崔瀟婷 洪偉鳴 王榕 許瑞

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇泰州 225300）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)作為我國(guó)畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)已發(fā)展到一個(gè)新高度，然而現(xiàn)在的養(yǎng)殖業(yè)不同于傳統(tǒng)的養(yǎng)殖，是一個(gè)高密度、產(chǎn)業(yè)化的過(guò)程[1]。而腹瀉是常見病，會(huì)影響畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至?xí)：ι绻患皶r(shí)防治，會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)相當(dāng)大的損失。細(xì)菌性腹瀉十分常見，發(fā)生的頻率比較高，是畜禽腹瀉的主要因素[2]。目前在臨床上治療腹瀉的藥物有很多，但大部分都用抗生素類藥物進(jìn)行治療。抗生素的殘留會(huì)使病原菌的耐藥性增加，菌群失調(diào)的現(xiàn)象也隨之出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。另外抗生素被動(dòng)物吸收后，會(huì)殘留在體內(nèi)，可直接通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，影響了人類的健康，也帶來(lái)食品安全問(wèn)題。雖然其療效確切，但是長(zhǎng)期大量使用抗生素的弊端也逐漸凸現(xiàn)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也出臺(tái)了養(yǎng)殖禁用藥的相關(guān)政策法規(guī)[3]。因此，推行無(wú)抗養(yǎng)殖理念刻不容緩，人們開始積極探索治療畜禽腹瀉的中草藥，以期從源頭上解決抗生素殘留的問(wèn)題，同時(shí)既能保護(hù)動(dòng)物，又能避免引起公共危害。根據(jù)中獸醫(yī)辨證論治的原則，復(fù)方止瀉膠囊以白頭翁湯為基礎(chǔ)進(jìn)行科學(xué)組方及處方篩選研制出的一種中藥復(fù)方制劑，以清熱解毒、涼血止痢作為立方依據(jù)，主治畜禽濕熱瀉痢型腹瀉[4-6]。該文主要對(duì)常見致病菌沙門氏菌的抑菌效果進(jìn)行研究，為復(fù)方止瀉膠囊后續(xù)大規(guī)模的生產(chǎn)及最終的藥效學(xué)評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑

復(fù)方止瀉膠囊自制；氯化鈉注射溶液購(gòu)自南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司；MH 肉湯培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；慶大霉素原料藥購(gòu)自湖北新和醫(yī)藥有限公司。

1.2 儀器

BBS-SDC 超凈工作臺(tái)（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；WGZ-2XJP 細(xì)菌濁度儀（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；SPX-150 生化培養(yǎng)箱（蘇州科思洛工業(yè)設(shè)備有限公司）；ZY-300G 鋼管放置器（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司）；XFH-75CA 電熱式壓力蒸汽滅菌器（深圳市鼎鑫實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；XS105 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；DZ-1B1恒溫真空干燥箱（天津泰斯特儀器公司）；TopPette 手動(dòng)單道移液器式移液槍（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）。

1.3 試驗(yàn)菌株

沙門氏菌由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院省生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

體重（20±2g）純昆明種小鼠，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各一半，根據(jù)性別分籠飼養(yǎng)。動(dòng)物房溫度為（20±2）℃，濕度為（60±5）%，環(huán)境保持安靜沒(méi)有噪聲。

2 方法

2.1 菌液、受試藥液的制備

菌液制備：按照無(wú)菌操作的要求，用接種環(huán)從冷凍保存的沙門氏菌斜面上取一環(huán)菌苔接種到MH 肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中20h，然后用MH 肉湯培養(yǎng)基稀釋，配制濃度為1×107CFU/mL 的菌液，放到4℃的冰箱中備用。

復(fù)方止瀉膠囊溶液的制備：稱取50g 復(fù)方止瀉膠囊內(nèi)容物，加入100mL 無(wú)菌蒸餾水，充分研磨使溶解，然后低溫濃縮至50mL，即獲得藥物濃度為1g/mL 的試驗(yàn)藥物。用微孔濾膜濾過(guò)，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 牛津杯抑菌試驗(yàn)

操作之前，將MH 培養(yǎng)基加熱溶化后置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行保溫，設(shè)置溫度為50℃。吸取20mL 培養(yǎng)基到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，制備5 個(gè)平板，冷卻20min，等到瓊脂凝固后更換干燥的陶瓦蓋。用移液槍往每個(gè)平板上加200μL 沙門氏菌菌液，用滅菌的涂布棒使菌液攤布均勻。涂布結(jié)束后將平板放置到36℃的恒溫培養(yǎng)箱中保溫15min，讓菌液慢慢滲透，平板表面也變得干燥。

取出來(lái)后，每個(gè)平板用鋼管放置器等距離均勻放入4 個(gè)滅菌的牛津杯，靜置10min。牛津杯在培養(yǎng)基內(nèi)下沉穩(wěn)定后，分別加入滅菌生理鹽水溶液200μL、慶大霉素溶液（100mg/mL）200μL、復(fù)方止瀉膠囊溶液（1000mg/mL）200μL、復(fù)方止瀉膠囊溶液（500mg/mL）200μL，放到36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h。為了避免培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，培養(yǎng)過(guò)程中盡量不要開啟培養(yǎng)箱。培養(yǎng)好后，打開陶瓦蓋，將牛津杯倒入消毒液中，用玻璃蓋替代陶瓦蓋。棄去破圈或者圓不完整的平板，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，求平均值。

2.3 藥物MIC 測(cè)定

采用試管二倍連續(xù)稀釋法。取30 支無(wú)菌試管，每批用10 支，編號(hào)1～10，按照順序排列在試管架上，做3 批試驗(yàn)。

分別往每支試管中加入無(wú)菌的LB 液體培養(yǎng)基5mL。1 號(hào)管加入濃度200mg/mL 的復(fù)方止瀉膠囊的溶液5mL，混合均勻后，吸取5mL 放入2 號(hào)試管，充分混合均勻后，再吸取5mL 放入3 號(hào)試管，如此稀釋到8 號(hào)試管，8 號(hào)管混合均勻后吸取5mL 棄去。稀釋之后1～8 號(hào)試管的濃度分別為：100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.125、1.56 和0.78mg/mL。9 號(hào)管做陽(yáng)性對(duì)照，10 號(hào)管做陰性對(duì)照。1～9 號(hào)管分別用移液槍吸取0.1mL 的菌液，10 號(hào)管不加菌液加藥液。

放到恒溫培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18～24h，觀察試管中的渾濁結(jié)果。根據(jù)培養(yǎng)基渾濁的情況來(lái)判斷有沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，渾濁說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)。試管內(nèi)清澈不出現(xiàn)渾濁的最高稀釋管的濃度為復(fù)方止瀉膠囊的最小抑菌濃度（MIC），也是沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度。

2.4 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

進(jìn)行菌液致死劑量的預(yù)試驗(yàn)，將復(fù)蘇后的沙門氏菌菌液稀釋不同的濃度。每只小鼠注射劑量為0.5mL，觀察3d，引起小鼠80%～100%死亡的細(xì)菌濃度是4×108CFU/mL，此濃度作為沙門氏菌對(duì)小鼠的攻毒劑量[7]。

取健康無(wú)傷的昆明小白鼠100 只，雌雄各一半。隨機(jī)分為5 組，每組20 只，雌雄各一半。前3 組為復(fù)方止瀉膠囊藥物試驗(yàn)組，設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組，劑量分別是20、15、10g/kg·bw。試驗(yàn)4 組為感染對(duì)照組，試驗(yàn)5 組為正常對(duì)照組。

前3 組灌胃給藥，采用等體積不同濃度，每次0.4mL，持續(xù)3d，每天上下午各一次。試驗(yàn)4 組和5組注射同等體積的生理鹽水。第4d，除了第5 組正常對(duì)照組不注射菌液，其他4 組給每只小鼠腹腔注射濃度為4×108CFU/mL 的沙門氏菌菌液0.5mL，第5 組注射0.5mL 的生理鹽水。再繼續(xù)灌胃3d，觀察感染沙門氏菌后小鼠的死亡數(shù)。統(tǒng)計(jì)各組的死亡情況，計(jì)算成活率。

3 結(jié)果

3.1 牛津杯抑菌試驗(yàn)

牛津杯抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1。體外抑菌敏感程度根據(jù)抑菌圈的直徑來(lái)進(jìn)行判斷，標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)抑菌圈為不敏感，小于10mm 為低度，10～15mm 為中度，大于15mm 以上為高度[8]。由結(jié)果可知，慶大霉素對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑為22.36mm，1000mg/mL 復(fù)方止瀉膠囊溶液對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑達(dá)到17.98mm，雖然沒(méi)有抗生素的抑菌效果好，但是也達(dá)到高度敏感的程度。500mg/mL 復(fù)方止瀉膠囊溶液的抑菌效果也達(dá)到中度敏感的效果，說(shuō)明復(fù)方止瀉膠囊的抑菌效果較好。

表1 抑菌圈直徑

3.2 藥物MIC 測(cè)定

藥物MIC 測(cè)定結(jié)果見表2。與10 號(hào)陰性對(duì)照管比較，三個(gè)批次樣品的4 號(hào)管清澈、5 號(hào)管顏色剛變渾，表明5 號(hào)管有少量的細(xì)菌生長(zhǎng)，4 號(hào)管此時(shí)的試管濃度是12.5mg/mL。說(shuō)明復(fù)方止瀉膠囊的最小抑菌濃度（MIC）為12.5mg/mL。

表2 試管中細(xì)菌生長(zhǎng)情況

3.3 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表3。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，復(fù)方止瀉膠囊高劑量組的小鼠存活率達(dá)到70%，感染對(duì)照組的小鼠存活率只有15%，提高了55%。同時(shí)復(fù)方止瀉膠囊中、低劑量組小鼠的存活率都高于感染組。可以看到復(fù)方止瀉膠囊在體內(nèi)對(duì)于沙門氏菌引起的感染有明顯的抗感染作用，不同劑量的藥物都能提高小鼠的存活數(shù)，起到很好的保護(hù)作用。

表3 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 關(guān)于體外抑菌試驗(yàn)

體外抑菌試驗(yàn)可用于藥物對(duì)細(xì)菌敏感性的測(cè)定，沙門氏菌又是引起腹瀉的常見致病菌。通過(guò)對(duì)中藥制劑復(fù)方止瀉膠囊的抗菌作用進(jìn)行定性和定量試驗(yàn)，采用管碟法做定性試驗(yàn)和試管法做定量試驗(yàn)，配合使用這兩種方法，能比較全面、合理的評(píng)價(jià)該藥物的抗菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方止瀉膠囊對(duì)沙門氏菌的抑制作用比較強(qiáng)，隨著藥物濃度的增加對(duì)細(xì)菌的抑制效果也在增強(qiáng)，試管法測(cè)得MIC 值為12.5mg/mL。該濃度能充分抑制病原菌的生長(zhǎng)，此時(shí)宿主的防御功能也會(huì)發(fā)揮作用，能有效地清除入侵的細(xì)菌。影響管碟法結(jié)果的因素很多，我們需要注意試驗(yàn)器材的清洗、培養(yǎng)基的加注，鋼管的放置以及培養(yǎng)時(shí)間的控制，稍有不慎就容易出現(xiàn)抑菌圈不正常的現(xiàn)象，影響試驗(yàn)結(jié)果的判斷[9]。MIC 測(cè)定時(shí)，菌液的濃度、培養(yǎng)基的制備以及培養(yǎng)時(shí)間都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果[10]。體外抑菌試驗(yàn)操作環(huán)節(jié)都需小心謹(jǐn)慎，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)。

4.2 關(guān)于體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

體內(nèi)抑菌試驗(yàn)中，將能導(dǎo)致小鼠死亡劑量的沙門氏菌注入小鼠體內(nèi)，這些小鼠作感染模型，再將復(fù)方止瀉膠囊溶液的不同劑量灌胃給藥對(duì)其給予治療，觀察存活率[11]。同時(shí)設(shè)置感染對(duì)照組和正常對(duì)照組，感染對(duì)照組只給相同菌量，不給藥物；正常對(duì)照組不注射菌液，以生理鹽水替代，作對(duì)照比較。經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠注射菌液后，食欲缺乏，死亡時(shí)間主要在2d 內(nèi)，3d 后基本恢復(fù)。所以試驗(yàn)過(guò)程中，我們提前3d 進(jìn)行灌胃給藥，菌液注射后，再連續(xù)給藥3d 試驗(yàn)結(jié)果效果良好。結(jié)果表明，復(fù)方止瀉膠囊可以提高沙門菌感染小鼠的存活率，起到了較好的保護(hù)作用。

5 小結(jié)

復(fù)方止瀉膠囊對(duì)沙門氏菌具有良好的抗菌作用，最小抑菌濃度（MIC）為12.5mg/mL，對(duì)其感染的小鼠也具有較好的保護(hù)作用，