牛鴻宇 舒倩 楊海君 顏智勇 譚菊，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128；3.湖南省長沙生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，長沙 410001）

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）易溶于水，是具有一定毒性的陰離子表面活性劑［1］。因其優(yōu)異的去污［2］、乳化［3］和發(fā)泡［4］能力被廣泛應(yīng)用于日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中，同時(shí)也是農(nóng)業(yè)殺蟲劑的重要成分之一［5］。然而其過量排放，會改變土壤理化性狀、影響土壤對重金屬的吸附、抑制動植物生物活性，并對人類健康產(chǎn)生較大危害［6］。因此，針對廢水中SDS 的處理備受關(guān)注。與傳統(tǒng)物理法（吸附［7-9］、電離輻射［10］）和化學(xué)法（催化［11-12］、氧化［13-16］）相比，生物法（植物修復(fù)［17］、微生物降解［18-21］）因高效、低成本和可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于廢水中SDS 的去除。

目前報(bào)道的SDS 降解菌，主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）［19-20，22-27］、不動桿菌屬（Acinetobacter）［28-30］、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）［20，25，31］、葡萄球菌屬（Staphylococcus）［32-34］、梭形桿菌屬（Fusobacterium）［33］、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）［17，33］、芽孢桿菌屬（Bacillus）［21，33-34］、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）［33］、氣單胞菌屬（Aeromonas）［20］、腸桿菌屬（Enterobacter）［20，35-36］、沙雷氏菌屬（Serratia）［18］、泛菌屬（Pantoea）［30］和放線細(xì)菌屬（Actinobacterium）［37］等。然而，已有的SDS 降解菌性能不穩(wěn)定，處理高濃度SDS 廢水的能力有限。

為克服以往菌株篩選方式和降解性能的不足，本團(tuán)隊(duì)嘗試從微生物菌群、復(fù)合菌系（微生物聯(lián)合體）中篩選出用于去除SDS 的高效降解菌。本研究以實(shí)驗(yàn)前期篩選保存的高效降解SDS 復(fù)合菌系SDS1 為菌源，從中篩選分離出對SDS 高效降解的菌株，開展菌株的鑒定和降解特性研究，考察菌株對SDS 的代謝途徑。研究結(jié)果豐富了SDS 降解微生物的菌種資源，拓寬了獲得SDS 降解菌種的渠道，以期為高濃度SDS 廢水的生物強(qiáng)化處理提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 SDS（化學(xué)純，含量≥98%，上海麥克林生化科技有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：配制濃度為10 g/L 的蛋白胨、10 g/L 的NaCl、5 g/L 的酵母膏，pH 7.0，加超純水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。固體培養(yǎng)基中加入18 g 瓊脂。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：配制濃度為0.5 g/L 的KH2PO4、0.5 g/L 的NH4Cl、0.005 g/L 的FeSO4·7H2O、1.0 g/L 的K2HPO4、0.1 g/L 的MgSO4·7H2O、0.5 g/L 的NaNO3，pH 7.0，加超純水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至80℃左右，搖勻，備用。固體培養(yǎng)基中加入18 g 瓊脂。

SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：稱取15 g 的SDS 用超純水溶解，在超凈工作臺中使用0.22 μm 濾膜過濾滅菌，制成濃度為15 g/L 的SDS 母液，按比例加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，配置濃度為100-1 500 mg/L 的SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基，搖勻，備用。

1.2 方法

1.2.1 SDS 降解菌的分離純化、馴化、穩(wěn)定性測定 取馴化后SDS1 的菌液進(jìn)行梯度稀釋，均勻涂布于SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)皿中長菌后，對菌株進(jìn)行多次分離和純化培養(yǎng)直至獲得單菌落。挑取單個菌落接種至LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，再轉(zhuǎn)接至SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基。不斷提高SDS 馴化濃度直至篩選到最高耐受濃度的降解菌。選擇馴化后降解SDS 濃度最高、降解率最大的SDS降解菌進(jìn)行傳代，在最高耐受濃度下的SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中傳代15 次，檢測每次傳代后SDS 的含量，以傳代15 次穩(wěn)定性好的降解菌作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2.2 SDS 降解菌16S rRNA 基因分子生物學(xué)鑒定 菌株的16S rDNA 測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，經(jīng)BLAST 軟件在基因數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中對獲得的序列進(jìn)行基本的局部比對分析，并使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［38］。

1.2.3 SDS 降解菌的降解特性研究

1.2.3.1 種子液的制備 將SDS 降解菌D2 接種于LB 液體培養(yǎng)基，30℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液在8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心8 min，棄去上清液，用已滅菌的生理鹽水洗滌2-3 次后，用無機(jī)鹽培養(yǎng)基將菌體重懸，并調(diào)整OD600為2.0，得到種子液。

1.2.3.2 菌株D2 降解性能影響因素 為分析菌株D2 降解SDS 的最適條件，利用單因素實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)溫度、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、鹽度（W/W）及外加氮源進(jìn)行研究。在100 mL 錐形瓶中配制1 200 mg/L 的SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基，以SDS 為底物添加量8%（V/V），培養(yǎng)基裝液量50%（V/V），接菌量2%（V/V），搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 為條件，探究培養(yǎng)溫度（15、20、25、30、35、40℃）、初始pH（5、6、7、8、9、10）、培養(yǎng)時(shí)間（8、16、24、32、40、48 h）、鹽度（W/W）（0.01%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%、2%）、外加氮源（氯化銨、硝酸鈉、脲素、蛋白胨）對D2降解SDS 的影響，并測定搖瓶中最終剩余SDS 含量，確定最適環(huán)境條件。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)，以不接種降解菌的SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對照。

1.2.3.3 降解菌正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)條件并驗(yàn)證。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)，以不接種降解菌的SDS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對照。

1.2.4 降解菌代謝產(chǎn)物的提取與檢測

1.2.4.1 代謝產(chǎn)物的提取 降解菌在SDS 初始濃度1 200 mg/L，溫度30℃，pH 7，鹽度0.1%（W/W），接菌量2%（V/V），裝液量50%（V/V），搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 的條件下培養(yǎng)。分別在12、24、36、48 h后取樣50 mL，用于代謝產(chǎn)物的分析。以不接種降解菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對照。

1.2.4.2 代謝產(chǎn)物的檢測 采用離子色譜法檢測硫酸鹽［39］。取1.2.4.1 中培養(yǎng)液10 mL，過0.22 μm 水系濾膜，采用離子色譜儀分析。色譜柱為SH-AC-11（250 mm×4.6 mm），淋洗液15.0 mmol/L NaOH 溶液，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積25 μL，壓力3.6 MPa，柱溫35℃，抑制電導(dǎo)檢測器，電流75 mA。

采用氣相色譜法檢測1-十二烷醇［40］和十二烷醛［41］。取1.2.4.1 中培養(yǎng)液10 mL，進(jìn)行氣相色譜分析。色譜柱為RTX-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱，固定相為5%（V/V）二苯基和95%（V/V）二甲基聚硅氧烷，檢測器為FID 氫火焰離子化檢測器，進(jìn)樣量1 μL。分析條件為180℃保留5 min，15℃/min 升溫至230℃，保留時(shí)間1 min，進(jìn)樣口溫度230℃，分流模式，分流比為5，檢測器溫度250℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min。

采用液相色譜法檢測十二烷酸［42］和乙酸［43］。分別取1.2.4.1 中培養(yǎng)液1 mL，過0.22 μm 濾膜后采用液相色譜儀分析。十二烷酸采用waters 液相色譜儀、C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）和紫外檢測器（240 nm）檢測，流動相為80%（V/V）甲醇和20%（V/V）水，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，乙酸采用島津液相色譜儀、HPX-87H 色譜柱（300 mm×7.8 mm）和紫外檢測器（210 nm）檢測，流動相為5 mmol/L 的H2SO4溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫為55℃。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2016 與SPSS 25.0 進(jìn)行單因素分類方差分析、主體間效應(yīng)檢驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Origin 2018 進(jìn)行制圖，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 降解菌的篩選與馴化

從復(fù)合菌系SDS1 中分離純化得到一株SDS 降解菌命名D2，經(jīng)梯度馴化后，該菌株48 h 內(nèi)對1 200 mg/L SDS 的降解率達(dá)到90.3%（圖1）。D2 在初始濃度為1 200 mg/L 的SDS 無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基中傳代15 次（圖2），每次傳代D2 對SDS 的降解率均在90%以上，至15 次傳代后，菌株的降解率達(dá)94.2%。

圖1 初始濃度下菌株D2 對SDS 的降解率Fig.1 Degradation rate of SDS by strain D2 under initial concentrations

圖2 菌株D2 各傳代對SDS 的降解率Fig.2 Degradation rate of SDS by each generation of strain D2

2.2 菌株D2的鑒定

2.2.1 形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果 菌株D2 為革蘭氏陽性菌（圖3-A），其在LB 固體培養(yǎng)基平板上呈球形，淡黃色，多聚排列，不產(chǎn)生色素。菌落無光澤，易挑取，不透明，中間隆起，邊緣整齊，一般濕潤，不黏稠，質(zhì)地均勻無氣味（圖3-B）。菌株D2 的生理生化特征如表1所示。

圖3 菌株D2 菌落特征Fig.3 Colony characteristics of D2 strain

表1 菌株D2 的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of D2 strain

2.2.2 16S rRNA 序列分析 菌株D2 的16S rRNA 序列（GenBank 登錄號：OM 618123）與GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的16S RNA 序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果（表2）顯示，菌株D2 與Paraburkholderia tropica具有極高的同源性（99.93%）。構(gòu)建菌株D2 的相似序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），表明D2 與多株伯克霍爾德菌處在同一分支。同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步判斷D2 為帕拉伯克霍爾德菌（Paraburkholderia tropica）。

圖4 菌株D2 及其相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain D2 and its related strains

表2 D2 菌株16S rRNA 基因序列分析鑒定Table 2 Identification of D2 strain by 16S rDNA gene sequence analysis

2.3 菌株D2的降解特性分析

2.3.1 溫度對菌株D2 降解SDS 的影響 菌株D2 降解SDS 的最適溫度為30℃，48 h 內(nèi)對SDS 降解率達(dá)到95.8%。而當(dāng)溫度≤15℃或≥40℃時(shí)，D2 對SDS 降解率均低于40%（圖5-A）。不同溫度條件下，SDS 降解率的顯著差異表明溫度對D2 降解SDS 的能力有顯著影響（P＜0.05）。此外，在25-35℃之間，D2 對SDS 降解率均在80%以上，說明D2 在25-35℃范圍內(nèi)具有降解SDS 的能力。

2.3.2 pH 對菌株D2 降解SDS 的影響 不同初始pH條件下，SDS 降解率之間存在顯著差異，偏酸性和偏堿性實(shí)驗(yàn)條件下SDS 的降解率較低（均＜40%），pH 6-8 時(shí)，菌株D2 對SDS 降解率均在86.5%以上，其中當(dāng)pH=7 時(shí)，降解率達(dá)到最大值95.0%（圖5-B），說明初始pH 對菌株D2 降解SDS 的能力有顯著影響（P＜0.05）。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對菌株D2 降解SDS 的影響 如圖5-C 所示，培養(yǎng)時(shí)間對菌株D2 降解SDS 影響較大，相關(guān)性分析顯示，培養(yǎng)時(shí)間與SDS 降解率之間存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），當(dāng)培養(yǎng)至48 h 時(shí)，D2 對SDS 的降解率達(dá)到最大值95.5%，故以48 h 為最佳培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.4 鹽度對菌株D2 降解SDS 的影響 當(dāng)鹽度為0.01%-0.05%（W/W）時(shí)，D2 對SDS 的降解率均在80%以上，遠(yuǎn)高于其他鹽度條件下SDS 的降解率（均＜20%），其中鹽度為0.05%（W/W）時(shí)，降解率達(dá)到最大值93.9%（圖5-D）。不同鹽度條件下，SDS 降解率的顯著差異表明鹽度對D2 降解SDS 的能力有顯著影響（P＜0.05），同時(shí)也表明該菌株在鹽度0.01%-0.05%的范圍內(nèi)，均可實(shí)現(xiàn)對SDS 的高效降解。

2.3.5 氮源對菌株D2 降解SDS 的影響 在SDS 初始濃度1 200 mg/L，溫度30℃，pH 7，鹽度0.05%（W/W），裝液量50%（V/V），接菌量2%（V/V），搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 的條件下培養(yǎng)48 h，以硝酸鈉和氯化銨為氮源，D2 對SDS 的降解率達(dá)到最高值96.1%，而以氯化銨、硝酸鈉、脲素、蛋白胨分別作為唯一外加氮源時(shí)，D2 對SDS 的降解率均小于60%（圖5-E），故以硝酸鈉和氯化銨為最佳氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 環(huán)境因素對菌株D2 降解SDS 的影響Fig.5 Effects of environmental factors on the degradation of SDS by strain D2

2.3.6 菌株D2 降解SDS 的正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對D2 降解SDS 影響最大的溫度、pH、時(shí)間、鹽度四因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個因素設(shè)置3 個水平（表3）。D2 降解SDS 的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。D2 降解SDS 的最佳環(huán)境條件組合為A2B2C3D2，即溫度30℃、pH 7、時(shí)間48 h、鹽度0.1%（W/W）。根據(jù)R值的大小可知，各因素對D2降解SDS 的影響大小依次為：溫度＞時(shí)間＞pH＞鹽度。在SDS 初始濃度為1 200 mg/L，溫度30℃，pH 7，鹽度0.1%（W/W），接菌量2%（V/V），裝液量50%（V/V），搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，外加氮源為硝酸鈉和氯化銨的條件下培養(yǎng)48 h，D2 對SDS 的降解率可達(dá)到98.3%。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Orthogonal experimental design

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental results

2.4 菌株D2降解SDS代謝產(chǎn)物檢測及代謝途徑推測

2.4.1 菌株D2 降解SDS 的離子色譜檢測結(jié)果 離子色譜檢測結(jié)果（圖6）顯示，空白樣品中有硫酸根檢出，這主要是菌株D2 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基本身就含硫酸鹽。菌株D2 對SDS 降解培養(yǎng)基在12.447-14.957 min 處均檢測到硫酸鹽，且硫酸鹽的含量隨著降解時(shí)間的延長而增大。在12 h 檢出的硫酸鹽含量與空白樣品檢出的硫酸鹽含量基本一致。

圖6 菌株D2 降解SDS 的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatograms of degrading SDS by strain D2

2.4.2 菌株D2 降解SDS 的氣相色譜檢測結(jié)果 氣相色譜檢測結(jié)果（圖7）顯示，在12 h 時(shí)，菌株D2對SDS 的降解培養(yǎng)基中均未檢測到1-十二烷醇和十二烷醛，而在24、36、48 h 時(shí)，在3.737-3.761 min 處檢測到1-十二烷醇，在3.243-3.263 min 處檢測到十二烷醛。在24 h 時(shí)，檢測到的1-十二烷醇和十二烷醛含量均小于在36 h 時(shí)檢測到的含量；在48 h 時(shí)，檢測到的1-十二烷醇和十二烷醛含量也均小于36 h 時(shí)兩種物質(zhì)的檢測含量。

圖7 菌株D2 降解SDS 的氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatograms of degrading SDS by strain D2

2.4.3 菌株D2 降解SDS 的液相色譜檢測結(jié)果

2.4.3.1 十二烷酸液相色譜檢測 十二烷酸液相色譜檢測結(jié)果（圖8）顯示，在12 h 時(shí)，菌株D2 對SDS 的降解培養(yǎng)基未檢出十二烷酸，而在24、36、48 h 時(shí)，均在25.777-25.957 min 處檢測到十二烷酸，且在36 h 時(shí)D2 對SDS 的降解培養(yǎng)基中檢測到的十二烷酸含量均大于24 h 和48 h。

圖8 菌株D2 降解SDS 的十二烷酸液相色譜圖Fig.8 Dodecanoic acid liquid chromatograms of degrading SDS by strain D2

2.4.3.2 乙酸液相色譜檢測 乙酸液相色譜檢測結(jié)果（圖9）顯示，在12 h 和24 h 時(shí)，菌株D2 對SDS 的降解培養(yǎng)基中均未檢測到乙酸，而在36 h 和48 h 時(shí)，均在25.702-25.829 min 處檢測到乙酸，且在36 h 時(shí)，檢測到的乙酸含量均大于24 h 和48 h。

圖9 菌株D2 降解SDS 的乙酸液相色譜圖Fig.9 Acetic acid liquid chromatograms of degrading SDS by strain D2

2.4.4 菌株D2 對SDS 的代謝途徑的推測 通過離子色譜、氣相色譜、液相色譜對菌株D2 在濃度為1 200 mg/L SDS 的降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、24、36、48 h 后的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測與分析發(fā)現(xiàn)，在12 h 的降解培養(yǎng)基中檢測到的硫酸根為原培養(yǎng)基所自帶，未檢測到其它新物質(zhì)；而在24 h 則檢測到硫酸鹽、1-十二烷醇、十二烷醛、十二烷酸4 種物質(zhì)，且該時(shí)段硫酸根含量大于12 h；在36 h 和48 h 均檢測到硫酸鹽、1-十二烷醇、十二烷醛、十二烷酸、乙酸5 種物質(zhì)，不同的是各物質(zhì)含量發(fā)生了變化。由此可推測出D2 對SDS 可能存在的降解途徑如圖10所示。

圖10 菌株D2 對SDS 的降解途徑Fig.10 Degradation pathway of SDS by strain D2

3 討論

3.1 菌株D2對SDS降解能力

SDS 作為一種主要的陰離子表面活性劑，在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)大量高濃度SDS 廢水的排放也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題［2］。微生物降解已成為SDS 廢水處理的主要研究方向，Othman 等［18］篩選的降鉬細(xì)菌黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）DRY6，可在10 d 內(nèi)完全去除1 000 mg/L 的SDS。顏丙花等［37］篩選的降解菌PB-21，72 h 降解了90.0%的SDS（初始濃度400 mg/L）。Shukor［44］篩選的產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）DRY14，72 h 完全降解了1 000 mg/L 的SDS。上述降解菌對SDS 降解初始濃度較低，降解效率有待提高。為克服以上不足，研究者們進(jìn)一步篩選更高效降解SDS 的菌株，并研究如何進(jìn)一步提高它們的降解能力。Ibrahim 等［20］篩選的假單胞菌（Pseudomonas）傳代10 次即可獲得降解率穩(wěn)定的菌株，Ambily 等［45］篩選的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）MTCC10311 可在48 h 降解96% 的1 500 mg/L SDS，張若木［46］篩選的PseudomonasSDS-Zh2在最佳條件下24 h 可降解1 500 mg/L 的SDS。

目前已經(jīng)分離出多株有效降解SDS 的菌株，但尚未見到關(guān)于Paraburkholderia屬菌株降解SDS 的相關(guān)報(bào)道。本研究分離得到一株具有SDS 降解能力的菌株D2，通過對D2 進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及生物學(xué)分析，鑒定該菌株為帕拉伯克霍爾德菌（Paraburkholderia tropica）（GenBank 登錄號：OM 618123）。對分離得到的菌株D2 降解SDS 的影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，初代菌株D2 對濃度為1 200 mg/L 的SDS 降解率達(dá)90.3%，其傳代15 次，降解率穩(wěn)定在（94±1）%，說明D2 對SDS 的降解具有穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)菌株D2 對環(huán)境抗逆性較好，如當(dāng)溫度在25-35℃范圍內(nèi)，菌株D2 對SDS 的降解率超過80%。此外，當(dāng)初始pH 在6-8 范圍內(nèi)，菌株D2 仍可以維持較高的降解率。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)條件。條件優(yōu)化后，菌株D2 在48 h 對初始濃度1 200 mg/L SDS 的降解率達(dá)到98.3%。菌株D2 的發(fā)現(xiàn)為SDS 的生物降解提供了新資源。

3.2 菌株D2對SDS的代謝途徑

SDS 的細(xì)菌降解涉及多種酶的相互作用［3］，細(xì)菌對SDS 的降解主要由烷基硫酸酯酶促發(fā)，其大致過程為烷基硫酸酯酶催化SDS 分子中酯鍵的斷裂水解，釋放出硫酸鹽和長鏈醇（主要為1-十二烷醇），長鏈醇一部分通過中樞代謝途徑被吸收，另外一部分被醇脫氫酶進(jìn)一步氧化為十二烷醛，十二烷醛被醛脫氫酶進(jìn)一步氧化成十二烷酸，十二烷酸不斷通過β-氧化斷裂成短鏈酸，繼續(xù)轉(zhuǎn)變成乙酸，最終轉(zhuǎn)化為CO2和H2O［6］。SDS 微生物降解的實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng)，SDS 通過某種方式進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，刺激微生物產(chǎn)生某種特殊的酶，在細(xì)胞內(nèi)與SDS 分子反應(yīng)，以酶的作用在一定程度上減少或消除SDS 的毒性［18］。

目前SDS 的微生物降解途徑有以下4 種：（1）途徑A，SDS 酯鍵的斷裂水解產(chǎn)生硫酸鹽和1-十二烷醇。Marches［47］利用氣相色譜儀檢測到菌株P(guān)seudomonasC12、ATCC 19151、BPS 的代謝產(chǎn)物1-十二烷醇，并推斷這3 種菌的代謝途徑為SDS →硫酸鹽+1-十二烷醇。John 等［48］則利用液相色譜儀檢測出香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）S5 對SDS 的降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了降解過程的中間產(chǎn)物1-十二烷醇，并推測S5 的代謝途徑為SDS →硫酸鹽+1-十二烷醇，但S5 對SDS 降解是否能最終礦化成CO2和H2O，尚待進(jìn)一步研究。（2）途徑B，SDS 酯鍵的斷裂水解產(chǎn)生硫酸鹽和1-十二烷醇，1-十二烷醇被氧化為十二烷醛。Panasia 等［27］通過檢測分析P.aeruginosaPAO1 對SDS 降解全過程的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了中間產(chǎn)物1-十二烷醇、十二烷醛，由此可推斷該菌的代謝途徑為SDS →硫酸鹽+1-十二烷醇→十二烷醛，該菌沒有完全礦化SDS。（3）途徑C，由SDS 酯鍵的斷裂水解產(chǎn)生硫酸鹽和1-十二烷醇，1-十二烷醇部分被氧化為十二烷醛，十二烷醛部分被進(jìn)一步氧化成十二烷酸，十二烷酸不斷通過β-氧化斷裂成短鏈酸（乙酸），乙酸最后礦化為CO2和H2O。Ambily 和Jisha［45］利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析P.aeruginosaMTCC10311 降解SDS 的代謝產(chǎn)物，在12 h 時(shí)檢測到了1-十二烷醇，而在24 h 時(shí)檢測到了十二烷醛和十二烷酸，48 h 后則檢測到了己酸、丙酸、乙酸等短鏈酸，該菌對SDS 的降解途徑為SDS →硫酸鹽+1-十二烷醇→十二烷醛→十二烷酸→乙酸→CO2+H2O，由此可推斷該菌可完全礦化SDS。（4）途徑D，SDS 在烷基硫酸脂酶作用下產(chǎn)生1-十二烷醇、硫酸根、2-十二烷醇和3-十二烷醇，且部分1-十二烷醇在醇脫氫酶作用下產(chǎn)生十二烷醛。Furmanczyk 等［22］利用SPME-氣相色譜-質(zhì)譜儀檢測月桂酰硫酸假單胞菌（Pseudomonas laurylsulfatovorans）AP3 22 對SDS 的降解產(chǎn)物，檢測到大量的1-十二烷醇，及微量的十二烷醛、2-十二烷醇和3-十二烷醇，但未檢測到十二烷酸，由此可推斷該菌對SDS 的降解途徑為SDS →硫酸鹽+1-十二烷醇（產(chǎn)生十二烷醛）+2-十二烷醇和3-十二烷醇。

降解過程中發(fā)現(xiàn)，菌株D2 在12 h 對SDS 的降解未進(jìn)行或剛開始，在24、36、48 h 時(shí)均對SDS 有降解效果，根據(jù)氣相色譜檢測結(jié)果推斷，在36-48 h 1-十二烷醇被不斷代謝成十二烷醛，而十二烷醛也被不斷代謝成下游產(chǎn)物十二烷酸，48 h 檢測到的乙酸含量比36 h 低，這可能是部分乙酸已被礦化成CO2和H2O。本研究中菌株D2 對SDS 的降解途徑與途徑C 完全一致。但菌株D2 可以實(shí)現(xiàn)更高程度的SDS 生物降解和礦化，擁有良好的應(yīng)用潛能，可進(jìn)一步挖掘，但在菌株D2 對SDS 的降解過程中具體有哪些酶參與到代謝中尚不十分清楚，有待進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié)論

從復(fù)合菌系SDS1 中分離得到一株能高效降解SDS 的菌株D2，并確定該菌株為帕拉伯克霍爾德菌。D2 菌株48 h 內(nèi)對SDS 的降解率可達(dá)90.03%，其降解SDS 的最適條件為溫度30℃、pH 7、培養(yǎng)時(shí)間48 h、鹽度0.1%。在此條件下，以硝酸鈉+氯化銨為外加氮源，D2 對初始濃度1 200 mg/L 的SDS 降解率達(dá)到98.3%以上。初步推測D2 對SDS 的代謝途徑為SDS →硫酸鹽+1-十二烷醇→十二烷醛→十二烷酸→乙酸→CO2+H2O。