孫華衛(wèi)，凌 冬，張道榮，唐 清，周芳菊，湯清益，劉先斌，王志順，湯三明，任喜峰

（1.襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北 襄陽 441057；2.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

1B/1R易位系是指小麥的1B染色體短臂被黑麥的1R染色體短臂取代而形成的小麥-黑麥易位系［1］。通常帶有來自黑麥的抗條銹基因Yr9、抗葉銹基因Lr26、抗稈銹基因Sr31和抗白粉病基因Pm8，同時具有較好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性，因此在國內(nèi)外小麥育種中得到廣泛應(yīng)用，然而隨著各種病理小種的突變和發(fā)展，多數(shù)1B/1R易位系已經(jīng)失去原有的抗性，同時1B/1R易位系還會帶來面粉面團(tuán)黏性增大、強(qiáng)度降低、烘烤品質(zhì)變劣等問題［2-4］。

小麥子粒蛋白質(zhì)主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，麥谷蛋白占面筋蛋白的35%左右，主要由高分子量谷蛋白亞基（GMW-GS）和低分子量谷蛋白亞基（LMW-GS）組成，其中高分子量谷蛋白亞基對面筋特性起著重要的作用，與小麥烘焙品質(zhì)密切相關(guān)，對品質(zhì)性狀具有決定性的作用［5］。高分子量谷蛋白亞基基因中的Dx5和Dy10是所有亞基基因中對烘焙品質(zhì)貢獻(xiàn)最大的基因，同時它們是一對緊密連鎖的基因［6］。本研究主要對高分子量谷蛋白亞基中的Ax2*、AxN、Bx7、By8、Dx5和Dy10基因進(jìn)行分子標(biāo)記的檢測。小麥子粒中的多酚氧化酶所催化的化學(xué)反應(yīng)是導(dǎo)致面制品酶促褐變的主要原因，其活性和面制品色澤褐變有密切的關(guān)系［7］。多酚氧化酶主效基因主要是位于染色體2AL和2DL上的Ppo-A1和Ppo-D1，Ppo-A1等位基因包括Ppo-A1a（高PPO活性）和Ppo-A1b（低PPO活性），Ppo-D1等位基因包括Ppo-D1a（低PPO活性）和Ppo-D1b（高PPO活性）［8］。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為挑選的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)相對較好的88份小麥親本材料，均來自襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥課題組，所有材料田間表現(xiàn)性狀一致。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 材料種植于襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院團(tuán)山鎮(zhèn)小麥試驗(yàn)地，在小麥幼苗期，取少量葉片于2 mL的離心管中，采用CTAB法提取小麥基因組DNA，詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及分子標(biāo)記檢測 試驗(yàn)相關(guān)分子標(biāo)記見表1。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含有2×SanTaqPCR Mix預(yù)混液5 μL（生工生物工程（上海）股份有限公司）、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、10～50 ng DNA模板1 μL、滅菌去離子水3.2 μL。

表1 分子標(biāo)記引物標(biāo)記序列、預(yù)期擴(kuò)增條帶大小及對應(yīng)的等位變異類型

2 結(jié)果與分析

2.1 1B/1R易位系檢測結(jié)果

標(biāo)記1B/1R在含有1B/1R異位系的材料中能夠擴(kuò)增出1 500 bp的片段（圖1a）。結(jié)果顯示，在88份親本材料中有19份材料含有1B/1R異位系，占總數(shù)的21.59%。

2.2 高分子量谷蛋白亞基檢測結(jié)果

Ax2*標(biāo)記在含有Ax2*基因的材料中能夠擴(kuò)增出1條1 319 bp的條帶（圖2a），AxN標(biāo)記在含有AxN基因的材料中能夠擴(kuò)增出1條920 bp的條帶（圖2b），標(biāo)記By8在含有亞基By8的品種中可擴(kuò)增出527 bp的片段（圖1b），標(biāo)記Bx7在含有亞基Bx7的品種中可擴(kuò)增出630 bp或766 bp的片段（圖3），Dx5標(biāo)記能夠在含有5+10亞基的材料中擴(kuò)增出450 bp的片段（圖4）。

圖1 標(biāo)記1B/1R（a）和By8（b）擴(kuò)增部分試驗(yàn)材料瓊脂糖凝膠電泳

圖3 標(biāo)記Bx7擴(kuò)增部分試驗(yàn)材料瓊脂糖凝膠電泳

圖4 標(biāo)記Dx5擴(kuò)增部分試驗(yàn)材料瓊脂糖凝膠電泳

在88份親本材料中，含有亞基Ax2*、AxN、Bx7、By8和Dx5的品種分別有4、51、81、31和38份，分別占總數(shù)的4.55%、57.95%、92.05%、35.23%和43.18%。

2.3 多酚氧化酶基因檢測結(jié)果

控制多酚氧化酶活性的基因檢測主要使用的標(biāo)記是PPO18和PPO29，能夠分別檢測2A和2D染色體上PPO等位基因。標(biāo)記PPO18在含有Ppo-A1a（高PPO活性）基因的材料中能夠擴(kuò)增出685 bp的片段（圖5），在含有Ppo-A1b（低PPO活性）基因的材料中能夠擴(kuò)增出876 bp的片段（圖5）。標(biāo)記PPO29在含有Ppo-D1a（低PPO活性）基因的材料中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2c），在含有Ppo-D1b（高PPO活性）基因的材料中能夠擴(kuò)增出490 bp的片段（圖2c）。

圖2 標(biāo)記Ax2*（a）、AxN（b）、PPO29（c）擴(kuò)增部分試驗(yàn)材料瓊脂糖凝膠電泳

圖5 標(biāo)記PPO18擴(kuò)增部分試驗(yàn)材料瓊脂糖凝膠電泳

在88份親本材料中，Ppo-A1a和Ppo-A1b基因型分別為40份和48份，頻率分別為45.45%和54.55%（表2）。Ppo-D1a和Ppo-D1b基因型分別為49份和39份，頻率分別為55.68%和44.32%?；蛐蚉po-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有29份，頻率為32.95%，基因型Ppo-A1a/Ppo-D1a（中等PPO）和Ppo-A1b/Ppo-D1b（中等PPO）的材料分別有20份和19份，頻率分別為22.73%和21.59%。基因型Ppo-A1a/Ppo-D1b（雙高PPO）的材料有20份，頻率為22.73%。

表2 供試小麥品種品質(zhì)基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果

2.4 含有多個優(yōu)質(zhì)基因親本篩選結(jié)果

88份親本材料中，含有1、7+8、5+10亞基，非1B/1R異位系和基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有2份，分別為鄭麥119和鄭麥578，頻率為2.27%。含有N、7+8、5+10亞基，非1B/1R異位系和基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有1份，為藁優(yōu)5766，頻率為1.14%。含有5+10亞基，非1B/1R異位系和基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有9份，分別為黃203、貴農(nóng)19、鄭麥119、SW18390、中麥1139、中梁96289、信麥28、鄭麥578和藁優(yōu)5766，頻率為10.23%。同時含有5+10亞基和非1B/1R異位系有31份親本，頻率為35.23%。含有低PPO活性基因的材料能夠改善面制品的色澤，含有5+10亞基和非1B/1R異位系的材料能夠提高面筋質(zhì)量，提高烘焙品質(zhì)，聚合多個優(yōu)質(zhì)基因的材料能夠有效地提高面粉的品質(zhì)。

3 討論

3.1 分子標(biāo)記檢測的實(shí)用性

相比于SDS-PAGE檢測法，分子標(biāo)記檢測具有準(zhǔn)確率高、工作量小、周期短等優(yōu)點(diǎn)。SDS-PAGE檢測法是根據(jù)高分子量谷蛋白亞基在SDS-PAGE凝膠上的遷移率來區(qū)分不同亞基的，不同亞基在凝膠上的遷移率并不總能與分子量一致［10］，會導(dǎo)致相應(yīng)的誤差。而分子標(biāo)記檢測是對遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確率高，效果好。SDS-PAGE檢測方法只能用小麥子粒進(jìn)行檢測，而分子標(biāo)記檢測能夠取材于植株的大部分時期和部位，不受發(fā)育時期的限制［11］。通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能夠加快優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥的育種進(jìn)程，提高選擇效率。

續(xù)表2

3.2 品質(zhì)基因分布及其運(yùn)用

不同組合的高分子量谷蛋白亞基對面團(tuán)強(qiáng)度和烘焙品質(zhì)的貢獻(xiàn)率不同：Glu-A1位點(diǎn)1>2*>N；Glu-B1位點(diǎn)7+8>13+16>17+18=7+9；Glu-D1位點(diǎn)5+10>2+12>4+12［12］。在88份親本材料中，亞基Ax2*的頻率為4.55%。Ax2*亞基是稀有優(yōu)質(zhì)亞基，在中國普通小麥中分布較少，2019年郝浩楠［13］檢測了294份中國核心小麥種質(zhì)資源，Ax2*亞基的分布頻率為3.68%，略低于本研究中Ax2*亞基的分布頻率。說明挑選的親本材料Ax2*亞基的分布頻率可觀，可加以利用。2015年陳泠等［14］對審定的127份品種進(jìn)行了高分子量谷蛋白亞基組成分析，亞基7+8的分布頻率是44.09%，亞基5+10的分布頻率是29.92%。本研究中亞基7+8的分布頻率是34.09%，亞基5+10的分布頻率是43.18%，亞基5+10比例有所提高。亞基組合1/2*、7+8、5+10的材料有5份，分別為鄭麥119、鄂麥25、鄂麥195、金優(yōu)18和鄭麥578，可優(yōu)先考慮小麥強(qiáng)筋育種的親本。

本研究中含有1B/1R異位系的材料占21.59%，與柳娜等［15］的結(jié)果47.1%相差較多，可能與親本的挑選有關(guān)。1B/1R異位系對面團(tuán)流變學(xué)特性、面包和面條品質(zhì)皆有極顯著的負(fù)面影響，選擇親本時應(yīng)謹(jǐn)慎，尤其在選育優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種時。

低PPO活性可降低面粉加工和貯藏過程中的褐變程度，具有低PPO活性的小麥品種更適合加工傳統(tǒng)面食。本研究中基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料頻率為32.95%，與肖永貴等［16］的研究結(jié)果32.5%比較一致。

理想的優(yōu)質(zhì)小麥品種（系）應(yīng)是聚合多個優(yōu)異基因，如同時含有7+8亞基、5+10亞基、非1B/1R易位以及雙位點(diǎn)低PPO活性（Ppo-A1b/Ppo-D1a）。本研究中符合上述條件的材料有3份，分別為鄭麥119、鄭麥578和藁優(yōu)5766，可作為培育優(yōu)質(zhì)小麥的親本材料。