馬榮 尚方正 潘劍鋒 戎友俊 王敏 李金泉 張燕軍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，呼和浩特 010018）

蛋白質(zhì)是基因的功能產(chǎn)物，是細(xì)胞功能的主要執(zhí)行者，在發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、記憶形成和衰老等多種生理過程中起著關(guān)鍵作用［1-2］。mRNA 是蛋白質(zhì)合成的信息藍(lán)圖，基于高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以反映細(xì)胞中mRNA 的種類和數(shù)量，且可以檢測(cè)mRNA 的序列突變和可變剪切［3-4］。Maier 等［5］對(duì)多個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，mRNA 表達(dá)水平與其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)在0.01-0.5 之間，表明mRNA 的表達(dá)水平并不能較好地作為判斷蛋白質(zhì)水平的依據(jù)。因此，作為轉(zhuǎn)錄組和蛋白組之間的“橋梁”——翻譯調(diào)控被認(rèn)為是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要機(jī)制。翻譯調(diào)控是一種快速激活或抑制mRNA 翻譯以響應(yīng)內(nèi)源、外源信號(hào)的機(jī)制，可快速靈活的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度，實(shí)現(xiàn)生理變化、維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。翻譯調(diào)控紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無法維持正常的細(xì)胞功能或無法適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件，從而導(dǎo)致多種疾?。?-7］。翻譯可分為3個(gè)階段：起始、延伸、終止。其中，翻譯起始長(zhǎng)久以來被認(rèn)為是翻譯速率的主要限速步驟［8］，是決定蛋白質(zhì)表達(dá)量的關(guān)鍵，影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在細(xì)胞增殖、凋亡等方面扮演重要角色［9］。

細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、蛋白質(zhì)合成速率都與核糖體數(shù)目密切相關(guān)。生物在不同生長(zhǎng)階段、不同生長(zhǎng)環(huán)境以及應(yīng)激條件下都是通過對(duì)翻譯速率的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)外界刺激迅速產(chǎn)生反應(yīng)。翻譯速率的探究有助于科研人員更清晰地了解細(xì)胞生命活動(dòng)的快速變化。因此，本文在概述真核、原核細(xì)胞內(nèi)翻譯機(jī)制的基礎(chǔ)上，從影響翻譯速率的主要因素和探究翻譯、翻譯速率的主要技術(shù)手段兩個(gè)方面綜述了mRNA 翻譯的研究現(xiàn)狀，旨在為更多學(xué)者進(jìn)一步了解生物體內(nèi)翻譯過程提供參考依據(jù)。

1 mRNA 翻譯機(jī)制

核糖體是mRNA 進(jìn)行翻譯的主要場(chǎng)所，主要由核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和多種核糖體蛋白構(gòu)成，是一類高度復(fù)雜的細(xì)胞器。核糖體內(nèi)部有3 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）結(jié)合位點(diǎn)，分別為E、P、A 位點(diǎn)，A 是氨酰-tRNA 結(jié)合的位點(diǎn)，P 是肽酰-tRNA 結(jié)合的位點(diǎn)，E 是核糖體內(nèi)空載tRNA 釋放位點(diǎn)。攜有氨基酸的tRNA（氨酰-tRNA）會(huì)依次經(jīng)過A、P 位點(diǎn)，隨后將氨基酸結(jié)合于多肽鏈末端，最后以空載tRNA 的形式從E 位點(diǎn)移出［10］。當(dāng)核糖體遇到終止密碼子時(shí)，mRNA 翻譯結(jié)束，多肽形成［10］。以上是細(xì)胞內(nèi)mRNA 的翻譯過程，分為3 個(gè)階段：起始、延伸和終止。生物體內(nèi)細(xì)胞的翻譯過程是高度保守的［11］，機(jī)制也十分相似。然而，由于真核、原核細(xì)胞內(nèi)mRNA 結(jié)構(gòu)的不同，因此兩類細(xì)胞的翻譯起始方式有明顯差異，但兩類細(xì)胞內(nèi)的翻譯延伸、終止是相似的［12］。因此本文將分別介紹真核細(xì)胞和原核細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)制。

1.1 真核生物mRNA翻譯機(jī)制

真核細(xì)胞內(nèi)存在兩類核糖體識(shí)別機(jī)制，一類為5′端帽子識(shí)別機(jī)制，另一類為識(shí)別核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）機(jī)制。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)存在部分RNA（大多為非編碼RNA，如lncRNA、circRNA 等）是通過對(duì)IRES 的識(shí)別進(jìn)行翻譯，但真核細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)mRNA 都是通過對(duì)5′端帽子結(jié)構(gòu)的識(shí)別進(jìn)行翻譯。因此，本文以5′端帽子識(shí)別機(jī)制為例進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

首先，由支架蛋白eIF4G 和結(jié)合蛋白eIF4E 共同識(shí)別mRNA 的5′帽子結(jié)構(gòu)。隨后在eIF4G 因子的招募下，eIF4A 與mRNA 結(jié)合，eIF4A、eIF4E 和eIF4G 共同構(gòu)成eIF4F，并在eIF4B 的共同作用下破壞mRNA 5′端的二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)等），這為接下43S 前起始復(fù)合物的結(jié)合提供條件［13］。與此同時(shí)，核糖體40S 小亞基也為mRNA 的結(jié)合做準(zhǔn)備。為使與eIF2-GTP 結(jié)合的甲硫氨酸起始子tRNA（MettRNAi）順利的結(jié)合在小亞基的P 位點(diǎn)，翻譯起始因子eIF1 首先結(jié)合于小亞基E 點(diǎn)，隨后eIF3、eIF5 依次與E 位點(diǎn)的eIF1 結(jié)合，共同占據(jù)E 位點(diǎn)；而小亞基A 位點(diǎn)則由翻譯起始因子eIF1A 占據(jù)。翻譯起始因子eIF5、eIF3、eIF1 和eIF1A 不僅可以確保MettRNAi 準(zhǔn)確結(jié)合于核糖體P 位點(diǎn)，而且可以阻止核糖體大、小亞基的結(jié)合，進(jìn)而確保翻譯的順利進(jìn)行。eIF2 以GTP 的形式（eIF2-GTP） 與Met-tRNAi 結(jié)合，并在eIF5 的作用下將Met-tRNAi 遷至小亞基P點(diǎn)。此時(shí)，由核糖體40S 小亞基、eIF3、eIF5、eIF1和eIF1A 以及GTP、eIF2 和Met-tRNAi 構(gòu)成的復(fù)合物為43S 前起始復(fù)合物。eIF3（位于43S 前起始復(fù)合物內(nèi)）被結(jié)合于mRNA 5′端的eIF4G 招募，從而形成48S 前起始前復(fù)合物［13-14］；48S 前起始前復(fù)合物從5′→ 3′方向掃描，直至找到具有Kozak 序列特征的起始密碼子［15-16］。正確的堿基互補(bǔ)配對(duì)改變了48S 前起始復(fù)合物的構(gòu)象，促使翻譯起始因子從復(fù)合體中釋放，核糖體大亞基與小亞基結(jié)合。此時(shí)，mRNA 翻譯起始結(jié)束，翻譯延伸開始。

在翻譯延伸階段，起始tRNA（Met-tRNAi）停留在具有延伸能力的核糖體的肽基（P）部位，而氨酰-tRNA 在延伸因子的“護(hù)送”下移至核糖體A 位點(diǎn)，A 位點(diǎn)氨酰-tRNA 和P 位點(diǎn)的氨基酸相遇并形成肽鍵。肽鍵形成后，核糖體移至下一密碼子，P 位點(diǎn)的tRNA 從E 位點(diǎn)排出，A 位點(diǎn)的tRNA 帶著合成的肽鏈移至P 位點(diǎn)，而A 位點(diǎn)空出，等待下一個(gè)氨基酸。翻譯延伸的過程一直持續(xù)到A 位點(diǎn)遇到終止密碼子（UAG、UGA 或UAA），一旦終止密碼子進(jìn)入核糖體的A 位點(diǎn)，釋放因子則被招募到A 位點(diǎn)，多肽鏈和tRNA 隨即被釋放，核糖體解離成亞單位，循環(huán)用于下一輪翻譯［17］。真核細(xì)胞內(nèi)mRNA 翻譯機(jī)制如圖1所示。

圖1 真核細(xì)胞內(nèi)mRNA 翻譯機(jī)制Fig.1 mRNA translation mechanism in eukaryotic cells

1.2 原核生物mRNA翻譯機(jī)制

原核細(xì)胞內(nèi)mRNA 的5′ 端通常有SD 序列（Shine-Dalgarno sequence），該序列可與核糖體30S小亞基結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)mRNA 正確翻譯。此外有研究發(fā)現(xiàn)，原核細(xì)胞內(nèi)也存在一類可以進(jìn)行翻譯且不含SD 序列的mRNA，但其翻譯起始速率低，且具體機(jī)制還不清晰。因此，本文以含有SD 序列的mRNA為例進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

在翻譯起始階段，翻譯起始因子IF3、IF1 與IF2 的復(fù)合物質(zhì)分別占據(jù)30S 小亞基的E、A 位點(diǎn)，其不僅促進(jìn)翻譯起始tRNA 正確的結(jié)合，也阻止核糖體大、小亞基的結(jié)合［18-19］。隨著3 個(gè)起始因子的加入，核糖體小亞基已準(zhǔn)備好與mRNA、起始tRNA結(jié)合。mRNA 的SD 序列與核糖體小亞基形成穩(wěn)定的SD：aSD 堿基對(duì)，促使小亞基與mRNA 的結(jié)合；起始tRNA 則在IF2 的招募下，準(zhǔn)確地結(jié)合于小亞基的P 位點(diǎn)［20-21］。此時(shí)，mRNA、核糖體小亞基、起始tRNA、IF3、IF1 以及IF2 共同構(gòu)成30S 起始復(fù)合物。隨著起始tRNA 的結(jié)合，核糖體小亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，IF3 從E 位點(diǎn)脫落［16，22］，促使核糖體50S 大亞基與30S 起始復(fù)合物結(jié)合。IF2 是大亞基初始對(duì)接位點(diǎn)，與大亞基相互作用后可激活I(lǐng)F2-GTP 酶的活性，使IF2-GDP、IF1 被釋放，最終形成完整的70S起始復(fù)合物。此時(shí)，mRNA 翻譯起始結(jié)束，翻譯延伸開始。

原核細(xì)胞內(nèi)mRNA 的翻譯延伸、終止機(jī)制與真核細(xì)胞高度相似，都是將攜有氨基酸的tRNA 進(jìn)行易位實(shí)現(xiàn)翻譯的延伸，通過核糖體識(shí)別終止密碼子并招募釋放因子實(shí)現(xiàn)翻譯的終止，因此不再做詳細(xì)介紹，原核細(xì)胞內(nèi)mRNA 翻譯機(jī)制如圖2所示。

圖2 原核細(xì)胞內(nèi)mRNA 翻譯機(jī)制Fig.2 mRNA translation mechanism in prokaryotic cells

2 翻譯速率調(diào)控

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的實(shí)際執(zhí)行者，其豐度主要由合成和降解兩方面決定［23］。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的降解常數(shù)與蛋白質(zhì)豐度的R2僅為0.10［23］，表明蛋白質(zhì)的降解對(duì)蛋白質(zhì)豐度的影響很?。?4］，即蛋白質(zhì)的合成是蛋白質(zhì)豐度的決定因素。翻譯速率不僅是決定蛋白質(zhì)豐度的關(guān)鍵，也是決定蛋白質(zhì)折疊的關(guān)鍵因素之一，異常的翻譯速率將導(dǎo)致癌癥、神經(jīng)退行等多種疾?。?5-26］。關(guān)于核糖體翻譯速率參數(shù)的定義，目前國(guó)際尚無定論。2009年Ingolia 等［27］將核糖體的標(biāo)準(zhǔn)化read 數(shù)除以mRNA 的標(biāo)準(zhǔn)化read 數(shù)，定義為翻譯效率。然而mRNA 的翻譯速率與其結(jié)合核糖體的數(shù)量并不總呈正相關(guān)，當(dāng)翻譯至mRNA的某一位置停止或暫停時(shí)，會(huì)導(dǎo)致核糖體聚集，若采用平均核糖體密度描述翻譯速率，將會(huì)高估這類基因的翻譯速率。同時(shí)大量研究表明，翻譯起始是mRNA 翻譯的主要限速步驟，其速率是決定細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的關(guān)鍵［28］。在翻譯起始階段，除翻譯起始因子影響著翻譯的進(jìn)行，還有mRNA 的“特殊序列”（真核細(xì)胞Kozak 序列、原核細(xì)胞SD 序列）、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和起始密碼子等因素決定著翻譯的起始速率。

2.1 存在于mRNA的“特殊序列”

2.1.1 真核細(xì)胞mRNA 的Kozak 序列 真核細(xì)胞mRNA 常以單順反子的形式存在，其鏈內(nèi)的5′帽子結(jié)構(gòu)或IRES 可以被核糖體小亞基識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而識(shí)別起始密碼子、開始翻譯。起始密碼子AUG之所以可以被核糖體小亞基識(shí)別，是因其兩側(cè)翼序列（通常為GCCACCAUGG）可以與翻譯起始因子結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)5′帽子結(jié)構(gòu)的mRNA 翻譯，這段序列稱為Kozak 序列。Kozak 序列組成并不是完全一致的，但AUG 上游-3 位的A 或G，下游+4 位的G 卻是高度保守的；同時(shí)當(dāng)序列為GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG 時(shí)，mRNA 翻譯效率最高。有大量研究證明，Kozak 序列是影響起始密碼子識(shí)別的主要因素之一［29］。例如，釀酒酵母轉(zhuǎn)錄本中Kozak 序列是小核糖體亞單位穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)，其可促進(jìn)翻譯更快的啟動(dòng)［30］；在Kozak 序列-6 位的G 以及-1、-2位的C 可以顯著地提高mRNA 翻譯起始效率［30-31］；當(dāng)上游開放閱讀框（upstream open reading frames，uORF）的AUG 起始密碼子被放置在一個(gè)較不理想的Kozak 序列時(shí)，uORF 編碼的肽段表達(dá)水平較低［32］。

2.1.2 原核細(xì)胞mRNA 的SD 序列 1974年John Shine 和Lynn Dalgarno 在大腸桿菌RBS 序列中發(fā)現(xiàn)有一段富含嘌呤的序列，其可促進(jìn)翻譯的起始［33］，該序列被命名為Shine Dalgarno（SD）。SD 通常指存在于細(xì)菌和古細(xì)菌等原核生物中的位于翻譯起始密碼子AUG 上游約8-10 個(gè)堿基的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，但也被發(fā)現(xiàn)存在于葉綠體和線粒體轉(zhuǎn)錄本［34］。SD 序列的組成并不完全相同，其可以與核糖體16S rRNA 的anti-SD 序列（aSD）形成穩(wěn)定的SD：aSD堿基對(duì)，進(jìn)而促進(jìn)核糖體的招募和mRNA 的翻譯。不同堿基組成的SD 序列與anti-SD 序列的配對(duì)程度不同，因此翻譯起始效率也有所不同。例如，藍(lán)球藻和萊茵衣藻psbD 基因的SD 序列或起始密碼子中引入突變會(huì)大大降低翻譯效率［35］；Barrick 等［36］研究了4 種堿基隨機(jī)分布的185 種不同組成的SD 序列，以β-半乳糖苷酶為目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其表達(dá)量最高和最低相差3 000 多倍。以上表明，SD 序列通過SD：aSD 堿基配對(duì)促進(jìn)翻譯起始，且結(jié)合程度越強(qiáng)翻譯起始速率越高，但其并不是決定翻譯的必要條件。此外，SD 序列與起始密碼子的相對(duì)位置也影響著翻譯起始效率。例如，枯草芽孢桿菌的胞內(nèi)蛋白的SD 序列與起始密碼子間隔7-9 個(gè)核苷酸的翻譯起始效率是間隔4 個(gè)核苷酸翻譯效率的27 倍［37］；RelA 是一類核糖體依賴性合成酶，其通過與SD 序列中的GGAG 序列結(jié)合，干擾核糖體與mRNA 的結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯起始，但其抑制程度取決于GGAG 相對(duì)于AUG 的距離，縮短GGAG 與AUG 之間的距離則會(huì)消除RelA 介導(dǎo)的抑制作用［38］（圖3）。因此，改變SD 序列的堿基組成或改變SD 序列與起始密碼子的相對(duì)位置都對(duì)mRNA翻譯起始速率有著重要影響。

圖3 ReIA 在SD 區(qū)介導(dǎo)的翻譯起始抑制Fig.3 Inhibition of translation initiation mediated by ReIA in SD region

2.2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

在翻譯起始過程中，雖然翻譯起始因子可以消除mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)［33］，但對(duì)于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二級(jí)或高級(jí)結(jié)構(gòu)卻很難消除。因此，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于翻譯速率的影響占主導(dǎo)地位，其通過影響核糖體與mRNA 的結(jié)合能力阻礙翻譯起始［28］。5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）是指mRNA 的5′末端帽子結(jié)構(gòu)到起始密碼子之間的一段序列，是核糖體識(shí)別重要元件之一［39］。該區(qū)域通常存在核糖體開關(guān)、miRNA 靶位點(diǎn)等可以調(diào)控mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的調(diào)控元件。例如，在枯草芽孢桿菌中xpt-pbuX mRNA 的5′UTR 存在一個(gè)對(duì)鳥嘌呤高度敏感的核糖體開關(guān)，當(dāng)鳥嘌呤濃度升高時(shí)，適體結(jié)構(gòu)域（aptamer domain，AD）結(jié)合鳥嘌呤后構(gòu)象發(fā)生變化，表達(dá)結(jié)構(gòu)域（expression domain，EPD）的抗隔離子結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致隔離子莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，使SD 序列和翻譯起始密碼子 AUG 參與配對(duì)，阻止核糖體的結(jié)合，抑制 xpt-pbuX 的翻譯［40］（圖4）；Gu 等［41］系統(tǒng)地對(duì)動(dòng)物和植物中5′UTR 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，被miRNA 靶向的mRNA 的5′UTR 往往具有更加穩(wěn)定的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種趨勢(shì)往往存在于動(dòng)物中，植物中并不存在。此外有研究表明，miRNA 與靶向的mRNA結(jié)合后可招募Ago2蛋白沉積于mRNA的靶標(biāo)；由于Ago2 蛋白的中心結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子eIF4E極為相似，因此被沉積于mRNA 靶標(biāo)上的Ago2 蛋白與m7G 帽子結(jié)合，阻止eIF4E 的招募，進(jìn)而阻止eIF4F 的形成，抑制翻譯的起始［42］（圖5）。此外有研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 在同一密碼子偏好性的前提下，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可提高mRNA 的翻譯效率，而當(dāng)二級(jí)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變時(shí)，僅使用偏好密碼子并不能提高蛋白質(zhì)的表達(dá)，表明稀有密碼子的使用是通過弱化mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)其翻譯［43］。以上結(jié)果表明，5′UTR 區(qū)內(nèi)mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響著翻譯起始速率，且稀有密碼子對(duì)翻譯速率的影響也是通過強(qiáng)化/弱化mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)。

圖4 核糖體開關(guān)對(duì)xpt-pbuX 的調(diào)控Fig.4 Regulation of xpt-pbuX by ribosomal switch

圖5 Ago2 蛋白對(duì)翻譯起始的抑制機(jī)制Fig.5 Mechanism of Ago2 protein on the inhibition of translation initiation

2.3 起始密碼子

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成并不是從RNA 分子的任何堿基起始的，而是由存在特異序列的AUG 作為起始密碼子，開始多肽鏈的合成。如果沒有特異序列的存在，這個(gè)密碼子則會(huì)被單純地讀作鏈內(nèi)甲硫氨酸的密碼子。Ingoli 等［44］通過對(duì)小鼠5 647 個(gè)典型蛋白質(zhì)的起始密碼子研究發(fā)現(xiàn)，有79%蛋白質(zhì)的起始密碼子是AUG，剩余的21%是同源起始密碼子；CUG、GUG、ACG 和UUG 是最常用的同源密碼子，而密碼子AUU、AUC、AUA 和AGG 出現(xiàn)頻率則較少［45］。有研究表明，起始密碼子及其后一位密碼子類型的改變都影響著mRNA 的翻譯起始速率。例如，在真核細(xì)胞中，與同源起始密碼子相比，翻譯起始因子在AUG 處持有更有效的翻譯起始［32］；Stenstrom［46］在大腸桿菌中利用缺少明顯SD 序列特征的基因中發(fā)現(xiàn)改變起始密碼子下一位的密碼子可以促使基因翻譯量增加20 倍之多，證明基因表達(dá)量與蛋白序列第二位的密碼子有關(guān)，并且高表達(dá)蛋白的第二位氨基酸傾向使用腺嘌呤含量高的密碼子編碼。此外，5′UTR 區(qū)的非AUG 起始的uORF 通常對(duì)下游基因的翻譯產(chǎn)生抑制作用；且該區(qū)的AUG 密碼子也會(huì)干擾核糖體的招募，從而導(dǎo)致翻譯起始效率降低［30］。

3 翻譯研究技術(shù)

除探究mRNA“特殊序列”、mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)和起始密碼子對(duì)翻譯起始速率的影響外，整體評(píng)估m(xù)RNA 翻譯速率對(duì)于蛋白質(zhì)的表達(dá)有著重要的意義。mRNA 測(cè)序技術(shù)非常完善，通過高通量測(cè)序技術(shù)探究處于翻譯狀態(tài)的mRNA，既可以間接反應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯水平，又可以檢測(cè)到基因的可變剪接甚至發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)分子［1-2］。因此，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)正在翻譯的mRNA 測(cè)序和分析成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。翻譯組研究最為常見的是多聚核糖體圖譜技術(shù)（polysome profiling），此外也有最近發(fā)展起來的翻譯譜分析技術(shù)（RNC-RNA-Seq）、核糖體圖譜技術(shù)（ribosome profiling）、核糖體親和純化技術(shù)（ribosome affinity purification，RAP）。翻譯組研究技術(shù)比較見表1。

表1 翻譯組研究技術(shù)比較Table 1 Comparison of techniques in translatome

3.1 多聚核糖體圖譜技術(shù)

核糖體是細(xì)胞內(nèi)部密度最大的生物分子，單條mRNA 可以同時(shí)與多個(gè)核糖體結(jié)合形成分子量更大的多聚復(fù)合物。利用抗生素放線菌酮可將正在翻譯的RNA 固定，阻止核糖體內(nèi)tRNA 釋放［47］，進(jìn)而阻止翻譯延伸。隨后利用蔗糖密度梯度離心法將分布在不同梯度溶液中游離的RNA、核糖體大/小亞基以及結(jié)合有不同數(shù)目核糖體的mRNA 進(jìn)行分離。根據(jù)結(jié)合核糖體數(shù)目的不同對(duì)mRNA 進(jìn)行分離，并利用Northern 雜交、RT-qPCR［48-49］和微陣列分析［50-53］等方法對(duì)每組收集到的特定mRNA 進(jìn)行分析（圖6）。此外，若對(duì)正在翻譯的RNA 進(jìn)行整體分析，可以通過構(gòu)建RNA-Seq 文庫(kù)、高通量測(cè)序［54-56］實(shí)現(xiàn)。多聚核糖體圖譜技術(shù)在人類癌癥的治療、非編碼RNA 編碼小肽的發(fā)現(xiàn)及植物在逆境脅迫的應(yīng)答等多方面都得到廣泛應(yīng)用。例如，Polenkowski 等［57］通過多聚核糖體圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞（HCC）中表達(dá)且可以編碼功能性小蛋白C20orf204-189AA 的Linc00176，其可能是HCC的特異性靶分子，且C20orf204-189AA 小蛋白也可以增強(qiáng)核糖體RNA 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)HCC 的增殖；高溫脅迫是全球小麥生產(chǎn)的主要限制因素，通過CRISPR /Cas9 的基因編輯和多聚核糖體圖譜等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)基因TaMBF1c顯著影響著熱響應(yīng)因子的翻譯效率，且與熱休克蛋白的翻譯密切相關(guān)，其結(jié)果揭示了TaMBF1c通過翻譯調(diào)控小麥的熱應(yīng)激反應(yīng)［58］。

圖6 翻譯組研究技術(shù)流程Fig.6 Technical process of translationomics

多聚核糖體圖譜技術(shù)能夠獲取正在翻譯的mRNA 的全長(zhǎng)信息，但沒有辦法獲知mRNA 內(nèi)部的翻譯信息，例如核糖體位置、閱讀框位置、翻譯暫停區(qū)、uORFs 等。該實(shí)驗(yàn)相對(duì)容易、適用范圍廣，但實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜、樣本需求量大［56］。此外，蔗糖密度離心的體積通常較大［27］，且在高濃度的蔗糖溶液中常摻有脂筏、假多聚核糖體等高分子量復(fù)合物［59］，這些都大大增加了獲取核糖體-新生肽鏈復(fù)合物（ribosome nascent-chain complex，RNC）中的mRNA 即翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA 的難度，進(jìn)一步局限該技術(shù)的發(fā)展。

在評(píng)估細(xì)胞內(nèi)翻譯活躍程度方面，多聚核糖體圖譜可根據(jù)mRNA 結(jié)合核糖體數(shù)目判斷該mRNA 翻譯的活躍程度，且根據(jù)mRNA 在高濃度和低濃度蔗糖溶液的比例、正在翻譯的mRNA 與總mRNA 之間的比例共同判斷細(xì)胞的活躍程度。

3.2 翻譯譜分析技術(shù)

有研究發(fā)現(xiàn)，若一條mRNA 結(jié)合過多的核糖體則易發(fā)生核糖體“堆積”，阻礙翻譯延伸，降低翻譯速率。然而，部分mRNA 雖只結(jié)合單個(gè)核糖體，但其翻譯狀態(tài)卻異常的活躍。如在公認(rèn)的翻譯活躍的HEK293 細(xì)胞和處于富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌中，其單核糖體組分占有主要地位［60-61］。將單核糖體單體分離并放置于無細(xì)胞翻譯體系中，其核糖體可以繼續(xù)翻譯生成蛋白質(zhì)［61］。這都說明翻譯的活躍程度與mRNA 上核糖體的數(shù)量并不總呈正相關(guān)，但只要mRNA 與核糖體結(jié)合即可表明其處于翻譯狀態(tài)［62］?；谠摾碚?，2013年張弓實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了RNC-RNA-Seq［3］，與多聚核糖體圖譜技術(shù)類似，利用超速離心的方法將正在翻譯的mRNA 與游離的mRNA 分離并對(duì)翻譯中的mRNA 測(cè)序建庫(kù)，不同的是RNC-RNA-Seq 是采用單一濃度蔗糖溶液（30%蔗糖溶液）將正在翻譯的mRNA 與游離的mRNA 分離。該技術(shù)通常與RNA-Seq 技術(shù)相結(jié)合，共同探究動(dòng)植物及細(xì)菌等在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控。例如，Luo 等［63］發(fā)現(xiàn)甜菜堿是通過調(diào)節(jié)基因的翻譯過程發(fā)揮降脂作用，其中Gpc1是降脂的關(guān)鍵基因；Zhang等［64］在膠質(zhì)母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LINC-PINT 可編碼多肽，且該肽可直接與聚合酶相關(guān)因子復(fù)合物（PAF1c）相互作用，抑制多種癌基因的翻譯過程，進(jìn)而抑制膠質(zhì)母腫瘤細(xì)胞的增殖。

與多聚核糖體圖譜相比，RNC-RNA-Seq 簡(jiǎn)化了分離RNC-mRNA 的程序，有效地解決了多聚核糖體圖譜技術(shù)中溶液體積大、RNC-mRNA 濃度低的問題［27］。此外，實(shí)驗(yàn)中得到的RNC-mRNA 仍保留翻譯活性，給予合適的緩沖液即可恢復(fù)翻譯能力［61］。不足的是RNC-RNA-Seq 依舊沒有辦法獲取mRNA內(nèi)部翻譯信息，且單一濃度的蔗糖溶液使得沉淀物中不僅包含脂筏、假多聚核糖體等［59］高分子量復(fù)合物，還含有核糖體的大小亞基、單核糖體等，增加了獲取mRNA 信息的難度。

由于RNC-RNA-Seq 探究的是細(xì)胞內(nèi)mRNA 分子是否進(jìn)行翻譯，對(duì)某個(gè)基因或細(xì)胞內(nèi)整體翻譯速率的水平還無法探知。但該技術(shù)與RNA-Seq 結(jié)合可共同分析翻譯過程中細(xì)胞整體或某個(gè)基因的翻譯水平。

3.3 核糖體圖譜技術(shù)

2009年由Weissman 課題組首次發(fā)表核糖體圖譜技術(shù)（Ribo-Seq）［65］，其利用核糖核酸酶I（ribonuclease I，RNase I）降解游離和不被核糖體保護(hù)的RNA 片段，并通過蔗糖梯度超速離心法獲取被核糖體保護(hù)的RNA 片段（ribosome footprints，RFPs），隨后去除核糖體，并將RNA 片段進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，最終獲取正在翻譯的RNA 信息。Ribo-Seq 的精度是單密碼子級(jí)別，可精準(zhǔn)獲取某基因內(nèi)部的翻譯信息，如核糖體分布位置、起始密碼子位置、程序性框移動(dòng)、uORF 等［66］。除Ribo-Seq 外，Pelechano 等［67］建立的5PSeq 技術(shù)也可以在單堿基分辨率下高通量捕獲核糖體的位置信息。因此，上述兩種技術(shù)在開放閱讀框（open reading frames，ORF）的發(fā)現(xiàn)、翻譯起始位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及翻譯暫停等方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)［62，65］。例如，Sotta 等［68］采用Ribo-Seq 確定了高粱全基因組中快速翻譯的閱讀框，檢測(cè)到4 843 個(gè)主開放閱讀框（main ORF，mORF），并發(fā)現(xiàn)許多未被注釋的翻譯事件；Van’t Spijker［69］在人類G4C2基因的上游內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)起始位點(diǎn)，且該基因在核糖體易位過程中出現(xiàn)停頓現(xiàn)象。

雖然Ribo-Seq 有諸多優(yōu)點(diǎn)，但其存在樣本需求量大、成本高且操作要求高等問題［62］。此外，Ribo-Seq 也存在一定的局限性。例如，RNase I 不會(huì)降解與核糖體結(jié)合且被RNA 結(jié)合蛋白保護(hù)的或雙鏈的RNA［70］，此類RNA 在實(shí)驗(yàn)中會(huì)被剔除，進(jìn)而遺漏部分正在翻譯的RNA 信息；該技術(shù)只分析與核糖體結(jié)合的區(qū)域，并不能獲得與翻譯調(diào)控相關(guān)的非翻譯區(qū)的信息［27］；實(shí)驗(yàn)通常只選取25-35 nt 的RFPs，而核糖體保護(hù)的RNA 片段長(zhǎng)度差異很大（通常為19-75 nt），忽略其他大小的RFPs 片段，易造成翻譯信息的缺失。因此我們還需要從不同方面不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，提出更加合理的實(shí)驗(yàn)方案。

通過Ribo-Seq，可以清楚地了解每條RNA 結(jié)合核糖體的數(shù)目、位置等信息，因此可以根據(jù)基因結(jié)合核糖體的數(shù)目初步判斷翻譯的活躍程度。此外，也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)計(jì)算整體或某基因的翻譯水平。

3.4 核糖體親和純化技術(shù)

核糖體親和純化技術(shù)（RAP）最早是由Gerbei課題組于2002年發(fā)表［27］，與其他翻譯組技術(shù)不同，利用親和純化以及組織特異性啟動(dòng)子可在目的細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)這兩大原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中難以分離的目的細(xì)胞進(jìn)行翻譯水平的探究。其在核糖體內(nèi)RPL25p 或RPL16a 蛋白的C 末端連接親和標(biāo)簽（如His、FLAG 和eGFP 等），這兩類蛋白可被組織特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)，純化后獲得過表達(dá)核糖體蛋白細(xì)胞系，隨后采用抗體與抗原特異性結(jié)合的原理將含有標(biāo)簽的RNC-mRNA 進(jìn)行分離，最后將被標(biāo)記的mRNA 進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)分析［24］。該技術(shù)在檢測(cè)組織中特異性表達(dá)的mRNA、細(xì)胞的分離和建系等方面有著舉足輕重的地位。例如，Heiman［71］在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)上千個(gè)在細(xì)胞中特異性表達(dá)的mRNA，這些mRNA 在RNA-Seq 中很難被檢測(cè)到；Corbacho［72］利用RAP 對(duì)斑馬魚細(xì)胞群中的核糖體進(jìn)行遺傳標(biāo)記，獲得基因在視網(wǎng)膜、骨骼肌、頜骨等組織中特異性表達(dá)的細(xì)胞系。

RAP 技術(shù)不需要對(duì)RNC-mRNA 進(jìn)行廣泛的固定、超速離心分離或酶消化，可以在最小體外刺激下保持較完整的翻譯中RNA 圖譜，而且可以準(zhǔn)確的定位在目的細(xì)胞，無需考慮來自其他組織、細(xì)胞的污染，獲得與該細(xì)胞表型相關(guān)性更高的數(shù)據(jù)信息。但實(shí)驗(yàn)流程繁瑣冗長(zhǎng)、成本昂貴，且不能獲得RNA的閱讀框位置、翻譯暫停區(qū)、uORFs 以及核糖體數(shù)量和位置等信息；此外，過表達(dá)核糖體蛋白會(huì)干擾正常生理狀況，攜有標(biāo)簽的核糖體的翻譯性能也與正常核糖體不同，因而不能準(zhǔn)確地反映正常生理狀況下的翻譯狀況［27］。

與RNC-RNA-Seq 相同，都不能獲取核糖體數(shù)目信息。因此，在計(jì)算整體或某基因的翻譯速率時(shí)都需要與RNA-Seq 數(shù)據(jù)相結(jié)合，共同分析細(xì)胞整體或單基因的翻譯水平。

4 總結(jié)與展望

中心法則闡述了遺傳信息從DNA 通過轉(zhuǎn)錄為RNA，再經(jīng)翻譯合成蛋白質(zhì)的基本生物學(xué)過程。蛋白質(zhì)是發(fā)揮生物學(xué)功能的實(shí)際執(zhí)行者，但其組成多樣、構(gòu)象復(fù)雜且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等都嚴(yán)重阻礙著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。翻譯速率是蛋白質(zhì)豐度的決定性因素，眾多學(xué)者通過mRNA 結(jié)合核糖體的數(shù)目判斷翻譯的快慢。事實(shí)上，該方法在一定條件下是準(zhǔn)確的；當(dāng)核糖體在mRNA 上“堆積”時(shí)，過多的核糖體則會(huì)阻礙mRNA 的翻譯，利用該方法評(píng)估m(xù)RNA 的翻譯速率是不準(zhǔn)確的。值得注意的是，并非高速的翻譯就能獲得最佳的表達(dá)效果，高速的翻譯會(huì)使多肽鏈錯(cuò)誤折疊的概率增加，進(jìn)而形成無活性、不可溶的包涵體。所以翻譯速率應(yīng)當(dāng)與蛋白質(zhì)的折疊速率相“匹配”，這其中必然存在著某些重要的調(diào)控因子調(diào)控著二者的速率，還需進(jìn)一步的挖掘和發(fā)現(xiàn)。當(dāng)前，從基因組到轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控機(jī)理研究得較為清楚，而從轉(zhuǎn)錄組到蛋白組的調(diào)控機(jī)理研究還非常薄弱，而翻譯組恰恰是連接轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的橋梁。因此，通過翻譯組探究正在翻譯的mRNA 已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。利用該技術(shù)可幫助我們清晰地了解細(xì)胞內(nèi)RNA 的翻譯狀態(tài)，有利于發(fā)現(xiàn)更多具有編碼能力的非編碼RNA，這為蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和分子生物學(xué)理論的補(bǔ)充和完善，對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展具有重要的意義。