王一賀，田少騰，靳金博，南松劍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東 煙臺 264670）

尾菜是指蔬菜在生長、采收、加工等環(huán)節(jié)中產(chǎn)生的廢棄葉、根、莖等，也稱“蔬菜廢棄物”。2020年，中國蔬菜種植面積約為21.3萬km2，蔬菜產(chǎn)量約為7.22億t。隨著中國果蔬種植的發(fā)展，尾菜也在不斷增加，各類蔬菜在生產(chǎn)過程中尾菜的平均比例為33.6%，廚房加工過程中平均廢棄率為20.5%［1］。目前，產(chǎn)地尾菜的處理方法以深埋、遠(yuǎn)倒為主，也有沼氣處理、漚肥等［2］，但由于處理技術(shù)存在不足，與生產(chǎn)實際差距較大，并且投入的人力和物力過多，應(yīng)用推廣難度較大［3］。尾菜若不及時收集處理，會導(dǎo)致資源浪費以及環(huán)境污染［4］。通過堆肥發(fā)酵處理，可使其作為廢棄物得以資源化利用［5，6］，發(fā)揮其具有的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益［7］。利用發(fā)酵的手段將果蔬尾菜轉(zhuǎn)化為酵素，也是尾菜資源化利用的一個較好辦法，發(fā)酵制得的酵素中不僅含大量的氨基酸、礦物質(zhì)、功效酶等成分［8，9］，而且含有大量作物所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)［10］。因酵素具有的良好生物活性［11］，經(jīng)實踐發(fā)現(xiàn)，酵素在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)都可以發(fā)揮重要作用［12-14］。

研究表明，桑椹酵素發(fā)酵過程中添加混合菌種群可以顯著提高特征酶活力［15］，有助于加速發(fā)酵過程，提高發(fā)酵質(zhì)量［16］；施用EM菌劑有效促進(jìn)番茄、草莓生長，提高產(chǎn)量及品質(zhì)［17，18］；添加蔬菜類酵素發(fā)酵的濾液中含有較多霉菌，水果類酵素中含有多種酶類，其成分含量有所不同［19］。本研究通過對果蔬廢棄物進(jìn)行不同條件下的發(fā)酵試驗，探究不同發(fā)酵條件下對產(chǎn)物細(xì)菌、真菌和大腸桿菌菌落總數(shù)，pH、密度等指標(biāo)，纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等功效酶活性的影響，分析果蔬酵素制備影響因素，從而優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定最優(yōu)發(fā)酵因子組合，為尾菜發(fā)酵在生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用果蔬尾菜來源于牟平某農(nóng)貿(mào)市場，包括蔬菜廢棄物（因貨架銷售要求需整形、包裝產(chǎn)生的廢棄蔬菜莖、葉、根，主要品種為菠菜、油菜）、水果廢棄物（紅富士蘋果壞果、果皮）；紅糖（EM菌培養(yǎng)適用型）、EM菌劑（混合型添加劑，地衣芽孢桿菌Ⅵ型）購于河南農(nóng)富康生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗開始前將收集的果蔬尾菜清洗后，置于通風(fēng)處自然晾干水分，消毒處理并切成1～3 cm的小塊（段），裝入清洗消毒過的不銹鋼發(fā)酵裝置中，按照料液比3∶10進(jìn)行處理，加入發(fā)酵底物、添加物（EM菌劑、紅糖）發(fā)酵。攪拌混合均勻后，添加不同果蔬尾菜發(fā)酵底物、添加物（EM菌劑、紅糖）后密封發(fā)酵。試驗開始后每2天將果蔬尾菜酵素?fù)u勻1次，發(fā)酵過程中控制發(fā)酵溫度為25℃，恒溫發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)生氣體自動通過U型管排出發(fā)酵裝置。

試驗共分10組處理，1組為空白處理，其余試驗處理具體成分和試驗條件見表1。

表1 試驗分組設(shè)計

1.3 項目測定

分別于發(fā)酵試驗開始后的7、14、21、28、35、42、49 d取樣，使用移液管量取果蔬尾菜酵素上清液50 mL，置于消毒玻璃瓶，4℃冰箱保存并進(jìn)行項目檢測，項目測定方法見表2。

表2 項目測定方法

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用Excel 2019、SPSS 18.0軟件，采用LSD法作多重比較分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵素發(fā)酵過程中pH、密度的變化

發(fā)酵過程中，pH的變化是判斷發(fā)酵規(guī)律和效果的依據(jù)之一，發(fā)酵過程中pH的變化見圖1。發(fā)酵初期，各發(fā)酵處理pH變化幅度大，除T8外，其余發(fā)酵處理7 d內(nèi)酵素pH均快速降至4.50以下。在后續(xù)發(fā)酵過程中，各發(fā)酵處理pH變化幅度大幅下降，T1、T6、T7、T8的pH略微升高，T2、T3、T4、T5、T9的pH略微下降，空白處理總體保持穩(wěn)定，pH基本不變。僅添加EM菌劑的發(fā)酵處理發(fā)酵過程中pH上升，僅添加紅糖及同時添加紅糖、EM菌劑發(fā)酵處理發(fā)酵過程中pH下降。其原因可能是菌群生長過程中會消耗分解果蔬尾菜中的有機酸等物質(zhì)，導(dǎo)致pH升高，添加糖可以增加酵素中的有機酸等物質(zhì)含量，減緩消耗速度，抑制pH的升高；同時添加紅糖、EM菌劑的T2、T4、T5分別為相同發(fā)酵底物中pH最低的發(fā)酵組，說明同時添加紅糖、EM菌劑時，發(fā)酵效果最佳。

圖1 發(fā)酵過程中pH變化

不同添加物對底物為蔬菜廢棄物的發(fā)酵處理影響見圖2，對比T5、T8、T9，發(fā)酵7 d后，T8的pH從6.17上升至6.59，而T5、T9的pH分別從3.85、4.25下降至3.59、3.85。分析發(fā)現(xiàn)，相同發(fā)酵底物（蔬菜廢棄物）情況下，T8未添加紅糖，發(fā)酵過程中pH顯著高于其他處理，推測該發(fā)酵處理中EM菌劑與蔬菜發(fā)生反應(yīng)生成的物質(zhì)、環(huán)境抑制微生物的生長和產(chǎn)物的合成，導(dǎo)致其發(fā)酵效果不佳。

圖2 添加物對pH的影響

發(fā)酵過程中酵素密度變化見圖3，除空白處理緩慢下降外，不同發(fā)酵處理密度隨時間變化均呈明顯下降趨勢，49 d時，T2、T3、T4、T5、T8、T9均明顯低于1.000，推測果蔬尾菜酵素發(fā)酵過程中產(chǎn)生的物質(zhì)密度小于1.000，可能產(chǎn)生乙醇等密度較小的發(fā)酵產(chǎn)物，說明這些發(fā)酵處理效果良好。

圖3 發(fā)酵過程中酵素密度變化

2.2 酵素發(fā)酵過程中菌落總數(shù)變化

菌落總數(shù)是在一定條件下單位體積或者單位質(zhì)量樣品生長出的細(xì)菌、真菌、大腸桿菌等菌落總數(shù)。果蔬尾菜酵素制備時，可通過測定菌落數(shù)量表示其發(fā)酵程度。發(fā)酵過程中各處理組真菌菌落總數(shù)變化見圖4，發(fā)酵過程各處理真菌總數(shù)不斷上升，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2真菌菌落總數(shù)顯著高于其余組處理，為3.25×105cfu/mL，較空白處理增幅為157.94%。說明料液比為3∶10，添加紅糖（100 g/L）、EM菌劑（3 mL/L）時發(fā)酵效果最佳。49 d時，T1、T3真菌菌落總數(shù)分別較空白處理提升57.14%、30.95%，提升效果顯著，說明添加EM菌劑或紅糖均對發(fā)酵過程有顯著促進(jìn)作用，添加EM菌劑較添加紅糖對發(fā)酵過程中真菌菌落總數(shù)的促進(jìn)作用更為顯著；T2、T4、T5真菌菌落總數(shù)分別為空白處理的257.94%，143.65%，77.46%，說明發(fā)酵底物為水果廢棄物時發(fā)酵效果最佳；比較T1、T6、T7可知，發(fā)酵過程中真菌菌落總數(shù)與EM菌劑添加濃度呈負(fù)相關(guān)，推測EM菌劑添加濃度增大會抑制其他真菌的增長。同時添加紅糖、EM菌劑（3 mL/L）的發(fā)酵處理（T2、T4、T5）為相同發(fā)酵底物真菌菌落總數(shù)最高的處理組，說明添加紅糖、EM菌劑時發(fā)酵效果最佳。添加EM菌劑的發(fā)酵處理（T1、T6、T7、T8）酵素真菌菌落總數(shù)在35 d內(nèi)快速上升，隨后上升速度減緩，42～49 d維持穩(wěn)定，菌落總數(shù)基本不變或略有下降，說明添加EM菌劑能夠有效減少發(fā)酵時間，發(fā)酵至42 d時，各處理菌落總數(shù)基本穩(wěn)定，為適宜發(fā)酵時長。添加紅糖的發(fā)酵處理T3、T9在發(fā)酵35～49 d時較T1、T6、T7、T8菌落增速不斷增加，菌落總數(shù)快速上漲，說明添加紅糖能夠有效增加發(fā)酵時間。

圖4 發(fā)酵過程中真菌菌落變化

發(fā)酵過程中各處理細(xì)菌菌落總數(shù)變化見圖5，果蔬尾菜酵素含有的細(xì)菌菌落總數(shù)較真菌菌落總數(shù)更多。添加EM菌劑的發(fā)酵處理42～49 d細(xì)菌菌落總數(shù)持續(xù)增加，無增速下緩趨勢，與真菌菌落總數(shù)變化有差異。49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2即添加紅糖（100 g/L）和EM菌劑（3 ml/L）發(fā)酵效果最佳，細(xì)菌菌落總數(shù)較空白處理增幅為215.20%。T1、T3細(xì)菌菌落總數(shù)較空白處理分別提升61.01%、52.83%，提升效果顯著；T2、T4、T5細(xì)菌菌落總數(shù)分別為空白處理的316.98%，137.74%，64.78%，說明發(fā)酵底物為水果廢棄物時發(fā)酵效果最佳，細(xì)菌菌落總數(shù)為發(fā)酵底物為蔬菜的489.32%；比較T1、T6、T7可知，隨著EM菌劑添加濃度的增加，發(fā)酵過程各時期細(xì)菌菌落總數(shù)呈下降趨勢，推測EM菌劑添加濃度增大會抑制其他細(xì)菌的增長。

圖5 發(fā)酵過程中細(xì)菌菌落變化

發(fā)酵過程中各處理大腸桿菌菌落總數(shù)變化見圖6，除T8檢測出含有大腸桿菌外，其余發(fā)酵處理均未檢測出大腸桿菌，結(jié)合后續(xù)研究推測，因發(fā)酵過程中只有T8處理的pH為6.0～7.0，剩余9組處理pH均小于4.5，說明果蔬尾菜酵素環(huán)境絕大部分不利于大腸桿菌的生長。

圖6 發(fā)酵過程中大腸桿菌菌落變化

2.3 酵素發(fā)酵過程中功效酶活性的變化

果蔬尾菜酵素中含有多種功效酶，隨著發(fā)酵過程中功效酶酶活性不斷上升，酵素作用效果不斷提升。隨著發(fā)酵不斷進(jìn)行，纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶活性均不斷上升，發(fā)酵結(jié)束后各處理酶活性見表3。

表3 發(fā)酵結(jié)束后各處理的酶活性（單位：U/mL）

發(fā)酵過程中纖維素酶活性變化見圖7，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2纖維素酶活性顯著高于其余9組處理，為31.83 U/mL，較空白處理增幅為81.26%，說明T2發(fā)酵效果最佳。T1、T3發(fā)酵效果較好，較空白處理增幅分別為51.03%、54.67%，說明添加EM菌劑或紅糖均對發(fā)酵過程有顯著促進(jìn)作用，且對于纖維素酶活性影響作用相似；T1、T6、T7纖維素酶活性與EM菌劑添加濃度呈負(fù)相關(guān)，推測EM菌劑添加濃度增大會抑制酶活性的增長；發(fā)酵底物為蔬菜廢棄物的T5、T8、T9添加不同添加物后，發(fā)酵過程中酶活性均低于空白處理，纖維素酶活性僅為空白處理的84.00%、77.22%、55.30%，說明不同發(fā)酵底物種類對于酶活性的影響強于添加物對其影響，水果廢棄物發(fā)酵優(yōu)于蔬菜廢棄物發(fā)酵。

圖7 發(fā)酵過程中纖維素酶活性變化

發(fā)酵過程中脂肪酶活性變化見圖8，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2脂肪酶活性顯著高于其余組處理，為0.31 U/mL，較空白處理增幅為138.46%，說明T2發(fā)酵效果最佳。T1、T3發(fā)酵效果較好，較空白處理增幅分別為76.92%、130.77%，說明添加EM菌劑或紅糖均對發(fā)酵過程有顯著促進(jìn)作用，添加EM菌劑較添加紅糖對發(fā)酵過程中脂肪酶活性的促進(jìn)作用更為顯著；T1、T6、T7脂肪酶活性與EM菌劑添加濃度呈負(fù)相關(guān)，推測EM菌劑添加濃度增大會抑制酶活性的增長；酵底物為蔬菜廢棄物的T5、T8、T9添加不同添加物后，發(fā)酵過程中酶活性均低于空白處理，脂肪酶酶活性僅為空白處理的92.30%、61.54%、69.23%，說明不同發(fā)酵底物種類對于酶活性的影響強于添加物對其影響，水果廢棄物顯著優(yōu)于蔬菜廢棄物發(fā)酵。但考慮到脂肪酶活性較低，僅為0.08～0.30 U/mL，測量精確度較低，可能導(dǎo)致產(chǎn)生誤差，后續(xù)可進(jìn)行更深入的研究，以期提高精確度。

圖8 發(fā)酵過程中脂肪酶活性變化

發(fā)酵過程中α-淀粉酶、蛋白酶活性變化見圖9、圖10，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T1至T9相較于空白處理，均無顯著提升α-淀粉酶、蛋白酶活性，除T5、T8、T9外，不同處理α-淀粉酶活性均在3.0～4.0 U/mL，T1至T4處理較空白處理增幅均在20%以內(nèi)，T5、T8、T9的α-淀粉酶活性顯著低于空白處理，僅為空白處理的59.78%、34.92%、32.96%，說明不同發(fā)酵處理之間蛋白酶活性差距較小，蔬菜廢棄物發(fā)酵不利于酵素蛋白酶活性增長。49 d發(fā)酵結(jié)束后，不同發(fā)酵組蛋白酶活性基本處于5.0～6.0 U/mL，T2處理較空白組增幅最大，也僅為17.1%，各處理組總體差距不大，說明不同發(fā)酵底物、不同添加物對于果蔬尾菜酵素α-淀粉酶及蛋白酶活性影響較小。

圖9 發(fā)酵過程中α-淀粉酶活性變化

圖10 發(fā)酵過程中蛋白酶活性變化

3 討論

發(fā)酵過程中pH的變化可以反映發(fā)酵過程是否正常，同時也能反映酵素品質(zhì)，是判斷發(fā)酵成功與否的標(biāo)志［21］。除T8外，49 d發(fā)酵結(jié)束時，剩余處理組pH均位于3.0～4.0并保持穩(wěn)定，與蔡毅飛［21］、卜俊芝［22］的研究一致，說明發(fā)酵試驗成功，果蔬尾菜酵素品質(zhì)較好。發(fā)酵過程中7 d內(nèi)酵素pH迅速下降，后續(xù)發(fā)酵過程中pH緩慢變化或保持穩(wěn)定，說明發(fā)酵初期各項反應(yīng)較為活躍，發(fā)酵速度較快，發(fā)酵中后期發(fā)酵環(huán)境基本保持穩(wěn)定。發(fā)酵過程中未添加糖的發(fā)酵處理pH較高，符合張海燕等［23］的研究結(jié)果，說明酵素中糖添加量過低會影響微生物的生長和產(chǎn)物的合成。發(fā)酵過程中，酵素密度低于1.00，推測酵母菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生醇類、醛類［24］、酸類［25］等物質(zhì)，且隨著醇類、醛類、酸類等物質(zhì)濃度的增加，酵素密度不斷降低［26］。

菌落總數(shù)為微生物指示性指標(biāo)之一，可在一定程度上反映生產(chǎn)過程中的發(fā)酵程度。本研究通過試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵結(jié)束后不同處理尾菜酵素中真菌、細(xì)菌菌落總數(shù)含量普遍達(dá)到7×105cfu/mL以上，該結(jié)論與文浩等［25］、何曼等［27］的研究結(jié)果相似，說明試驗果蔬尾菜酵素發(fā)酵良好。添加EM菌劑處理組細(xì)菌、真菌菌落顯著高于其他處理組，與位伯華［28］的研究結(jié)果一致，說明尾菜酵素添加EM菌劑可顯著增加真菌、細(xì)菌菌落總數(shù)，發(fā)酵程度良好。

酵素通常因含有多種功效酶可有效進(jìn)行資源化利用，本研究對酵素的纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶及α-淀粉酶的酶活性進(jìn)行測定，分析說明酵素中功效酶含量較高，與饒毅萍等［29］的研究一致。4種功效酶的含量差距較大，其中纖維素酶相對活力最高，脂肪酶相對活力最低，與周新萍等［19］、張海燕等［23］和陳爽等［30］的研究結(jié)果相似，而蛋白酶酶活力較低，與蔡毅飛［21］的研究結(jié)果蛋白酶的相對活性最高不一致，推測可能與試驗采用的原料不同且試驗所選用原料相對單一有關(guān)。

4 結(jié)論

果蔬尾菜酵素具有相對穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境，但不同發(fā)酵階段中，微生物的種類和數(shù)量發(fā)生變化，各種反應(yīng)和微生物之間的相互影響，導(dǎo)致各項指標(biāo)在一定區(qū)間內(nèi)動態(tài)變化。絕大部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵底物為水果廢棄物，料液比為3∶10，添加紅糖（100 g/L）與EM菌劑（3 ml/L）時發(fā)酵效果最佳，菌落總數(shù)、pH密度等多項指標(biāo)較空白發(fā)酵組均有顯著提升。對果蔬尾菜酵素發(fā)酵過程中功效酶活性（纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，酵素發(fā)酵過程中，在不同因素影響下，酵素密度不斷下降，pH在一定區(qū)間內(nèi)保持穩(wěn)定變化；菌落總數(shù)不斷上升，含有一定數(shù)量的真菌、細(xì)菌，大部分不含大腸桿菌；功效酶活性不斷增加，纖維素酶活性較高，含有一定數(shù)量的α-淀粉酶及蛋白酶，脂肪酶酶活性較低。在發(fā)酵底物不同的情況下，酵素的微生物數(shù)量，酶活性存在較大差異。