鄧紅,陸美霞,歐陽(yáng)歆怡,雍蕾,鄧捷,葉喜德
1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004
天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elataBL.屬植物的干燥塊莖,有平肝息風(fēng)、通絡(luò)止痛之功,常用治驚痛抽搐、肢體麻木、眩暈等證[1]。主含多糖、酚類、揮發(fā)油、苷類等成分,有降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗頭痛、抗氧化、抗凝血、抗炎等多種藥效作用[2-3]。對(duì)天麻炮制方法,歷代文獻(xiàn)多有記載。如《雷公炮炙論》首載“蒺藜子制天麻”法[4];唐代《銀海精微》載“天麻炒至性存”[5];《顱囟經(jīng)》以“酒浸一夜”[6];《補(bǔ)輯新修本草》有“爆干”制法[7]。宋代文獻(xiàn)常以酒制天麻為主,如《史載之方》《太平惠民和劑局方》《傳信適用方》《扁鵲心書》等[8]。而“姜制法”早在清《幼幼集成》就有記載[9];直到現(xiàn)代,炮制天麻常以蒸制和切制法為主,對(duì)輔料炮制研究較少。
姜制天麻是江西“建昌幫”特色飲片。生姜為辛溫之品,有“嘔家圣藥”之稱[10],所以“建昌幫”提出天麻經(jīng)姜制后,可祛除天麻之麻味,以減少嘔吐之副作用[5],達(dá)到炮制減毒增效之目的。但姜制對(duì)天麻藥效的影響,主要是通過影響其成分變化而實(shí)現(xiàn)。研究表明[11],采用HPLC 法測(cè)定姜制天麻與蒸制、硫黃熏蒸品中天麻素含量時(shí),發(fā)現(xiàn)姜天麻中天麻素含量明顯高于其他炮制品。本課題組前期以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法、多指標(biāo)成分評(píng)價(jià),考察了姜天麻炮制工藝[12];并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法,分析了姜天麻炮制前后揮發(fā)成分變化差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜制對(duì)天麻中的化學(xué)成分含量影響較大[13]。基于此,為深入研究姜制對(duì)天麻作用的影響,本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地不同批次天麻為研究對(duì)象,以比較天麻姜制前后主要成分變化差異,目的是探討姜制對(duì)天麻主要化學(xué)成分變化的影響,為深入研究姜制天麻炮制機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。
Agilent1100 高效液相色譜儀,電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9076MBE,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),超聲波清洗器(KQ-500E,昆山市超聲儀器有限公司),低速離心機(jī)(TDL-80-2C,上海安亭儀器廠),十萬(wàn)分之一電子天平(FA1004N,上海精密科學(xué)儀器有限公司),數(shù)字恒溫水浴鍋(HH-6,國(guó)華電器有限公司)。
天麻素(批號(hào)150927,純度≥98%)、對(duì)羥基苯甲醇(批號(hào)150708,純度≥98%)購(gòu)于四川省維克奇生物有限公司;巴利森苷E(PE,批號(hào)CHB180224,純度≥98%),巴利森苷A(PA,批號(hào)CHB180232,純度≥98%),巴利森苷B(PB,批號(hào)CHB180233,純度≥98%),巴利森苷C(PC,批號(hào)CHB180234,純度≥98%)均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司;無水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(色譜純)均購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司;純凈水購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;天麻藥材來源信息見表1。天麻和生姜經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉應(yīng)蛟副教授分別鑒定為蘭科天麻(Gastrodia elataBL.)干燥塊莖、姜科植物姜(Zingiber officinaleRosc)的新鮮根莖。
表1 10批次天麻藥材來源信息
根據(jù)《建昌幫炮制規(guī)范》中姜制天麻法取原藥材,加入12%姜汁(1 kg 生姜用1 kg 水),悶潤(rùn)1~2 d,中間顛簸,撒上適量的明礬粉,攪拌均勻,待生姜、礬汁充分吸收后,撈起曬去表皮的水分,用武火隔水蒸1~2 h;放入硫黃柜用定量的硫黃(100 kg 藥材用0.5 kg 硫黃)熏2~3 h,取出;切斜薄片或長(zhǎng)薄片晾曬干,即得。
色譜柱Diamonsil-C18(4.6 mm×200 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.05%磷酸溶液,梯度洗脫:0~20 min,5%→30%A;20~25 min,30%→95%A;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。
精密稱取各對(duì)照品適量,加乙腈-水(3∶97)溶液制成1 mL 分別含天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 分別為1.003、0.308、0.508、0.994、0.474、0.444 mg 的混合對(duì)照品溶液,備用。
取天麻生品和姜制天麻粉末各2 g,精密稱定后加30 mL 70%乙醇,稱定重量后在80 ℃下超聲(400 W,40 kHz)40 min,放冷,用70%乙醇補(bǔ)足重量,濾過,精密吸取續(xù)濾液10 mL 于蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,殘?jiān)靡译?水(3∶97)復(fù)溶后移至10 mL 容量瓶中并定容至刻度,濾過,取適量濾液離心(3 000 r/min)10 min,過0.22 μm 濾膜,得供試品溶液,備用。
將混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各進(jìn)樣10 μL,按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定,結(jié)果天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 保留時(shí)間分別為6.492、9.832、14.611、15.632、17.533、11.500 min,各色譜峰分離度良好,見圖1。
圖1 HPLC圖:A.混合對(duì)照品;B.生天麻;C.姜天麻
將“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液分別精密吸取1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶,用乙腈-水(3 ∶97)稀釋至刻度,各精密吸取10 μL,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件,以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。
表2 回歸方差、相關(guān)系數(shù)、線性范圍檢測(cè)結(jié)果
按“2.2”項(xiàng)下色譜條件,將混合對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣6 針,并計(jì)算出天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 6 個(gè)成分峰面積的RSD 值分別為0.11%、0.18%、0.43%、0.80%、0.32%、0.70%,表明儀器精密度良好。
采用“2.4”項(xiàng)下方法,將同一批供試品粉末平行制備6 份樣品溶液,按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè),并計(jì)算6 個(gè)指標(biāo)成分峰面積RSD 值,結(jié)果分別為1.20%、1.50%、1.40%、1.80%、2.00%、1.30%,說明方法重復(fù)性良好。
按“2.3”項(xiàng)下色譜條件,檢測(cè)制備0、2、4、8、12、24 h 后的同一天麻供試品溶液,并計(jì)算出6 個(gè)指標(biāo)成分峰面積RSD 分別為1.10%、0.50%、0.30%、1.20%、1.10%、0.90%,說明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
稱量已知含量樣品(S1)適量,分別加入高、中、低三種不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(6 種成分高、中、低濃度分別為天麻素:1.003、0.669、0.502 mg/mL;對(duì)羥基苯甲醇:0.308、0.205、0.154 mg/mL;PA:0.508、0.339、0.254 mg/mL;PB:0.994、0.663、0.497 mg/mL;PC:0.474、0.316、0.237 mg/mL;PE:0.444、0.296、0.222 mg/mL),按照“2.4”的步驟進(jìn)行配制,并對(duì)6 個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行了測(cè)定,計(jì)算出6 個(gè)指標(biāo)成分平均回收率為99.80 %、100.67 %、98.44 %、99.81 %、99.89 %、101.66 %,RDS 分別為2.30 %、2.50 %、3.10 %、2.80 %、2.10 %、2.80 %。
取10 批天麻及10 批姜制品粉末,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè),記錄色譜圖和峰面積,計(jì)算各指標(biāo)成分含量,結(jié)果顯示天麻姜制前后6 個(gè)指標(biāo)成分均有明顯的變化。姜制前后天麻素含量范圍分別為0.15%~0.54%、0.32%~0.72%;對(duì)羥基苯甲醇分別為0.01%~0.14 %、0.01%~0.10%;PA 分別為0.20%~1.31%、0.27%~0.95%;PB 分別為0.18%~0.61%、0.23%~0.66%;PC 為0.02%~0.11%、0.06%~0.16%;PE 為0.09%~0.19%、0.12%~0.31%。結(jié)果表明天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高,對(duì)羥基苯甲醇、PA 含量有所下降,見表3、表4。
表3 天麻含量測(cè)定結(jié)果 %
表4 姜天麻含量測(cè)定結(jié)果 %
天麻素、巴利森苷、對(duì)羥基苯甲醇、腺苷等均為天麻主要活性成分[14]。在《中國(guó)藥典》(2020 版)中,僅以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇兩個(gè)成分作為天麻質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]。研究表明,天麻多糖具降血脂、鎮(zhèn)痛、提高免疫力、改善記憶、抗焦慮、抗驚厥、抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制心臟肥大和纖維化改善代謝等多種作用[15],說明天麻活性成分可通過多種途徑發(fā)揮多靶點(diǎn)藥理作用。為此,本研究為擴(kuò)大天麻活性成分檢測(cè)范圍,以天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 等6 個(gè)成分為研究對(duì)象,并作為姜制天麻炮制前后主要差異成分的檢測(cè)指標(biāo),目的是探討姜制對(duì)天麻主要成分變化的影響,為深入研究天麻炮制機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。
結(jié)果表明,天麻經(jīng)姜制后其主要成分含量均有不同程度的變化,其中天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高,對(duì)羥基苯甲醇、PA 含量下降。而造成這種成分含量變化的主要原因,可能是由于天麻中的巴利森苷類成分,容易在外力作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化所致,如巴利森苷A 可在自身酶作用下降解為對(duì)羥基苯甲醇與巴利森苷B[16]。依照本實(shí)驗(yàn)對(duì)羥基苯甲醇含量下降結(jié)果,可間接說明該化合物有可能發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,但這種變化的深層次原因仍需有待深入探究。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)建立天麻6 個(gè)指標(biāo)成分的測(cè)量方法,可為天麻和姜天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù),也為深入研究天麻炮制變化機(jī)理提供參考。