劉利娟

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鶴壁 458030）

乳制品日漸成為成人和兒童的主要蛋白質(zhì)來源，而牛乳的組成比較復(fù)雜，其中含有3%～4%的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)能在機體內(nèi)氧化產(chǎn)生能量，是人體必需的能源物質(zhì)。乳蛋白中有較高的必需氨基酸利用率，是因為乳蛋白中含有多種人體所必需的氨基酸，且分子量較小，較易吸收[1]，所以牛乳中的蛋白是人類比較理想的優(yōu)質(zhì)蛋白。對于不同的樣品，怎樣選擇合適的前處理方法，怎樣達到最優(yōu)的檢測結(jié)果，已日益成為科學(xué)研究者們最關(guān)注的焦點。本文綜述了乳及乳制品中蛋白質(zhì)的檢測方法，尤其是方法的原理、優(yōu)缺點以及研究的現(xiàn)狀等，以便于選擇合適的乳及乳制品中蛋白質(zhì)檢測的方法。

1 凱氏定氮法

凱氏定氮法是1883 年凱氏發(fā)明的一種用于氮的測定的方法，這已成為分析化學(xué)中一個經(jīng)典的測量方法并且被廣泛使用。這種方法分兩個階段，最開始是經(jīng)典的凱氏定氮法，但是傳統(tǒng)的方法采用混合指示劑對顏色變化進行判斷滴定終點，誤差較大。為確保滴定結(jié)果的準確性，多采用電位滴定法或酸度計結(jié)合的方法完成測定。但是氨在蒸餾時容易發(fā)生倒吸，堿的加入量不好控制，故研制了自動定氮儀，它可以快速測定蛋白質(zhì)的含量，也可有效防止消化、蒸餾過程中的人為誤差，在提高效率的同時提高了檢測的準確性。

食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，用酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量[1]。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對凱氏定氮法和其他方法的比較研究甚多。如霍麗娜進行了杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定奶粉和糧食中氮及蛋白質(zhì)含量的研究分析，結(jié)果表明凱氏定氮法同杜馬斯燃燒法相比較，相對標準偏差更大，穩(wěn)定性較差，但杜馬斯燃燒法的測定結(jié)果略高于凱氏定氮法，因凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量是通過凱氏因子換算出來的，結(jié)果不包含所有的氮，所以測得的蛋白質(zhì)的含量較杜馬斯燃燒法偏低[2]。盧錦斌、張利敏[3]等人對改良凱氏定氮法進行了研究，國內(nèi)外主要圍繞消煮、蒸餾及滴定三個環(huán)節(jié)進行改良，其中消煮環(huán)節(jié)中，Bowman等[4]采用雙氧水測定法，大大地提高了測定的準確性。易中華、肖世平等人進行了水楊酸鈉比色法與凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量的比較研究，結(jié)果表明比色法比較簡單易行，比較適合基層實驗室推廣，但是比色法對環(huán)境污染比較大[5]。朱文秀等人進行了自動定氮儀法與國標凱氏定氮法測定油菜籽蛋白質(zhì)含量的比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自動定氮儀較國標大大縮短了工作時間，提高了工作效率，且此方法更易推廣[6]。

該方法的優(yōu)點是通用性強，測定費用低，易實現(xiàn)，儀器簡單且測定結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好，但也存在時間長、靈敏度低等缺點。凱氏定氮法測的是總蛋白的量，一些非蛋白氮無法檢測出，一些商販利用摻入非蛋白氮的方法牟取利益，例如三聚氰胺事件。對此2010 年6 月1 日新的國家標準開始實施，即GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》，此標準代替了GB/T 5009.5-2003，更加完善了蛋白質(zhì)檢測準確性的內(nèi)容。

2 分光光度法

2.1 雙縮脲法

近幾年國內(nèi)對雙縮脲法的研究與國外相比較多，如周艷星[7]對乳制品飲料中蛋白質(zhì)含量測定方法的比較分析，雙縮脲的方法可以快速測定蛋白質(zhì)，檢測結(jié)果準確，但是靈敏度不高。李宏梁等人的雙縮脲法和凱氏定氮法測定牛乳中酪蛋白質(zhì)量分數(shù)的比較研究。

該方法適合檢測總蛋白質(zhì)的含量，它具有操作簡單、測量速度快等優(yōu)點，但是標準物質(zhì)必須使用代表性很強的樣品，由于要使用其他參考方法測出標準物質(zhì)中的蛋白質(zhì)總含量，這種測定工作較為費力費時。所以雙縮脲法不宜用來測定樣品種類多、彼此差異大的樣品的總蛋白含量。

2.2 考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍法是由Bradford于1976年建立的，它有G-250和R-250 兩種，其原理是在酸性條件下，G-250 染料與堿性氨基酸以及芳香族氨基酸殘基結(jié)合，G-250 染料的最大吸收峰由465 nm 增加到595 nm，溶液顏色從棕黑色變?yōu)樗{色，樣品中蛋白質(zhì)的濃度與該染料的吸光度（595 nm）成正比關(guān)系[6]，從而測定蛋白質(zhì)的含量。

周艷星[7]等人進行了考馬斯亮藍法與雙縮脲法檢驗乳制品中蛋白質(zhì)含量的分析比較，結(jié)果顯示考馬斯亮藍法操作更加簡單，更加快速準確。馮昕等人進行了考馬斯亮藍法測定乳與乳制品中蛋白質(zhì)含量的研究，在牛血清白蛋白溶液中加入氨基酸及酚類物質(zhì)，該法精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，抗干擾能力強。南亞等人進行了考馬斯亮藍G-250 法快速測定牛乳中的蛋白質(zhì)的研究。

該方法具有高精度、高效率、檢測過程簡便、抗干擾能力強、所需試劑少等優(yōu)點，但此方法由于測定誤差大，不適用于不同蛋白的檢測，可應(yīng)用于醫(yī)療保健及食品行業(yè)的蛋白質(zhì)測定。

2.3 Folin－酚試劑法

Lowry 法是雙縮脲法的發(fā)展，它結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，是最靈敏的蛋白質(zhì)測定方法之一，在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物，該復(fù)合物在色氨酸殘基、芳香族氨基酸殘基、酪氨酸的作用下，使磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽還原，在750 nm 波長處有最大吸收。在一定的條件下，藍色深度與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。

國內(nèi)外近幾年采用福林酚法的文獻比較少，這種方法大部分被用來測低濃度的蛋白質(zhì)定量檢測，如高英等人用福林酚法測定腦蛋白水解物溶液中多肽的含量；黃滿紅等人對生活污水中蛋白質(zhì)測試方法進行了研究，由于生活污水中有腐殖質(zhì)物質(zhì)，研究還對該方法做出了改進，設(shè)置了2 個平行，從而提高了準確率。

該測定法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是耗費時間長，操作時間要精準的控制，標準曲線繪制麻煩，并且專一性較差，干擾物質(zhì)比較多。

2.4 茚三酮法

國內(nèi)外對茚三酮的研究相對較少，文獻中對茚三酮的研究主要是對蛋白質(zhì)水解度檢測。這種方法是比較古老的方法，國內(nèi)最新的研究是羅艷華等人進行蛋白水解物水解度測定研究，分別對OPA 法、TNBS 法、茚三酮比色法進行比較，發(fā)現(xiàn)茚三酮方法因吸光度波動大，方法的重現(xiàn)性差。另外還有楊文博等人對蛋白質(zhì)水解度測定方法的研究；檀志芬等對蛋白質(zhì)水解度的研究，這種方法非常靈敏，但是顯色劑穩(wěn)定性較差。

2.5 BCA 法

銅離子在蛋白質(zhì)的作用下還原成亞銅離子，在堿性條件下亞銅離子與BCA 結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物，在562 nm 處具有最大吸收峰。在一定條件下，復(fù)合物的吸光度值與蛋白質(zhì)的濃度成正比例關(guān)系。BCA 是一種極敏感的蛋白呈色劑，BCA 法的測定范圍較寬，測定蛋白質(zhì)簡單、靈敏且快捷。這種方法在醫(yī)學(xué)上的研究也很廣泛，如王麗等人利用BCA 法對百日咳疫苗中間品蛋白含量進行了有效性檢驗分析，此方法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、快速、準確的檢驗；曹玉華等人測神奇靈藥顆粒中的蛋白含量；周志軍等人用此法檢測人凝血因子中蛋白質(zhì)的含量，該方法步驟簡單，比經(jīng)典的Lowry 法快4 倍，且操作更加方便，檢測下限能夠降至25 μg/mL，最低檢測量為0.5 μg。

3 電泳法

3.1 SDS-PAGE 凝膠電泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠較好地對蛋白質(zhì)進行定性、定量分析，它根據(jù)濃縮膠和分離膠是否相連分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。由于在不連續(xù)系統(tǒng)中蛋白在進入分離膠之前可以等速濃縮，所以通常使用的是不連續(xù)系統(tǒng)。在以前的研究中用這種方法測的小肽等小分子比較多，而近幾年的研究中多用此方法來測定β-乳球蛋白和乳清蛋白的含量等，如韓奕奕等人用凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定對β-乳球蛋白的測定；金江玉等人將此方法廣泛應(yīng)用于液態(tài)乳中水解蛋白的摻假實驗等。

為了提高檢測的靈敏性，秦慧等人又對電泳做出了改進，進行了雙向電研究，改良了考馬斯亮藍染色法和銀染法，改良后蛋白質(zhì)靈敏性高，質(zhì)譜兼容性好。

3.2 高效毛細管電泳法

毛細管電泳（CE）作為一種最新的色譜分離技術(shù)，主要有毛細管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細管等速電泳（CIE）、毛細管等電聚焦（CIF）、毛細管凝膠電泳（CGE）及無膠篩分毛細管電泳（NGSCE）等多種模式。毛細管電泳具有選擇性和解析能力強、靈敏度高、樣品和溶劑消耗少、易于量化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析領(lǐng)域。

近幾年來對此法的研究多集中在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域，主要用于對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子的研究，如趙新穎等人在乳品蛋白檢測中有所應(yīng)用；李曉斌用于化妝品及食品分析研究；張慧潔等人使用毛細管電泳儀測定膠原蛋白的分子質(zhì)量分布；王有等人用毛細管電泳法代替凝膠電泳對蛋白質(zhì)和肽進行分離檢測。

毛細管電泳具有分離度極高、分離速率高、消耗樣品量少等優(yōu)點，但是因注射量小、波長有限等原因?qū)е聶z測濃度非常受限。

4 色譜法

4.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）具有簡單、準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，所以近年來越來越多的企業(yè)更傾向使用此法對蛋白進行檢測。它同氣相質(zhì)譜而言，能夠分離高沸點、受熱不穩(wěn)定的的混合物，所以應(yīng)用范圍更加廣泛。其缺點在于對分子結(jié)構(gòu)特性相似的蛋白難以達到完全分離，流動相試劑大多為有機試劑，對人體和環(huán)境都會造成不同程度的危害，且檢測成本較高。

近幾年使用該法對牛奶中的摻偽檢驗的研究比較多。如魏秀蓮等人用液相色譜法快速檢測牛奶中三聚氰胺的方法研究；黃艷紅等人用此方法測定乳品中的三聚氰胺。同時，該方法還可應(yīng)用于飼料、醫(yī)學(xué)等方面的研究，例如魏姜勉建立了高效飼料氨基酸檢測方法，方法適用于大豆、豆粕、魚粉和混合飼料的檢驗中；張連龍采用高效液相色譜雙柱法測定了低聚異麥芽糖含量。

4.2 HPLC 聯(lián)用技術(shù)

高效液相色譜聯(lián)用的技術(shù)應(yīng)用廣泛，主要有高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（HPLC-ICP-AES）、高效液相色譜-毛細管電泳（HPLC-CE）、高效液相色譜-等速電泳（HPLC-ITP）等。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠有效分離和鑒定難揮發(fā)、高沸點和熱不穩(wěn)定化合物，廣泛地應(yīng)用于食品、環(huán)保、生化、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

國內(nèi)外對此法均有研究，如甘賓賓等人將該技術(shù)運用在食品安全中；蔡勤仁等人用此法對飼料中的三聚氰胺進行測定；國外的Monfort Ana?lle 等人采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）同時定量母乳中19 種分析物。

5 結(jié)束語

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測乳及乳制品中蛋白質(zhì)的方法也在不斷地改進，方法之間的檢出限、檢測精度、適用范圍不同，不同的方法均有自身的優(yōu)缺點。雖然新建立的許多方法操作簡單、檢測快速、靈敏度和重現(xiàn)性良好，但存在檢測費用高、不能夠大批量檢測等缺點。因此，對于乳及乳制品的檢驗，建立可操作性強、適用范圍廣、檢測成本低的最快速、最微量的檢驗方法將是未來研究的重點方向。