具藥用價值，可做行道樹。目前，對于光質(zhì)的研究主要集中于綠豆[10]、萵筍[11]、青花菜[12]、番茄[13]等農(nóng)作物，研究所得結(jié)果不盡相同，有些甚至得出相反結(jié)論，這可能歸結(jié)于植物種類、光質(zhì)處理方式和植物生長時間的差異。發(fā)光二極管(LED)因其波長專一性、壽命長、發(fā)熱小等特色，為光質(zhì)的選擇提供了新思路[14]。LED光源在作物培育、花卉、水果以及蔬菜等方面廣泛應(yīng)用，對種苗快速生長[15]、產(chǎn)品質(zhì)量提高[16]、觀賞價值提高[17]、果實口感提高[18]均有明顯作用。將LED用于幼苗培育雖有報道，但將LED用于杉木幼苗培育的相關(guān)研究除本課題組外尚未見其他人有相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以杉木幼苗為材料，探尋不同光質(zhì)下杉木幼苗葉綠體超微結(jié)構(gòu)及光合生理特征，為杉木培育提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試杉木幼苗品種為洋口林場無性系020扦插苗，平均苗高21.6 cm，地徑0.53 cm。

1.2 實驗方法

采用LED紅光(WLP=661 mm，F(xiàn)WHM=19.7 nm)、藍(lán)光(WLP=454 mm, FWHM=20.1 nm)及其紅藍(lán)組合光1R1B(R∶B=1∶1)作為光源，共4種處理,即白光(CK)、紅光(R)、藍(lán)光(B)、紅藍(lán)光(R∶B=1∶1)。培養(yǎng)架為鋼質(zhì)結(jié)構(gòu)，光源位于頂部，培養(yǎng)架外層用黑色遮光布遮擋。設(shè)置光強在100～110 μmol/(m2·s)，通過時控開關(guān)控制光照時間為12 h/d(6:00—18:00)，溫度控制為(26±1)℃，濕度控制在65%左右，CO2濃度設(shè)置為大氣濃度。

實驗在福建農(nóng)林大學(xué)田間實驗室展開。杉木幼苗培養(yǎng)基質(zhì)為草炭、珍珠巖、蛭石，體積比為0.46∶0.27∶0.27，將輕基質(zhì)裝入長×寬=55 mm×100 mm的紗布袋并置于塑料托盤，栽種前對基質(zhì)進(jìn)行澆水處理，保持適度濕潤。緩苗2個月后置于LED燈下培養(yǎng)，選取生長健壯，長勢一致的幼苗開展實驗，實驗期間做好幼苗管護。

1.3 測定項目和測定方法

1.3.1 光合參數(shù)的測定 每個處理隨機選取18株長勢均勻的杉木，取頂葉下方第3～4片功能葉，擦拭干凈，每6株葉片測定值的均值為一個重復(fù)，共3個重復(fù)。于晴朗天氣的上午9：00—12：00利用便攜式光合系統(tǒng)(Li-6400XT LI-COR Biosciences American)測定幼苗葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)。

1.3.2 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 上午9：00取第3功能葉片，用剪刀將功能葉剪至小于1 mm3保存至小瓶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定，PBS液漂洗3次(pH=7.2)，2%鋨酸固定2 h之后，50%、70%、90%丙酮脫水，純丙酮包埋。超薄切片機切至50～60 mm后，置于銅網(wǎng)，用染色劑進(jìn)行雙重染色(3%醋酸鈾-檸檬酸鉛)，放入透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit Biotwin FEI USA)觀察拍照。

1.3.3 光合色素測定 光合色素采用80%丙酮法測定

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0，Excel 2019 統(tǒng)計并分析所得實驗數(shù)據(jù)，作圖采取Origin Lab 2021版本；采用最小顯著性差異(LSD)多重比較與方差分析,顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對杉木幼苗光合特征的影響

2.1.1 光質(zhì)對凈光合速率(Pn)的影響 隨著幼苗生長時間增加，葉片Pn表現(xiàn)為先迅速下降而后平緩的變化特點，90 d后各個處理間的差異總體變化不大。不同光質(zhì)處理下Pn最大值均出現(xiàn)在第30天，以R∶B處理最大，達(dá)到3.82 μmol/(m2·s)，分別是W、R、B處理的1.04、1.83、1.71倍。此外，30 d各處理下Pn均顯著高于60、90、120、150、180 d的相同處理(P<0.05)。任一發(fā)育天數(shù)內(nèi)，R處理的杉木幼苗Pn均顯著低于(P<0.05)其他處理。杉木幼苗發(fā)育的30～180 d之內(nèi)，W、R、B、R∶B處理下杉木幼苗Pn分別降低224.77%、173.45%、173.17%、310.75%。杉木幼苗凈光合速率總體表現(xiàn)為：R

2.1.2 光質(zhì)氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響 由圖2可知，Gs總體變化呈現(xiàn)出下降趨勢，除R∶B處理外，各處理最大值均出現(xiàn)在60 d且W和R處理下Gs分別顯著高于(P<0.05)B和R∶B處理，同時，60 d時R處理下Gs顯著高于30、60、90、120、150、180 d時期R處理(P<0.05)。R∶B處理下除150和180 d無顯著性之外，其余各發(fā)育天數(shù)對幼苗葉片Gs均顯著高于150和 180 d。總體上不同處理間杉木幼苗葉片氣孔導(dǎo)度總體表現(xiàn)為：CK>R∶B>B>R。

不同大寫字母代表發(fā)育天數(shù)顯著，小寫字母代表不同處理顯著，下同

圖2 不同光質(zhì)對杉木幼苗Gs的影響

2.1.3 光質(zhì)對胞間CO2濃度(Ci)的影響 經(jīng)過一段時間處理的幼苗Ci整體波動變化幅度不大。由圖3可知，60 d時R處理下葉片Ci顯著高于同一時期其余3種處理，而90 d時W處理下葉片Ci顯著高于同一時期另外3種處理。同時，同為R處理的幼苗葉片Ci，60 d時顯著高于其他發(fā)育天數(shù)下同為R處理的幼苗葉片Ci含量。同理，同為W處理的幼苗葉片Ci，90 d時顯著高于不同發(fā)育天數(shù)同為W處理的幼苗葉片Ci。

圖3 不同光質(zhì)對杉木幼苗Ci的影響

2.1.4 光質(zhì)對蒸騰速率(Tr)的影響 由圖4可知，隨著幼苗生長天數(shù)增加，杉木幼苗葉片Tr表現(xiàn)出下降的趨勢，白光處理下的Tr總是高于其他處理。除R∶B處理外，其余3種處理均在60 d時達(dá)到最大值且60 d時4種處理下的幼苗葉片Tr顯著高于90、120、150、180 d，同種處理下的幼苗葉片Tr，30 d時R∶B處理下幼苗葉片Tr顯著高于60～180 d R∶B處理下的幼苗葉片。整個杉木幼苗發(fā)育期間，幼苗葉片Tr經(jīng)過4種處理后分別下降133.33%、131.73%、208.98%、213.11%，以R∶B處理下降幅最大。

圖4 不同光質(zhì)對杉木幼苗Tr的影響

W、R、B、R∶B分別為白光、紅光、藍(lán)光、紅藍(lán)組合光處理下葉綠體超微結(jié)構(gòu)；St：淀粉粒； Hu：嗜鋨顆粒；Mi：線粒體；Chl：葉綠體；Cw：細(xì)胞壁；Cm：葉綠體膜；Th：類囊體；Nu：細(xì)胞核； GL：基粒片層；S:基質(zhì)片層

2.2 光質(zhì)對杉木幼苗葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

對不同光質(zhì)處理180 d的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察得出，與CK(W處理)相比，紅光處理下葉綠體中淀粉粒數(shù)量較少、體積小，呈梭形，然而結(jié)構(gòu)完整，無明顯變化。細(xì)胞壁完整并且仍然較為光滑。嗜鋨顆粒少量出現(xiàn)，顆粒小。類囊體片層上垛疊薄，基粒片層的垛疊多，線粒體開始分解。藍(lán)光處理下葉綠體細(xì)胞壁平滑，淀粉粒消失，但細(xì)胞壁厚薄不一，葉綠體無較大變化，沿細(xì)胞壁整齊單列分布，嗜鋨顆粒數(shù)量少且顆粒小，基粒與基質(zhì)片層界限清晰，呈規(guī)則分布，連續(xù)緊密，類囊體片層垛疊變厚，線粒體降解。紅藍(lán)復(fù)合光處理下葉綠體淀粉粒出現(xiàn)數(shù)量極少，葉綠體與藍(lán)光類似均無明顯變化。紅藍(lán)復(fù)合光處理下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更加完整且更加平滑，嗜鋨顆粒大量出現(xiàn)且大量聚集，顆粒大，類囊體片層垛疊厚，基粒和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)清晰。

2.3 光質(zhì)對光合色素的影響

提取處理180 d杉木苗的光合色素，發(fā)現(xiàn)R∶B處理下的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量顯著低于單色光處理，但顯著增加了葉綠素比值。葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素均以W處理最高，但W處理與R、B處理并無顯著差別(表1)。

表1 不同光質(zhì)對杉木幼苗葉片光合色素的影響

2.4 各指標(biāo)的方差分析和相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明，Pn、Gs、Ci、Tr在時間、處理及其兩者間的交互均存在顯著差異，時間、處理以及兩者的交互對各指標(biāo)有顯著影響。Pn與Tr，Gs極顯著正相關(guān)。Tr和Gs之間表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)(表2～3)。

表2 杉木幼苗不同光質(zhì)處理及各指標(biāo)間的方差分析

表3 杉木幼苗葉片各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 不同光質(zhì)對杉木幼苗光合特性的影響

光合速率是影響植物產(chǎn)量的重要因子，相關(guān)研究表明，紅藍(lán)復(fù)合光(R∶B=1∶9)下油茶凈光合速率(Pn)最大[19]；紅藍(lán)光比例為3∶1的情況下，Gs、Pn、Ci、Tr均達(dá)到最大[20]；葉用萵筍在紅藍(lán)復(fù)合光為8∶1的情況下，Gs、Pn、Ci、Tr最大[21]。本文中，與紅、藍(lán)光相比，白光最有利于提升幼苗葉片凈光合速率，其次為紅藍(lán)組合光?？赡苁前坠庹T使氣孔開放的能力上優(yōu)于紅、藍(lán)光[22]。紅光處理與其他單色光和組合光相比，葉綠素含量較高，凈光合速率最低，產(chǎn)生此種現(xiàn)象的原因可能是相對于紅光而言，藍(lán)光下葉片葉肉細(xì)胞淀粉粒積累較少[23]，紅光會扼制葉片輸出光合產(chǎn)物，增加葉片中的淀粉粒積累，而淀粉粒的過量積累會阻礙植物葉片光合作用的進(jìn)行[24]。本研究得出，相較于其他處理，紅光處理的幼苗氣孔導(dǎo)度顯然偏低，但胞間CO2濃度顯然上升，表明植物細(xì)胞對CO2的利用能力弱，氣孔導(dǎo)度和CO2利用效率的降低可能均是其凈光合速率下降的原因[25]。紅藍(lán)組合光下凈光合速率顯著高于紅、藍(lán)單色光處理，可能原因是紅藍(lán)復(fù)合光處理減緩了葉綠素和類胡蘿卜的衰減，同時也說明紅藍(lán)復(fù)合光提升杉木幼苗葉片凈光合速率的能力優(yōu)于藍(lán)光和紅光[26]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)120 d藍(lán)光處理下的杉木幼苗Gs顯著高于同時期不同處理，可能是此時藍(lán)光誘導(dǎo)向光蛋白PHOT1、PHOT2自磷酸化，進(jìn)而使得BLUS1的348位點(ser-348)磷酸化，而BLUS1的磷酸化又引誘保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPase的磷酸化和激活，從而導(dǎo)致胞膜的超極化(hyperpolarization)，最終導(dǎo)致氣孔開放[27]。

3.2 不同光質(zhì)對杉木幼苗葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

葉綠體對外界環(huán)境的察覺十分明銳，有研究表明，高度逆境脅迫下葉綠體結(jié)構(gòu)會發(fā)生不可逆的損傷，例如，類囊體膜解體、淀粉粒消失等[28]。葉綠體結(jié)構(gòu)受損是引發(fā)光合作用降低的重要原因之一。而光合作用的減弱必然造成植物凈光合速率下降。本研究通過電鏡觀察，R處理下淀粉粒分布較少且淀粉粒變小，對應(yīng)著R處理下凈光合速率降低，光合能力低。與曹剛等[29]對黃瓜的研究結(jié)果不一致，一方面是黃瓜屬于被子植物，而杉木屬于裸子植物，兩者物種差別引起生理構(gòu)造的區(qū)別。另一方面，曹剛研究中光強控制在50 μmol/(m2·s)左右，而本研究光強控制在100 μmol/(m2·s)。本研究中，藍(lán)光處理下，類囊體片層垛疊厚，基粒片層與基質(zhì)片層分布規(guī)則且連續(xù)緊密，這與張汝民[30]對綠豆的研究結(jié)果不一致。類囊體是光捕捉，電子傳遞，質(zhì)子易位以及ATP酶合成位點，是光反應(yīng)的場所[31-32]。因此，類囊體片層結(jié)構(gòu)與植物光合能力關(guān)系緊密[33]。有學(xué)者就得出藍(lán)光處理的綠豆其基質(zhì)片層形成速度快于其他光質(zhì)處理，卻阻礙類囊體垛疊[30]。也有學(xué)者研究得出沙冬青幼苗葉綠體內(nèi)葉肉細(xì)胞淀粉粒體積較小[34]。本試驗電鏡觀察表明，紅藍(lán)復(fù)合光處理下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更加完整且更加平滑，淀粉粒體積小且數(shù)量少，嗜鋨顆粒大量出現(xiàn)且大量聚集，顆粒大，類囊體片層垛疊厚，基質(zhì)片層和基粒構(gòu)造明確，這與曹剛等[35]的結(jié)果一致，這可能與光合作用相關(guān)的光合受體在類囊體上的功能啟動和組裝相關(guān)，并且紅藍(lán)復(fù)合光下基質(zhì)片層、基粒非常清晰，基粒片層、基質(zhì)片層及片層結(jié)構(gòu)井然有序，為有效提升光合速率提供了保障。

3.3 不同光質(zhì)對杉木幼苗光合色素的影響

光合色素能吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞光能，是植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)，其組分與含量直接影響葉片光合速率。許多研究報道，紅光提高植物葉綠素含量，藍(lán)光降低葉綠素含量[11]，增加葉綠素a/b值[36]。這與本文結(jié)果一致。本試驗發(fā)現(xiàn)紅藍(lán)復(fù)合光下色素含量低于紅、藍(lán)單色光處理，可能是由于紅藍(lán)光互相抵消的效應(yīng)導(dǎo)致。類胡蘿卜素能幫助葉綠體吸收光能，避免高溫、強光下的破壞[37]。本研究中紅藍(lán)組合光處理類胡蘿卜素含量雖然顯著低于單色光處理，但是凈光合速率卻高于單色光，這可能是由于類胡蘿卜素大量吸收波長較長的紅光，保護葉綠體免受高溫傷害使得凈光合速率高于單色光。藍(lán)光下葉片類胡蘿卜素降低，與閆萌萌等[25]在花生上的研究結(jié)果不一致。這主要歸功于藍(lán)光波長選擇和物種不同，閆萌萌實驗中選擇藍(lán)光段波長為445～470 nm，而本實驗藍(lán)光波長為454 nm，不同種類植物對光吸收偏好不同是導(dǎo)致兩者出現(xiàn)差異的重要原因。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，不同生長期和光質(zhì)處理下的杉木幼苗，其光合參數(shù)、光合色素含量、葉綠體超微結(jié)構(gòu)均有差別，說明不同光質(zhì)配比和生長期對杉木幼苗會有顯著影響?？偟膩砜?，藍(lán)光及一定比例紅藍(lán)復(fù)合光下葉片光和參數(shù)，光合紅色素含量高于其他單色光處理。紅藍(lán)復(fù)合光下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更加完整且更加平滑，類囊體片層垛疊厚，基粒和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。因此，藍(lán)光以及一定比例的紅藍(lán)光是杉木幼苗良種壯苗較為理想的光質(zhì)。