何興芬，方亞倩，李延華，房 升，孟岳成，陳 杰

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州 310018）

油浸食品因良好的風味而深受廣大消費者的喜愛[1]。然而，因霉菌和枯草芽孢桿菌等有害微生物的大量繁殖而導致該類產(chǎn)品容易出現(xiàn)表面長霉、脂肪酸敗和產(chǎn)生黏液等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象[2]，給食品安全帶來嚴重影響。目前，預防油浸食品腐敗變質(zhì)的方法主要是添加丙酸鈣、山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉等化學防腐劑[3]，雖然其能夠有效控制油浸食品的腐敗，但是長期攝入可能對消費者的健康造成潛在的威脅[4]。利用具有安全、高效等特點的天然抑菌劑來控制食品的腐敗逐漸成為研究的熱點和食品工業(yè)的發(fā)展趨勢[5-6]。

ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種由25～30 個L-賴氨酸通過ε-氨基和α-羧基組成的異肽鍵連接而成的陽離子抗菌肽，具有抑菌譜廣、安全性高、熱穩(wěn)定性好等特點[7-9]。被廣泛用于肉制品、果蔬類以及面制品的防腐保鮮中[10-13]。殼聚糖和ε-PL 復合使用，通過抑制酵母菌、霉菌、大腸桿菌的生長和肌紅蛋白的脂質(zhì)氧化反應有效提高牛肉的貨架期[14]，ε-PL 通過提高酚類、黃酮類化合物以及木質(zhì)素的含量延緩了蘋果果實的腐敗變質(zhì)[15]。此外，ε-PL 還能抑制面制品中寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和擴展青霉（Penicillium expansum）的生長，從而延長面包的貨架期[16]。然而，ε-PL 的親水性極強[17]，很難分散溶解到食用油中，極大的限制了在油浸食品中的使用，其在油浸食品中的應用問題亟待解決。

油水混溶劑是指有利于油、水兩相互溶的介質(zhì)，其在溶劑（分散相）中通過形成膠團、絡(luò)合物以及復鹽等，在一定程度上增大某些難溶性物質(zhì)的溶解度，其中大部分為表面活性劑[18-19]?；诒砻婊钚詣┑娜橐后w系和微乳液相似，不需要外部能量輸入，主要靠混溶劑（或表面活性劑）本身的作用改善油、水兩相的相互分散。在高表面活性劑條件下，可形成各相同性的分散體系-微乳液[20]，而低表面活性劑可形成普通油水乳化液體系。本文利用此特點，通過制備ε-PL 與低濃度表面活性劑的預混溶液，探究其在植物油中的分散特性，通過體內(nèi)、外試驗研究該預混溶液對油浸面制品中腐敗微生物的抑制效果，以擴大ε-PL 作為天然防腐殺菌劑在食品工業(yè)中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（食品級），浙江新銀象生物工程有限公司；吐溫80、司盤80（化學純級），上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、丙三醇（分析純級），上海凌峰化學試劑有限公司；氯化鈉（分析純級），廣州光華科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；調(diào)味面制品（衛(wèi)龍小面筋），河南衛(wèi)龍食品有限公司；食用植物油、牛筋面、調(diào)味粉（食品級），市售。

1.2 設(shè)備與儀器

立式高壓滅菌鍋（YXQ-LS-70A），上海博迅實業(yè)有限公司；旋渦混合器（IKA lab dancer），德國IKA 公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；光學顯微鏡（E100），尼康儀器（上海）有限公司；脈沖震蕩樣品均質(zhì)器（Shock-Mixer-1），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；電子精密天平（PL-2002），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子分析天平（AL-104），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BSC250），上海雙旭電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 ETSG 的制備 選取吐溫80、司盤80 為表面活性劑，按1∶1 復配，將ε-PL 配制成質(zhì)量分數(shù)50%的水溶液，無水乙醇、丙三醇作為輔助劑，以提高體系的流動性。分別以體積比為1∶3 的無水乙醇和吐溫作為活性劑相，體積比為1∶3 的丙三醇和ε-PL 水溶液作為水相。將活性劑相與水相分別以3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4 和1∶5 的比例配制，劇烈渦旋使其混合均勻。

1.3.2 ETSG 在油中的分散 將不同比例的ETSG，按質(zhì)量分數(shù)1%，2%，3%的比例添加至葵花籽油中，快速渦旋使其均勻分散，25 ℃靜置24 h后，在10 mL 離心管中觀察溶解現(xiàn)象。根據(jù)ε-PL水溶液的增溶效果，選出最佳比例的ETSG，將其分別添加至不同的植物油中，觀察在不同油中的增溶效果并記錄。

1.3.3 優(yōu)勢腐敗霉菌的分離、純化及鑒定 參照徐文歡等[21]的方法，采用梯度稀釋涂布平板法分離、純化腐敗調(diào)味面制品（衛(wèi)龍小面筋，衛(wèi)龍食品有限公司）中的霉菌，擴增其18S rDNA 序列，確定霉菌種屬。

1.3.4 菌懸液及菌餅的制備 挑取分離、純化后的霉菌孢子，接種至PDA，28 ℃倒置培養(yǎng)5～7 d后，取一培養(yǎng)好的平板，加入10 mL 無菌水，用涂布器在培養(yǎng)基表面刮取孢子后4 層無菌紗布過濾，轉(zhuǎn)移濾液至10 mL 離心管。震蕩后，用血球計數(shù)板調(diào)整其濃度為106 個/mL。用直徑為8 mm 的無菌打孔器取邊緣菌塊作為菌餅備用[22]。

1.3.5 對菌絲生長的抑制 將ETSG 加入PDA培養(yǎng)基中，倒平板，待其凝固后，將菌餅接種至平板中央。28 ℃培養(yǎng)，每隔24 h 觀察，用十字交叉法測量菌落直徑。本試驗以不加任何抗菌劑為空白對照，以相同濃度的ε-PL 水溶液為陽性對照。按式（1）計算菌絲相對抑制率[23]。

相對抑制率70%以上：較強抑制；相對抑制率40%～70%：中等強度抑制；相對抑制率40%以下：較弱抑制。

1.3.6 對孢子萌發(fā)的抑制 搖勻孢子懸浮液（濃度約1×106 個/mL），均勻時吸取100 μL，加入至添加了ETSG 的PDB 培養(yǎng)基中，控制ETSG 濃度分別為0.1%（對應鏈格孢霉和赭曲霉）和4%（對應土曲霉），以無菌水作空白對照（CK），同濃度的聚賴氨酸水溶液（EPL）作陽性對照。將孢子懸浮液與培養(yǎng)基充分混勻后，放入震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)（28℃，150 r/min）。每隔2 h 觀察1 次。待對照組孢子萌發(fā)80%以上（芽管長度大于孢子直徑時即認為萌發(fā)），在40 倍物鏡下隨機選取10～15 個視野觀察，分別記錄萌發(fā)的孢子數(shù)和觀察到的孢子總數(shù)[24]。按式（2）計算孢子萌發(fā)率。

1.3.7 ε-PL 分散的W/O 溶液的應用

1.3.7.1 調(diào)味面制品的制作 稱取市售牛筋面于70 ℃熱水浸泡2.5 min，取出放20 min 瀝干，剪碎至均勻大小，將ETSG 分別以質(zhì)量分數(shù)1%，2%比例分散于葵花籽油中，調(diào)味粉與油質(zhì)量比為1∶4制備成辣椒油，按辣椒油∶面筋1∶2 比例將油與面筋攪拌均勻，分裝入無菌均質(zhì)袋中。分別以純葵花籽油與含活性劑（吐溫80+司盤80+無水乙醇+甘油）的葵花籽油加至面筋熟食中，作為空白對照及陽性對照。

1.3.7.2 調(diào)味面制品菌種接種 采用鏈格孢霉T5A、赭曲霉9F 混合菌種接種，分別制備菌懸液并混合均勻，加入成品中拌勻，使最終接種的霉菌孢子量為103個/g，裝入無菌袋后密封，置25 ℃的恒溫箱中儲存，待對照組發(fā)生變質(zhì)時，進行霉菌菌落計數(shù)。

1.3.7.3 霉菌菌落計數(shù) 分別切取10 g 不同的調(diào)味面制品樣品，加入90 mL 生理鹽水，于均質(zhì)機中振蕩均勻，取1 mL 進行10 倍稀釋制成不同濃度梯度的菌液，每個樣品選取2～3 個梯度。采用傾注法，于每個梯度中分別取出1 mL 至平板中心，倒入40 ℃的PDA 培養(yǎng)基，輕輕晃動使菌液均勻分布，待平板凝固后，置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測定并記錄菌落數(shù)。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 以上試驗均至少重復測定3 次。全部數(shù)據(jù)采用Excel 2007 計算平均值及標準偏差，Origin 2021 軟件進行作圖，SPSS 25 對結(jié)果進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ETSG 的制備

活性劑相與水相以不同比例混合，制得的ETSG 如圖1a 所示。當活性劑相與水相比例為3∶1，2∶1 和1∶1 時，混合溶液出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象，底部為凝膠狀，不易流動。當比例為1∶2，1∶3，1∶4 和1∶5 時，混合溶液均保持透明、流動性好。25 ℃靜置12 h 出現(xiàn)分層，使用時輕微晃動即可混合均勻。這可能與兩種乳化劑復配后的HLB 值有關(guān)，吐溫80 的HLB 值為15，司班80 的HLB 值4.3，兩者按質(zhì)量比1 ∶1 混合后，混合乳化劑理論總HLB 值在9.7 左右[25]，有一定量的親水基團，不能完全與水互溶。隨著加水量的增加，存在一個轉(zhuǎn)相過程，此時黏度會迅速增大，形成凝膠狀，是大多非離子表面活性劑與水混溶時的普遍現(xiàn)象[26]。這可能是因為表面活性劑在體系中的濃度達到一定水平后，吸附的表面活性劑分子或離子已布滿表面，而分散在體相外的多余分子或離子，為降低在環(huán)境中的表面能和分子間引力，相互聚集形成聚集體。繼續(xù)選取活性劑相與水相比例為1∶1.25，1∶1.5，1∶1.75 配制溶液，3 種比例配制的ETSG 均沒有出現(xiàn)底部凝膠沉淀，透明、流動性好，靜置12 h分層，輕微晃動可均勻混合。

圖1 不同比例ETSG 的流動性（a）、在葵花籽油中的增溶效果（b）以及在不同植物油中的溶解性（c）Fig.1 The fluidity of different proportions of ETSG（a），the solubilization effect in sunflower oil（b）and the solubility in different vegetable oils（c）

2.2 ETSG 在油中的分散性

將（1 ∶1.25）～（1 ∶2）的ETSG 分別以1%，2%，3%（質(zhì)量分數(shù)）的添加量加入葵花籽油后，于25℃靜置24 h，觀察其溶解情況。在油中24 h 后的分散相行為如圖1b 所示。ETSG 的添加量為1%時，1∶1.25，1∶1.5 和1∶1.75 的比例均可在油中均勻分散，油溶液具有一定的透明度。當活性劑相與水相為1∶2 時，ETSG 添加量為1%時，油溶液也具有一定的透明度，然而，底部存在未溶解的水溶液小液滴。當添加量為2%時，1∶1.25 的混溶液可在油中較好地分散，其它3 種比例的油在底部沉積了未溶解的水溶液液滴，無明顯的絮狀沉淀。當添加量為3%時，4 種比例的ETSG 均在油中底部出現(xiàn)水溶液液滴的沉積，溶液不透明。

最終選取1∶1.25 的ETSG，考察其在不同植物油中的分散情況。由圖1c 可知，該制劑的添加量為1%時，在葵花籽油、橄欖油中均可均勻分散，整個體系具有較好的透明性；在花生油和大豆油中，離心管底部有微量未溶解的水溶液液滴沉積。當添加量為2%時，混溶液在葵花籽油和橄欖油中仍分散均勻，溶液呈半透明狀，在大豆油和花生油中小部分制劑沉積在底部，未能分散。當添加量增加至3%時，在所有植物油中均出現(xiàn)底部分層現(xiàn)象，不能均勻分散在油中。

2.3 優(yōu)勢腐敗霉菌的分離純化及鑒定

根據(jù)不同霉菌在培養(yǎng)基上的生長速度、菌落顏色及形狀均不相同，對霉菌進行初步鑒定（表1，圖2b）。對腐敗霉菌個體形態(tài)觀察可知，所分離的菌株大小符合霉菌的大小及形態(tài)（圖2c）。采用18S rDNA 測序?qū)ζ溥M行鑒定，3 株菌株的總DNA為模板的18S rDNA 條帶明亮、清晰，無非特異性擴增（圖2a）。根據(jù)生工生物工程股份有限公司的測序結(jié)果，在NCBI 網(wǎng)站內(nèi)進行同源序列比對。根據(jù)同源性分析結(jié)果，選擇同源性較高的不同參考菌株的序列，使用軟件 Mega7.0，運用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株M-A1與鏈格孢霉T5A 十分相近，菌株M-A2 與赭曲霉9F 序列同源性最高，M-A3 與土曲霉YS-1-1 最為相似（表2）。

圖2 試驗菌株18S rDNA 基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖譜（a）、調(diào)味面制品腐敗霉菌菌落（正面和反面）（b）和調(diào)味面制品腐敗霉菌個體形態(tài)（c）Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplified product of 18S rDNA of test stains（a）、colony of the spoilage molds（front and back）（b）and morphology of the spoilage moulds in spicy gluten（c）

表1 優(yōu)勢腐敗霉菌菌落和細胞形態(tài)Table 1 Colony and cell morphology of the spoilage moulds from spicy gluten

表2 調(diào)味面制品中腐敗菌鑒定結(jié)果Table 2 Microbial species identification after sequencing of spoilage bacteria in in spicy gluten

2.4 ETSG 對霉菌抑菌濃度的篩選

ETSG 對鏈格孢霉和赭曲霉的抑制效果好于土曲霉（圖3，圖4）。當ETSG 在培養(yǎng)基中體積分數(shù)為0.2%時，在5 d 生長期內(nèi)可完全抑制赭曲霉的菌絲生長；體積分數(shù)為0.5%時，生長期內(nèi)對鏈格孢霉的菌絲生長的相對抑制率在98%以上。然而，ETSG 對土曲霉的抑制率較低，在培養(yǎng)基中體積分數(shù)為8%時，培養(yǎng)期內(nèi)對其菌絲生長的相對抑制率在95%以上。

圖3 ETSG 對生長5 d 的霉菌菌絲生長相對抑制率的影響Fig.3 Effect of ETSG on relative inhibitory rate of mycelium growth of mold growing for 5 d

圖4 ETSG 對霉菌菌落形態(tài)的影響Fig.4 The effect of ETSG on mold colony morphology

2.5 ETSG 對霉菌直徑生長和孢子萌發(fā)的抑制

選取ETSG 對3 株霉菌的亞致死濃度，計算其中ε-PL 的濃度。制備同等濃度的ε-PL 水溶液（EPL），對比ETSG、ε-PL 水溶液（EPL）及空白對照（CK）的霉菌菌絲生長情況。結(jié)果表明，ETSG 與EPL 均對3 株霉菌生長有顯著的抑制作用（P<0.05），且兩組處理的菌落直徑均無顯著差異（P<0.05）（圖5a）。表明加入表面活性劑和輔助劑對ε-PL 的抑菌活性無影響。0.1%的ETSG 處理培養(yǎng)5 d 后，鏈格孢霉和赭曲霉的菌落直徑顯著低于對照組83.44%和45.21%（P<0.05），經(jīng)4%的ETSG處理培養(yǎng)5 d 后土曲霉的菌落直徑顯著低于對照組39.64%（P<0.05）。孢子萌發(fā)抑制結(jié)果如圖5b 所示，體積分數(shù)0.1%的ETSG 處理使鏈格孢霉與赭曲霉的孢子萌發(fā)率分別從87.07%和85.01%降至1.91%和1.84%，體積分數(shù)4%的ETSG 處理使土曲霉的孢子萌發(fā)率從90.27%降至4.16%，顯著抑制了土曲霉的孢子萌發(fā)。這可能是因為ε-PL 是帶陽離子的聚合物，與微生物細胞膜表面的陰離子通過靜電相互作用，破壞了細胞膜的完整性，導致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，形成空腔，ε-PL 進入細胞，與線粒體、細胞核膜結(jié)合，導致線粒體嵴模糊，細胞核消失，造成細胞代謝紊亂，使霉菌徹底死亡[27-28]。綜上，ETSG 對鏈格孢霉和赭曲霉的菌絲和孢子抑制效果優(yōu)于土曲霉，可能是因為土曲霉與抑菌劑間的靜電結(jié)合效果弱，需要更多的抑菌劑才能達到相同的抑制效果。

圖5 抑菌劑對鏈格孢霉、赭曲霉、土曲霉的菌落直徑（a）和孢子萌發(fā)率（b）的影響Fig.5 Effect of bacteriostatic agent on the colony diameter（a）and spore germination rate（b）of A.sp.，A.ochraceus and A.terreus.

兩種處理對3 種霉菌孢子萌發(fā)均有顯著的抑制效果（P<0.05），與對菌絲生長的抑制效果相似。對3 株霉菌的孢子萌發(fā)抑制，兩種處理組的抑制效果無顯著差異（P<0.05），說明本試驗所選油水混溶劑及輔助混溶劑，不影響ε-PL 水溶液對這3株霉菌孢子萌發(fā)的抑制效果?？梢?，所制備的ETSG 預混溶液不僅提高了ε-PL 在油中的增溶，而且未影響ε-PL 對霉菌孢子萌發(fā)的抑制效果。

2.6 ETSG 分散的W/O 油溶液的抑菌性

為驗證ETSG 在油中分散后的抑菌效果，自制調(diào)味面制品，將鏈格孢霉和赭曲霉的菌懸液混合接種于調(diào)味面制品上，接種的總霉菌孢子量為103個/g。將所有樣品置于28 ℃培養(yǎng)箱中直到對照組變質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組、未加ε-PL 的陽性對照組在接種3 d 后發(fā)生脹袋現(xiàn)象（圖6），并伴有明顯的腐敗酸臭味。對不同處理后面筋熟食中的霉菌菌落進行計數(shù)（表3）。結(jié)果表明，處理組的霉菌菌落總數(shù)顯著降低，且ETSG 濃度越大，菌落總數(shù)越少。2%的ETSG 處理后，菌落總數(shù)比對照組減少了62.5%。由此可知，ETSG 在油中分散后，對霉菌仍有顯著的抑制效果。

表3 預混溶液分散后的油對調(diào)味面制品中霉菌菌落總數(shù)的影響Table 3 Effect of ETSG-dispersed oil on the total number of mold colonies in spicy gluten

圖6 接種霉菌的自制調(diào)味面制品放置3 d 的形態(tài)Fig.6 Photos of homemade spicy gluten with molds for 3 d

3 結(jié)論

本文制備了無沉淀且透明穩(wěn)定的ε-PL 與低表面活性劑的預混溶液（ETSG），解決了ε-PL 的油難溶性問題，并從腐敗面筋熟食中分離出3 株腐敗菌，分別為鏈格孢霉T5A、赭曲霉9F 和土曲霉YS-1-1。體外抑菌試驗證明ETSG 可顯著抑制3 株霉菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，體內(nèi)抑菌試驗表明ETSG 分散后可顯著降低調(diào)味面筋制品中的霉菌菌落總數(shù)。即在增大了ε-PL 油溶性的同時，也完全保留了ε-PL 的抑菌性質(zhì)。本研究可為ε-PL 的實際應用提供理論依據(jù)。