鄧紅，陸美霞，歐陽歆怡，雍蕾，鄧捷，葉喜德

1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elataBL.屬植物的干燥塊莖，有平肝息風、通絡止痛之功，常用治驚痛抽搐、肢體麻木、眩暈等證［1］。主含多糖、酚類、揮發(fā)油、苷類等成分，有降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗頭痛、抗氧化、抗凝血、抗炎等多種藥效作用［2-3］。對天麻炮制方法，歷代文獻多有記載。如《雷公炮炙論》首載“蒺藜子制天麻”法［4］；唐代《銀海精微》載“天麻炒至性存”［5］；《顱囟經》以“酒浸一夜”［6］；《補輯新修本草》有“爆干”制法［7］。宋代文獻常以酒制天麻為主，如《史載之方》《太平惠民和劑局方》《傳信適用方》《扁鵲心書》等［8］。而“姜制法”早在清《幼幼集成》就有記載［9］；直到現(xiàn)代，炮制天麻常以蒸制和切制法為主，對輔料炮制研究較少。

姜制天麻是江西“建昌幫”特色飲片。生姜為辛溫之品，有“嘔家圣藥”之稱［10］，所以“建昌幫”提出天麻經姜制后，可祛除天麻之麻味，以減少嘔吐之副作用［5］，達到炮制減毒增效之目的。但姜制對天麻藥效的影響，主要是通過影響其成分變化而實現(xiàn)。研究表明［11］，采用HPLC 法測定姜制天麻與蒸制、硫黃熏蒸品中天麻素含量時，發(fā)現(xiàn)姜天麻中天麻素含量明顯高于其他炮制品。本課題組前期以正交試驗設計法、多指標成分評價，考察了姜天麻炮制工藝［12］；并通過氣相色譜-質譜聯(lián)用方法，分析了姜天麻炮制前后揮發(fā)成分變化差異，結果發(fā)現(xiàn)姜制對天麻中的化學成分含量影響較大［13］?；诖?，為深入研究姜制對天麻作用的影響，本實驗以不同產地不同批次天麻為研究對象，以比較天麻姜制前后主要成分變化差異，目的是探討姜制對天麻主要化學成分變化的影響，為深入研究姜制天麻炮制機理提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗儀器和材料

1.1 儀器

Agilent1100 高效液相色譜儀，電熱鼓風干燥箱（GZX-9076MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司），低速離心機（TDL-80-2C，上海安亭儀器廠），十萬分之一電子天平（FA1004N，上海精密科學儀器有限公司），數(shù)字恒溫水浴鍋（HH-6，國華電器有限公司）。

1.2 試劑試藥

天麻素（批號150927，純度≥98%）、對羥基苯甲醇（批號150708，純度≥98%）購于四川省維克奇生物有限公司；巴利森苷E（PE，批號CHB180224，純度≥98%），巴利森苷A（PA，批號CHB180232，純度≥98%），巴利森苷B（PB，批號CHB180233，純度≥98%），巴利森苷C（PC，批號CHB180234，純度≥98%）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（色譜純）均購于西隴科學股份有限公司；純凈水購于杭州娃哈哈集團有限公司；天麻藥材來源信息見表1。天麻和生姜經江西中醫(yī)藥大學藥學院劉應蛟副教授分別鑒定為蘭科天麻（Gastrodia elataBL.）干燥塊莖、姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc）的新鮮根莖。

表1 10批次天麻藥材來源信息

2 實驗方法與結果

2.1 姜天麻的制備

根據(jù)《建昌幫炮制規(guī)范》中姜制天麻法取原藥材，加入12%姜汁（1 kg 生姜用1 kg 水），悶潤1～2 d，中間顛簸，撒上適量的明礬粉，攪拌均勻，待生姜、礬汁充分吸收后，撈起曬去表皮的水分，用武火隔水蒸1～2 h；放入硫黃柜用定量的硫黃（100 kg 藥材用0.5 kg 硫黃）熏2～3 h，取出；切斜薄片或長薄片晾曬干，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱Diamonsil-C18（4.6 mm×200 mm,5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫：0～20 min，5%→30%A；20～25 min，30%→95%A；檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3 標準品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加乙腈-水（3∶97）溶液制成1 mL 分別含天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 分別為1.003、0.308、0.508、0.994、0.474、0.444 mg 的混合對照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取天麻生品和姜制天麻粉末各2 g，精密稱定后加30 mL 70%乙醇，稱定重量后在80 ℃下超聲（400 W，40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇補足重量，濾過，精密吸取續(xù)濾液10 mL 于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣用乙腈-水（3∶97）復溶后移至10 mL 容量瓶中并定容至刻度，濾過，取適量濾液離心（3 000 r/min）10 min，過0.22 μm 濾膜，得供試品溶液，備用。

2.5 系統(tǒng)專屬性與適應性考察

將混合對照品溶液和供試品溶液各進樣10 μL，按“2.2”項下條件測定，結果天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 保留時間分別為6.492、9.832、14.611、15.632、17.533、11.500 min，各色譜峰分離度良好，見圖1。

圖1 HPLC圖：A.混合對照品；B.生天麻；C.姜天麻

2.6 線性關系考察

將“2.3”項下的對照品溶液分別精密吸取1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶，用乙腈-水（3 ∶97）稀釋至刻度，各精密吸取10 μL，按“2.2”項下色譜條件，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2。

表2 回歸方差、相關系數(shù)、線性范圍檢測結果

2.7 精密度考察

按“2.2”項下色譜條件，將混合對照溶液連續(xù)進樣6 針，并計算出天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 6 個成分峰面積的RSD 值分別為0.11%、0.18%、0.43%、0.80%、0.32%、0.70%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性考察

采用“2.4”項下方法，將同一批供試品粉末平行制備6 份樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進行檢測，并計算6 個指標成分峰面積RSD 值，結果分別為1.20%、1.50%、1.40%、1.80%、2.00%、1.30%，說明方法重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性考察

按“2.3”項下色譜條件，檢測制備0、2、4、8、12、24 h 后的同一天麻供試品溶液，并計算出6 個指標成分峰面積RSD 分別為1.10%、0.50%、0.30%、1.20%、1.10%、0.90%，說明供試品在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

稱量已知含量樣品（S1）適量，分別加入高、中、低三種不同濃度混合標準品溶液（6 種成分高、中、低濃度分別為天麻素：1.003、0.669、0.502 mg/mL；對羥基苯甲醇：0.308、0.205、0.154 mg/mL；PA：0.508、0.339、0.254 mg/mL；PB：0.994、0.663、0.497 mg/mL；PC：0.474、0.316、0.237 mg/mL；PE：0.444、0.296、0.222 mg/mL），按照“2.4”的步驟進行配制，并對6 個指標成分進行了測定，計算出6 個指標成分平均回收率為99.80 %、100.67 %、98.44 %、99.81 %、99.89 %、101.66 %，RDS 分別為2.30 %、2.50 %、3.10 %、2.80 %、2.10 %、2.80 %。

2.11 含量測定

取10 批天麻及10 批姜制品粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進行檢測，記錄色譜圖和峰面積，計算各指標成分含量，結果顯示天麻姜制前后6 個指標成分均有明顯的變化。姜制前后天麻素含量范圍分別為0.15%～0.54%、0.32%～0.72%；對羥基苯甲醇分別為0.01%～0.14 %、0.01%～0.10%；PA 分別為0.20%～1.31%、0.27%～0.95%；PB 分別為0.18%～0.61%、0.23%～0.66%；PC 為0.02%～0.11%、0.06%～0.16%；PE 為0.09%～0.19%、0.12%～0.31%。結果表明天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高，對羥基苯甲醇、PA 含量有所下降，見表3、表4。

表3 天麻含量測定結果 %

表4 姜天麻含量測定結果 %

3 討論

天麻素、巴利森苷、對羥基苯甲醇、腺苷等均為天麻主要活性成分［14］。在《中國藥典》（2020 版）中，僅以天麻素和對羥基苯甲醇兩個成分作為天麻質量評價指標［1］。研究表明，天麻多糖具降血脂、鎮(zhèn)痛、提高免疫力、改善記憶、抗焦慮、抗驚厥、抑制心肌細胞凋亡、抑制心臟肥大和纖維化改善代謝等多種作用［15］，說明天麻活性成分可通過多種途徑發(fā)揮多靶點藥理作用。為此，本研究為擴大天麻活性成分檢測范圍，以天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 等6 個成分為研究對象，并作為姜制天麻炮制前后主要差異成分的檢測指標，目的是探討姜制對天麻主要成分變化的影響，為深入研究天麻炮制機理提供數(shù)據(jù)支撐。

結果表明，天麻經姜制后其主要成分含量均有不同程度的變化，其中天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高，對羥基苯甲醇、PA 含量下降。而造成這種成分含量變化的主要原因，可能是由于天麻中的巴利森苷類成分，容易在外力作用下發(fā)生結構變化所致，如巴利森苷A 可在自身酶作用下降解為對羥基苯甲醇與巴利森苷B［16］。依照本實驗對羥基苯甲醇含量下降結果，可間接說明該化合物有可能發(fā)生結構變化，但這種變化的深層次原因仍需有待深入探究。綜上所述，本實驗建立天麻6 個指標成分的測量方法，可為天麻和姜天麻質量標準研究提供依據(jù)，也為深入研究天麻炮制變化機理提供參考。