付偉杰 鄺杰華 羅君 黃建盛 陳有銘 陳剛

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東藍(lán)糧種業(yè)有限公司，湛江 524000）

半乳糖凝集素（galectins）屬于糖結(jié)合蛋白家族中的一員，通過保守的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate binding domain，CRD）結(jié)合β-半乳糖苷類，不依賴Ca2+的活性，并具有多種生物活性功能，包括細(xì)胞遷移、凋亡、免疫反應(yīng)、炎癥細(xì)胞信號(hào)和神經(jīng)保護(hù)等［1-2］。半乳糖凝集素在進(jìn)化上是保守的，廣泛存在于從原始到高級(jí)的各種生物中，并在不同的組織與細(xì)胞中表達(dá)［3-5］。半乳糖凝集素主要位于細(xì)胞內(nèi)，也存在于細(xì)胞外，其缺乏一個(gè)N 端信號(hào)肽序列來引導(dǎo)它們通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行分泌，但可以通過非經(jīng)典途徑分泌到細(xì)胞外，從而具有細(xì)胞外功能［6］。此外，細(xì)胞內(nèi)的半乳糖凝集素參與細(xì)胞功能過程，如前體mRNA 剪接、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期過程［7-8］。半乳糖凝集素不但在微生物感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮潛在作用。迄今為止，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中鑒定出15 種半乳糖凝集素。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征、糖結(jié)合特異性和生物學(xué)功能，半乳糖凝集素可分為3 種類型：原型（Gale ctin-1、-2、-5、-7、-10、-11、-13、-14 及-15），含有一個(gè)CRD；串聯(lián)重復(fù)類型（Galectin-4、-6、-8、-9 和-12），包含兩個(gè)由連接肽連接不完全相同的CRD；嵌合體型（Galectin-3），由N 端的非凝集素結(jié)構(gòu)域和C 端的CRD 所組成［9-10］。

Galectin-8 是一種串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素，具有氨基酸序列相似性約35%的N 端糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（N-CRD）和C 端糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（C-CRD），并且兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中均含有保守基序H-NPR 與WG-EE［11］。Galectin-8 在先天性和適應(yīng)性免疫中具有重要作用。哺乳動(dòng)物Galectin-8 可以通過監(jiān)測(cè)核內(nèi)體和溶酶體的完整性來檢測(cè)入侵的細(xì)菌，然后激活抗菌自噬以保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)菌的感染［12］。據(jù)報(bào)道，半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的Galectin-8 對(duì)某些革蘭氏陰性菌病原體具有強(qiáng)大的殺菌活性，可直接破壞它們的膜和結(jié)構(gòu)［13］。Galectin-8 可促進(jìn)漿細(xì)胞的形成和調(diào)節(jié)其分化，并在促進(jìn)抗體產(chǎn)生的過程中起到附加和冗余作用［14-15］。Galectin-8 通過串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)與白細(xì)胞介素2 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 受體相互作用，促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖與分化［16］。此外，Galectin-8 被認(rèn)為是一種早期的腦保護(hù)劑，不僅能抑制炎癥信號(hào)，促進(jìn)抗氧化活性，還能減少β 淀粉樣蛋白寡聚化與神經(jīng)原纖維纏結(jié)沉淀，增強(qiáng)對(duì)阿爾茨海默病的預(yù)防作用［2］。目前，關(guān)于Galectin-8在硬骨魚類中的研究?jī)H見于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［17-18］、大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）［19］、黑巖魚（Sebastes schlegelii）［20］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［21］、鱖（Siniperca chuatsi）［22］和半滑舌鰨［13］，缺乏關(guān)于石斑魚Galectin-8的研究報(bào)道。

杉虎斑是由雌性褐點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）與雄性清水石斑魚（E.polyphekadion）雜交的子一代，具有雜交優(yōu)勢(shì)［23］。石斑魚具有營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，已在十幾個(gè)沿海國(guó)家中廣泛養(yǎng)殖［24］。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2019年全球石斑魚養(yǎng)殖總產(chǎn)值為820 794 707 美元，養(yǎng)殖總產(chǎn)量更是達(dá)234 828.45 t，其中中國(guó)的養(yǎng)殖產(chǎn)量最大，占總產(chǎn)量的78%，多達(dá)183 127 t［25］。然而，高密度的集約化養(yǎng)殖與不恰當(dāng)?shù)耐段箷?huì)損害魚類的免疫系統(tǒng)，使其易受病原體的感染［26］。研究報(bào)道，飼料中添加免疫刺激劑可以作為預(yù)防和治療水生動(dòng)物感染性疾病的有效措施。草本植物及其衍生物可作為一種廉價(jià)的抗生素替代物，可以提高魚類的免疫和生長(zhǎng)性能［27］。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）屬于天然的植物化學(xué)物質(zhì)，是一種低毒酚酸，可在植物界中廣泛獲得。阿魏酸具有多種生理活性功能，如抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒和保護(hù)肝臟等［28］。研究石斑魚的免疫相關(guān)基因和增強(qiáng)免疫的方法對(duì)于獲得高產(chǎn)量至關(guān)重要。因此，本研究運(yùn)用RACE 技術(shù)首次克隆出杉虎斑Galectin-8的全長(zhǎng)cDNA 序列，然后對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）分析Galectin-8mRNA 的組織特異性分布；此外，還研究了飼料中添加不同水平阿魏酸對(duì)Galectin-8基因表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步探究魚類免疫防御機(jī)制提供一定的依據(jù)，同時(shí)為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病暴發(fā)提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用杉虎斑幼魚購(gòu)自廣東湛江東簡(jiǎn)鎮(zhèn)石斑魚苗場(chǎng)，在湛江恒興南方海洋科技有限公司室內(nèi)1m3玻璃鋼桶中暫養(yǎng)馴化15 d，期間投喂石斑魚商品配合飼料。配制7 組添加不同水平FA 的等氮等脂試驗(yàn)飼料，F(xiàn)A 水平分別為0（對(duì)照組）、40、80、160、320、640 和1 280 mg/kg，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。暫養(yǎng)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚饑餓24 h，稱重后將初始體重為（9.55 ± 0.60）g 的試驗(yàn)魚分組，挑選大小基本一致且健康的試驗(yàn)魚，隨機(jī)分配到21 個(gè)玻璃鋼纖維桶中，養(yǎng)殖10周。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)7個(gè)處理組，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)1個(gè)0.5 m3的玻璃鋼纖維桶，每桶放30 尾魚。每天表觀飽食投喂2 次（8：00 和17：00），日投喂量約為石斑魚體重的3%-5%。試驗(yàn)用水為經(jīng)過沙濾和沉淀的天然海水，光照周期為自然光照，試驗(yàn)期間不間斷充氧氣，溶解氧量不低于6 mg/L，鹽度為29%，溫度范圍為25-30℃，pH 7.6-8.2，且氨氮和亞鹽含量不大于0.05 mg/L。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Ingredient composition and nutrient levels of the experimental diets

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚禁食24 h，采樣時(shí)使用丁香酚進(jìn)行麻醉。首先在對(duì)照組中進(jìn)行取樣，每桶隨機(jī)取3 尾魚，解剖分離得到腦、胃、肝臟、鰓、腸道、中腎、頭腎、心臟、脾臟、肌肉和皮膚。在其余的處理組中，每桶取3 尾魚進(jìn)行解剖獲得肝臟、腸道、脾臟及頭腎。各組織樣品收集于裝有RNA Later 的2 mL 無菌離心管中，液氮快速冷凍后置于-80℃超低溫冰箱中用于RNA 的提取。

1.2.2 RNA 提取及第一鏈cDNA 的制備 按照說明書，使用TranZol Up 試劑（TransGen）提取各組織總RNA。采用超微量分光光度計(jì)（SimpliNano，Biochrom，UK），在260 nm 條件下檢測(cè)RNA 的濃度，并用260 nm 與280 nm 的比值（范圍在1.8-2.1）測(cè)定其的純度。通過1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)提取的RNA 質(zhì)量。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen），在PCR 擴(kuò)增儀中設(shè)置42℃ 15 min；85℃ 5 s，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并保存于-80℃用于之后的基因克隆和RT-qPCR 分析。

1.2.3Galectin-8基因全長(zhǎng)cDNA 的克隆 從課題組的杉虎斑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出注釋為Galectin-8的Unigene，并在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)確定為魚類的Galectin-8基因片段。使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物Gal-8-F 和Gal-8-R 克隆中間片段，PCR 程序設(shè)置為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共循環(huán)35 次；72℃ 10 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（TransGen） 進(jìn)行目的片段切膠回收，并連接到pMD-18T Vector（TaKaRa），轉(zhuǎn)化到DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa）后，挑選出單克隆陽性菌落，隨后送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit（TaKaRa）的操作說明，并根據(jù)獲得的中間片段序列，分別設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物（Gal-8-5′GSP 和Gal-8-3′GSP）和兩個(gè)巢氏基因特異性引物（Gal-8-5′NGSP 和Gal-8-3′NGSP）。5′-RACE和3′-RACE cDNA 模板合成完后，進(jìn)行cDNA 5′端和3′端的擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化與測(cè)序。根據(jù)重疊部分將測(cè)序得到的5′端和3′端序列與中間片段序列進(jìn)行拼接，得到Galectin-8基因全長(zhǎng)cDNA 序列。引物序列詳見表2。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用ORF finder 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）來識(shí)別開放閱讀框序列（ORF）和預(yù)測(cè)氨基酸序列。應(yīng)用Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）（http://smart.embl-heidelberg.de）對(duì)Galectin-8 的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。信號(hào)肽和跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)分別使用signalIP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0） 和TMHMM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）。利用BLAST 程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/）對(duì)cDNA 序列和氨基酸序列進(jìn)行同源分析。通過DNAMAN 9.0 對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并用MEGA X 軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，bootstrap 值設(shè)置為1 000。多序列比對(duì)與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹所用的氨基酸序列見表3。采用SWISS-MODEL（http://www.swissmodel.expasy.org）程序進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（分子量、理論等電點(diǎn)和親水性）。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)分別采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html/） 和PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）。使用ExPASy 服務(wù)器的NetNGlyc 1.0 server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0） 和NetPhos 3.1server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分別進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。

表3 杉虎斑Galectin-8 氨基酸序列多重比對(duì)與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所用到的氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences used for multiple sequence alignment and phylogenetic tree construction for Galectin-8 from hybrid grouper

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)克隆獲得的cDNA 序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物Gal-8-RT-F 和Gal-8-RT-R（表2）。在LightCycler 96（Roche，Switzerland）儀器中進(jìn)行RT-qPCR，使用的是PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix（TransGen）試劑盒。10 μL 反應(yīng)體系包括5 μL 的2×PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix、0.5 μL 的正向引物、0.5 μL 的反向引物、0.5 μL 的cDNA和3.5 μL 的ddH2O（Double distilled water）。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 30 s（1 個(gè)循環(huán)）；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s（40 個(gè)循環(huán)）；95℃ 10 s，65℃ 60 s，95℃1 s（1 個(gè)循環(huán)）；37℃ 30 s（1 個(gè)循環(huán)）。通過Light-Cycler? 96 Software 分析熒光定量數(shù)據(jù)，獲得Cq 值。以β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。在統(tǒng)計(jì)分析之前，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了正態(tài)性和同質(zhì)性檢驗(yàn)，并使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間若有顯著性差異，采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。每個(gè)處理組均有3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-8基因cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析

杉虎斑Galectin-8基因的cDNA 全長(zhǎng)為1 368 bp（GenBank 登錄號(hào)：OL826837），其中5′非翻譯區(qū)（5′untranslated region，5′UTR）為16 bp，3′UTR 為394 bp，ORF 長(zhǎng)960 bp，共編碼319 個(gè)氨基酸，還包括一個(gè)典型的加尾信號(hào)序列（AATAAA）和一個(gè)長(zhǎng)為27 bp 的poly（A）尾巴（圖1）。Galectin-8 蛋白分子質(zhì)量為35.26 kD，理論等電點(diǎn)為7.65，總平均親水性為-0.149（親水），不穩(wěn)定系數(shù)為40.82（不穩(wěn)定）。TMHMM 2.0 和signalIP 5.0 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，杉虎斑Galectin-8 蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域與信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，Galectin-8 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌小泡的概率分別為60.9%、21.7%、8.7%、4.3%和4.3%。NetNGlyc 1.0 server 和NetPhos 3.1server 預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Galectin-8 蛋白含有1 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和29 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖1）。

SMART 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Galectin-8 蛋白含有兩個(gè)CRD，分別位于N 末端（15-150，136 aa）和C末端（187-319，133 aa），屬于串聯(lián)重復(fù)型，由序列長(zhǎng)為36 個(gè)氨基酸的連接肽（Linker peptide）連接。此外，在兩個(gè)CRD 上均鑒定出兩個(gè)與β-半乳糖苷類結(jié)合的保守基序，分別為 HXNPR 和WGXEE，其中X 表示任意氨基酸（圖1）。利用SWISS-MODEL對(duì)杉虎斑Galectin-8 蛋白進(jìn)行同源建模（圖2），發(fā)現(xiàn)與人的Galectin-8 三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，序列相似性為56.94%，GMQE 為0.78。其中，α- 螺旋占2.51%，β-轉(zhuǎn)角為8.46%，延伸鏈占33.86%，無規(guī)則卷曲為55.17%。

圖1 杉虎斑Galectin-8 的全長(zhǎng)cDNA 核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Full length cDNA nucleotide and deduced amino acid sequences of Galectin-8 in hybrid grouper

圖2 同源建模預(yù)測(cè)的Galectin-8 蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of Galectin-8 predicted by homology modeling

2.2 同源性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

杉虎斑與其他物種Galectin-8 的氨基酸序列同源性分析結(jié)果如圖3所示。通過NCBI 上blastp 比對(duì)，分別獲得杉虎斑Galectin-8 推斷的氨基酸序列與鞍帶石斑魚、許氏平鲉、藍(lán)鰭金槍魚、條石鯛、?魚、大西洋鮭、智人、原雞和熱帶爪蟾的一致性（表3），其中與鞍帶石斑魚的一致性最高，達(dá)到98.43%，許氏平鲉次之為82.61%，而與熱帶爪蟾的一致性最低為49.69%。同源性分析表明，Galectin-8 在不同動(dòng)物中均具有保守性。參與氨基酸多序列比對(duì)的各物種Galectin-8 均具有串聯(lián)重復(fù)半乳糖凝集素的典型結(jié)構(gòu)特征，包括一個(gè)N-CRD 和一個(gè)C-CRD，并且兩個(gè)CRD 均有兩個(gè)保守基序H-NPR 和WG-EE。

圖3 杉虎斑與其他物種 Galectin-8 氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of Galectin-8 amino acid sequences between hybrid grouper and other species

為了研究杉虎斑Galectin-8 與其他脊椎動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4），共包括20 個(gè)代表物種的氨基酸序列。結(jié)果表明，杉虎斑與其他硬骨魚類的Galectin-8 單獨(dú)聚為一支，爬行綱、兩棲綱、哺乳綱和鳥綱動(dòng)物的Galectin-8 各自聚為一支。杉虎斑Galectin-8 與鞍帶石斑魚具有最近的親緣關(guān)系，許氏平鲉次之，而與黃姑魚的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與爬行綱、兩棲綱、哺乳綱和鳥綱其他動(dòng)物的親緣關(guān)系相對(duì)更遠(yuǎn)。

圖4 鄰接法構(gòu)建Galectin-8 基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the amino sequences of Galectin-8 genes constructed by neighbour-joining method

2.3 杉虎斑Galectin-8基因組織表達(dá)分析

利用RT-qPCR 分析了Galectin-8在杉虎斑不同組織類型中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖5），Galectin-8在所有被檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，且其在不同組織中的表達(dá)水平不同。Galectin-8在脾臟中表達(dá)量最高，其次是中腎、心臟、腸道、肝臟、頭腎和鰓，而在腦、胃、皮膚和肌肉組織中的表達(dá)量相對(duì)較少。

圖5 杉虎斑Galectin-8 在各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expressions of Galectin-8 in the different tissues from hybrid grouper

2.4 飼料中添加不同水平阿魏酸對(duì)杉虎斑Galectin-8基因表達(dá)的影響

根據(jù)圖6可知，杉虎斑Galectin-8基因的表達(dá)受到阿魏酸（FA）的影響。隨著飼料中FA 水平的增加，Galectin-8表達(dá)量在肝臟、頭腎和脾臟中均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。FA 添加水平為40、80、160 和320 mg/kg 時(shí)，肝臟、頭腎和脾臟的Galectin-8表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組和高劑量添加組（640 與1 280 mg/kg）（P＜ 0.05）。在腸道中，與對(duì)照組相比，添加FA 會(huì)顯著上調(diào)Galectin-8的表達(dá)量，其中FA 水平為1 280 mg/kg 時(shí)表達(dá)量最高，并顯著高于其他組（P＜ 0.05）。

圖6 飼料阿魏酸不同添加水平對(duì)杉虎斑肝臟、腸道、頭腎和脾臟的Galectin-8 基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of dietary supplementation of ferulic acid（FA）on the relative mRNA expressions of Galectin-8 in the liver，intestine，head kidney and spleen of hybrid grouper

3 討論

凝集素是先天免疫系統(tǒng)中的重要的體液組成成分，具有一個(gè)或多個(gè)CRD，可作為模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），識(shí)別潛在致病細(xì)菌細(xì)胞表面上的病原體相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs），在先天免疫和抗病方面起著重要作用［17，29-31］。Galectin-8 具有多種功能，包括促進(jìn)漿細(xì)胞形成、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞增殖、腫瘤調(diào)控、凋亡誘導(dǎo)以及免疫調(diào)節(jié)［17］。本研究描述了杉虎斑Galectin-8的序列特征，檢測(cè)了其組織分布，并探究不同F(xiàn)A 水平對(duì)其表達(dá)量的影響。

人類Galectin-8基因通過可變剪接產(chǎn)生14 種不同的轉(zhuǎn)錄本，共編碼6 種蛋白質(zhì)，并且大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本具有短的5′UTR 和長(zhǎng)的3′UTR［11］。通過RACE 技術(shù)獲知杉虎斑Galectin-8基因的cDNA 全長(zhǎng)為1 368 bp，5′UTR 為16 bp，3′UTR 為394 bp，共編碼319個(gè)氨基酸。半乳糖凝集素家族成員不含信號(hào)肽序列，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，然而它們可通過非經(jīng)典途徑分泌到細(xì)胞外，如直接易位和細(xì)胞外囊泡中釋放，具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的功能［9，32］。此外，半乳糖凝集素的特定功能取決于其表達(dá)的細(xì)胞類型與在細(xì)胞或細(xì)胞外的定位，因此它們的分泌必須受到嚴(yán)格的調(diào)控才能正常發(fā)揮作用［33］。序列分析表明，杉虎斑Galectin-8 是一種分泌蛋白，但未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域與信號(hào)肽，主要位于細(xì)胞質(zhì)中。目前，半乳糖凝集素分泌的機(jī)制尚不清楚，為了對(duì)Galectin-8 的分泌有一個(gè)全面的了解，還需要進(jìn)一步的研究?；诮Y(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)杉虎斑Galectin-8 屬于串聯(lián)重復(fù)類型半乳糖凝集素，包含兩個(gè)由36 個(gè)氨基酸的連接肽所連接的CRD，位于蛋白質(zhì)序列的兩端。同時(shí)，CRD 結(jié)構(gòu)域中有兩個(gè)保守的基序，H-NPR 和WGEE，這與其他半乳糖凝集素家族成員一致［11］。翻譯后修飾分析顯示杉虎斑Galectin-8 中有1 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)和29 個(gè)預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)。在小鼠的Galectin-8 中已觀察到廣泛的翻譯后修飾，包括糖基化與磷酸化［34］。多重比對(duì)結(jié)果表明，在Galectin-8中兩個(gè)β-半乳糖苷類結(jié)合基序在進(jìn)化中是高度保守的；此外，雖然各物種的連接肽之間無序列同源性，但該區(qū)域中的氨基酸數(shù)量會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)大小的變化［20］。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，杉虎斑Galectin-8與其他硬骨魚類單獨(dú)聚為一支，其中與鞍帶石斑魚的親緣關(guān)系最近，而爬行類、兩棲類、哺乳類和鳥類動(dòng)物分別聚為一支。

在魚類中，已發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)［20］。本文中杉虎斑Galectin-8在檢測(cè)的組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在脾臟的表達(dá)量最高。這與先前的研究一致，羅非魚和牙鲆的Galectin-8也在脾臟中具有最高的表達(dá)量［18，21］。同時(shí)在頭腎和肝臟中，杉虎斑Galectin-8也有較高的表達(dá)。脾臟、頭腎和肝臟是魚類重要的免疫器官［35］。魚的脾臟也是一個(gè)重要的周圍淋巴器官，在抗原捕獲中起著關(guān)鍵作用，且與頭腎相比，脾臟是體液免疫反應(yīng)的主要器官［36］。頭腎類似于哺乳動(dòng)物的骨髓，具有造血功能，可負(fù)責(zé)吞噬、抗原處理以及IgM 的形成［37］。盡管脊椎動(dòng)物的肝臟傳統(tǒng)上被視為代謝、營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存和解毒中心，但它還是一個(gè)重要的免疫器官，產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體成分和急性時(shí)相蛋白以應(yīng)對(duì)病原體感染［38］。此外，杉虎斑Galectin-8在腦、鰓和腸道中有著相對(duì)較高的表達(dá)量。腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞可積極參與對(duì)損傷和致病性感染的快速應(yīng)答，而鰓和腸道屬于先天免疫系統(tǒng)中的物理屏障［36，39］。綜上所述，這些結(jié)果提示Galectin-8可能在杉虎斑的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用［13，18］。

免疫刺激劑是一種能增強(qiáng)防御機(jī)制或免疫系統(tǒng)（先天性和適應(yīng)性）的物質(zhì)，從而使動(dòng)物對(duì)疾病和外部脅迫有更強(qiáng)的抵抗力［40］。一些研究認(rèn)為，功能性飼料添加劑可以通過兩種方式激活水生動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)：（1）直接刺激先天免疫系統(tǒng)；（2）促進(jìn)共生微生物菌群的生長(zhǎng)。飼料添加劑對(duì)魚類的免疫刺激作用評(píng)估主要集中在非特異性免疫參數(shù)上［41］。FA 是一種有效的免疫刺激劑，并且被認(rèn)為是提高動(dòng)物免疫力和改善動(dòng)物生理?xiàng)l件的最重要的添加劑之一，這部分歸因于其抗氧化能力對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用［42-43］。本研究中，與對(duì)照組相比，飼料中添加FA 為40-320 mg/kg 時(shí)，腸道、肝臟、頭腎和脾臟的Galectin-8表達(dá)量顯著上調(diào)。類似地，金頭鯛（Sparus aurataL.）攝入含有NEXT ENHANCE?150（由香芹酚和百里香酚組成）的試驗(yàn)飼料后，Galectin-1在后腸的表達(dá)量顯著增加［44］；用添加椰棗提取物的飼料喂養(yǎng)歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）4 周后，巖藻糖結(jié)合凝集素的表達(dá)量顯著上調(diào)［45］。半乳糖凝集素轉(zhuǎn)錄水平的增加，能夠促進(jìn)微生物的識(shí)別和啟動(dòng)下游免疫反應(yīng)，如活化T 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、補(bǔ)體激活和白細(xì)胞募集［20］。因此，F(xiàn)A 能夠促進(jìn)Galectin-8基因的表達(dá)，這表明杉虎斑的先天免疫得到增強(qiáng)。然而，較高水平的FA（640 與1 280 mg/kg）對(duì)Galectin-8的表達(dá)量沒有顯著影響。有報(bào)道稱，長(zhǎng)期補(bǔ)充高濃度的免疫刺激劑可能會(huì)導(dǎo)致免疫抑制［46］。此外，Galectin-8 在杉虎斑中的免疫功能尚不清楚。因此需要進(jìn)一步的研究來闡明杉虎斑Galectin-8 的免疫調(diào)節(jié)功能，以確定其在防御病原體入侵中的作用。

4 結(jié)論

本研究克隆的杉虎斑Galectin-8 屬于串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素，N 端與C 端的CRD 由連接肽所連接，與鞍帶石斑魚具有同源性和高度的一致性，并廣泛表達(dá)于各種組織中，其中脾臟的表達(dá)量最高。飼料中添加FA 為40-320 mg/kg 時(shí)顯著上調(diào)腸道、肝臟、頭腎和脾臟的Galectin-8表達(dá)量，表明適量添加免疫刺激劑FA 能夠增強(qiáng)杉虎斑的先天性免疫。