王春曉，郝倩琳，于秋鴻，裴玉賀，宋希云，李 軍

(青島農業(yè)大學農學院, 山東 青島 266109)

【研究意義】近年來作物生長季頻繁發(fā)生的高溫熱害以及因自然降水不均勻造成的局部地區(qū)干旱等因素嚴重制約了作物的生長發(fā)育，造成全球作物“產量與品質”雙下降。據統(tǒng)計，2006年我國川渝地區(qū)因高溫和干旱造成的直接經濟損失達216.4億元，1980—2012年間美國因高溫或干旱等災害造成的損失高達約10億美元[1-2]。研究發(fā)現，植物在遭受高溫等逆境脅迫時，體內會積累大量的代謝產物如甲基乙二醛(MG)等[3]。MG是一類有毒的醛酮類代謝物，能夠使多種細胞成分發(fā)生不可逆地修飾、形成加合物和交聯，產生毒害效應[4]。細胞內MG的降解途徑：一是依賴還原型谷胱甘肽(GSH)的途徑，包括乙二醛酶1(GLY1)和乙二醛酶2(GLY2)；二是不依賴GSH的途徑，如乙二醛酶3(GLY3)[5]，最終將MG轉化為無毒的乳酸，降低或消除其毒害作用[6]。乙二醛酶系統(tǒng)在動物細胞中研究得比較清楚，其參與細胞增殖、胚胎發(fā)生、成熟和細胞死亡等生物過程[7-9]，如臨床上通過提高 Gly1的活性來治療糖尿病和高血糖癥[10]?！厩叭搜芯窟M展】植物Gly1基因迄今已在擬南芥、水稻、玉米和甘蔗等得到克隆，屬于多基因家族[11]。Gly1的表達除了受非生物逆境和生物脅迫的誘導外，還受激素如生長素和細胞分裂素等的誘導，說明 Gly1蛋白參與植物對非生物、生物脅迫和激素信號的響應[12-15]。過表達Gly1和Gly2的轉基因煙草和水稻表現出較強的耐鹽和抗旱能力[6, 16-17]。另外，用茉莉酸處理的玉米幼苗 Gly1蛋白的活性比對照顯著提高，且對鹽堿的脅迫耐受能力明顯增強[18]?！颈狙芯壳腥朦c】迄今，對玉米ZmGly1的表達特性和生物學功能缺乏深入研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用生物信息學和qRT-PCR方法對ZmGly1編碼蛋白的結構、理化性質和表達差異等進行解析，找出該基因在高溫和干旱脅迫應答中的可能作用，以期為將來培育抗旱、耐熱玉米新種質提供可利用的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗采用的玉米品種為“鄭單958”。將種子播于含有營養(yǎng)土和蛭石(3∶1)的花盆(1粒/盆)中，置于青島農業(yè)大學智能溫室內(25 ℃)生長。待幼苗長至三葉期時分別進行干旱(20% PEG600)和高溫(37 ℃)處理，在處理0、12、24、36、48 h后選取玉米的根、莖和葉，快速置于液氮中保存?zhèn)溆?。每個處理含5棵幼苗，重復3次。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購自Takara公司；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR所用引物

1.3 生物信息學分析

從NCBI網站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到ZmGly1基因(登錄號：NM_001153401)序列；用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)軟件分析ZmGly1基因編碼蛋白的理化性質；用TMHMM Server 2.0軟件進行蛋白跨膜結構預測；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 進行蛋白質高級結構分析；用MEGA 7.0軟件對ZmGly1進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.4 總RNA提取、cDNA合成和表達模式分析

按照操作說明，用RNA提取試劑盒提取總RNA；用反轉錄試劑盒合成cDNA；用qRT-PCR分析表達模式，以玉米Actin作為內參基因。

2 結果與分析

2.1 ZmGly1蛋白的理化性質分析

用ProtParam tool軟件分析發(fā)現，ZmGly1基因的cDNA序列為669 bp，編碼222個氨基酸，理論分子量為24.98 kD，等電點為6.6。對氨基酸組成分析發(fā)現，帶負電荷的氨基酸(Asp + Glu)殘基總數為30，帶正電荷的氨基酸(Arg + Lys)殘基總數為29，Leu含量最高，占8.1%；Cys含量最少，占0.9%。疏水系數是-0.448，為親水性蛋白。TMHMM Server軟件分析發(fā)現，該蛋白不含跨膜結構域，為細胞質蛋白(圖1)。

圖1 ZmGly1跨膜結構域預測

2.2 ZmGly1蛋白結構分析

用SOPMA軟件對ZmGly1蛋白的二級結構分析發(fā)現，在二級結構中N端為無規(guī)則卷曲部分，占比約49.13%；其次是α螺旋，占比為23.04%；β轉角占比為7.39%，其余的延伸鏈結構(圖2-a)。用SWISS-MODEL軟件對ZmGly1蛋白的空間結構分析發(fā)現，ZmGly1是一種金屬酶，在蛋白質的A鏈和B鏈上含有4個結合Zn2+的配體氨基酸殘基，即His162、Glu208和Gln68、Glu134(圖2-b)。

a.二級結構模型；b.空間結構模型和金屬結合位點

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

用BLAST程序從NCBI數據庫中檢索與ZmGly1同源的其他植物的蛋白序列，然后選取氨基酸序列同源性≥60%的14種植物進行進化樹分析。結果表明ZmGly1蛋白與高粱SbGly1同源性為92.51%，親緣關系最近；與三裂葉薯MeGly1的同源性為67.81%，親緣關系最遠(圖3)。

BdGly1為二穗短柄草; BhGly1為冬瓜; CmGly1為筍瓜; CsGly1為亞麻薺; DeGly1為福尼奧小米；McGly1為苦瓜; MeGly1為木薯; ObGly1為短花藥野生稻；OsGly1為粳稻; PvGly1為柳枝稷；SbGly1為高粱；SiGly1為粟; SvGly1為狗尾草；ZmGly1為玉米

2.4 ZmGly1基因的組織特異性表達

如圖4所示，ZmGly1基因在玉米根、莖和葉片中均有表達，其中，葉片中的相對表達量最高，分別是根和莖中表達量的4.3和3.1倍。

圖4 ZmGly1在不同組織的相對表達量

2.5 ZmGly1基因在高溫和干旱逆境脅迫下的表達情況分析

如圖5-a所示，與對照相比，高溫處理下ZmGly1在葉片中的表達隨時間的延長呈現出先降低后升高再降低的趨勢。如在高溫處理12 h后表達量顯著降低，為對照的57%；但在處理24 h后表達量顯著升高，為對照的1.2倍，之后表達量下降，到處理48 h后表達量約為對照的97%。如圖5-b所示，與對照相比，干旱處理下ZmGly1在葉片中的表達隨時間的延長呈現出先升高后降低的趨勢。在干旱處理12 h后表達量較高，是對照的1.1倍；之后表達量逐漸下降，如在處理48 h后的表達量為對照的60%。

圖5 高溫(a)和干旱(b)脅迫下ZmGly1基因的相對表達量

3 討 論

玉米是一種重要的糧飼兼用作物。然而，夏玉米生產常因季節(jié)性高溫和由高溫誘發(fā)的干旱等雙重災害導致玉米減產，因此挖掘抗逆優(yōu)異基因進而培育抗性較強的玉米品種是減少高溫熱害損失的有效途徑[19]。乙二醛酶1(Gly1)是依賴GSH途徑的限速酶，在細菌、酵母、動植物等生物體中普遍存在[20]。Gly1發(fā)揮著重要的解毒功能，能夠有效降低細胞中的甲基乙二醛含量，清除比例可達99%[21]。擬南芥Gly1是一類依賴金屬離子的蛋白酶，催化活性需要 Ni2+和Zn2+作為輔因子[22]。對ZmGly1基因的生物信息學分析發(fā)現，ZmGly1基因的分子量為24.98 kD，是一種親水性蛋白。由于缺乏跨膜結構域，推測該蛋白定位于細胞質中。在蛋白質的二級結構中還有較高比例的α螺旋和β轉角，這對維持ZmGly1蛋白的構象穩(wěn)定起重要作用。與擬南芥Gly1類似，ZmGly1蛋白也是一種金屬酶， 但需要Zn2+作為輔因子，在蛋白的A鏈和B鏈上各包含1個Zn2+金屬結合位點，分別位于His162、Glu208和Gln68、Glu134。通過對14種植物Gly1蛋白氨基酸序列同源性分析發(fā)現，ZmGly1與高粱SbGly2同源性最高，親緣關系最近。

GLY1是一個基因家族，已有研究發(fā)現在擬南芥基因組中有11個編碼GLY1的同源基因[23]。對其轉錄本豐度分析發(fā)現，AtGLY1不僅在營養(yǎng)器官如葉、根中表達，也可在繁殖器官如花、角果中表達，如AtGLY1.1在葉片中的轉錄本豐度最高，在根中最低；且AtGLY1對干旱、高鹽、冷、熱和高光響應的轉錄本豐度呈現多樣性，如AtGLY1.1對干旱、鹽、冷和熱應答的轉錄本豐度下降，而對高光的響應升高；AtGLY1.2對鹽、冷和熱應答的轉錄本豐度下降，而對干旱、高光的響應增加。qRT-PCR分析結果顯示，ZmGly1基因在不同組織器官中的表達水平存在差異，在葉片中的表達量最高，而在根和莖中表達量相對較低，這與Schmitz等[23]報道的AtGLY1.1結果一致。ZmGly1基因應對干旱和高溫脅迫的表達情況有差異，如干旱處理下ZmGly1基因在葉片中的表達隨時間的延長呈現出先升高后降低的趨勢，但在高溫處理下隨時間的延長呈現出先降低后升高再降低的趨勢。

4 結 論

玉米乙二醛酶1作為依賴Zn2+的蛋白酶，與高粱的親緣關系最近，通過改變ZmGly1基因的表達來調控玉米對高溫和干旱的脅迫應答，但具體的生物學功能還有待于進一步解析。