劉威，黃文峰，周云，孟凡，何良梅

贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000

克羅恩病是一種炎癥性腸病，尚不清楚該疾病的發(fā)病機(jī)制，主要是遺傳、免疫、環(huán)境與腸道微生物生態(tài)等多重因素相互作用的結(jié)果［1］?？肆_恩病變具有進(jìn)展性發(fā)展或反復(fù)急性發(fā)作，具有較高的發(fā)病率，可發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，并且給家庭和個(gè)人帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。近幾年發(fā)現(xiàn)機(jī)體的免疫系統(tǒng)與腸道菌群有著緊密的聯(lián)系，腸道微生物通過新陳代謝調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，而腸道系統(tǒng)能夠主動(dòng)調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性從而來影響機(jī)體健康［3］。最新研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌脂多糖（LPS）和1,3-β-D 葡聚糖可激活腸道免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)，可能參與克羅恩病的發(fā)生過程［4］。本研究通過研究微生物多糖調(diào)控克羅恩病腸道炎癥免疫反應(yīng)的機(jī)制，為全面解析克羅恩病的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60 只6-8 周齡健康雄性BABL/c 小鼠，體重18～22 g，購自南昌醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證SCXK（鄂）2019-0001，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司］，將小鼠在濕度為50%、溫度為24 ℃左右條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.1.2 主要試劑微生物多糖（北京博奧澤科技有限公司）；2，4，6 三硝基苯磺酸（TNBS）50 g/L 水溶液（合肥吉之暢公司）；無水乙醇（合肥吉之暢公司）；PCR 試劑盒（北京靈寶科技公司）；ELISA試劑盒（北京博奧澤科技有限公司）；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）多克隆抗體（上海金穗生物科技公司）；兔源Toll 樣受體4（TLR4）抗體（廣州創(chuàng)融生物科技公司）；兔源MyD88 抗體（廣州創(chuàng)融生物科技公司）；兔源NF-κBp65 抗體（廣州創(chuàng)融生物科技公司）。

1.1.3 主要儀器PCR 儀（美國ABI 公司）；電泳儀槽（北京六一儀器廠）；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng) ［亞速旺（上海）商貿(mào)公司］；離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組和建模方法將小鼠隨機(jī)分為三組，分別為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組20 只。實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠正常飲食，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。首先構(gòu)建克羅恩病，實(shí)驗(yàn)組和模型組小鼠參照Kim等［5］的方法建立克羅恩病模型，按TNBS 水溶液：50% 乙醇（1∶1）混合，100 μL 肛門灌注一次，造模前禁食24 h、不禁水。對(duì)照組小鼠肛門灌注100 μL 生理鹽水。液體緩慢灌注完畢，拔出導(dǎo)管，保持小鼠倒立姿勢(shì)60 s，灌腸后正常飼養(yǎng)。每日觀察并記錄小鼠疾病活動(dòng)性狀，若連續(xù)3 d 小鼠體重持續(xù)下降，出現(xiàn)血便則造模成功。造模完成后，實(shí)驗(yàn)組小鼠給予灌胃已制備好的微生物多糖溶液0.25 mL/次，模型組和對(duì)照組小鼠灌胃等量的無菌水，2 次/d，連續(xù)21 d。21 d 后將小鼠頸椎脫臼法處死，取肛門至回盲腸管。

1.2.2 疾病活動(dòng)度評(píng)分每天記錄每組小鼠的體重、大便性狀及便血情況，計(jì)算各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分［6］。小鼠皮毛光滑程度、糞便隱血、直腸脫垂、糞便形態(tài)及腹瀉的情況都是該指數(shù)的組成部分。由體重減失率分?jǐn)?shù)和大便隱血程度分?jǐn)?shù)相加而得，DAI 評(píng)分為（體重減輕+大便稠度+大便隱血）/3。分值在0～8，體重減失率（%）=（實(shí)驗(yàn)前體重-造模后體重）/實(shí)驗(yàn)前體重×100%。體重減輕率：正常為0 分，1%～5%為1 分，5%～10%為2 分，11%～15%為3 分，＞15%為4 分；糞便性狀：正常為0 分，介于正常和糊狀便之間為1 分，糊狀便為2 分，介于糊狀便和腹瀉之間為3 分，腹瀉為4 分；隱血情況：正常為0 分，隱血陽性為2 分，肉眼可見出血為4 分。其DAI 評(píng)分越高，疾病的癥狀越嚴(yán)重。

1.2.3 組織病理學(xué)評(píng)分PBS 洗滌結(jié)腸組織，乙醇脫水，二甲苯清洗，包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。參照組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］，僅為結(jié)構(gòu)改變（0 分）；可見慢性炎癥（1 分）；固有層見中性粒細(xì)胞浸潤（2 分）；上皮層見中性粒細(xì)胞浸潤（3分）；隱窩結(jié)構(gòu)破壞（4 分）；見糜爛或潰瘍（5 分）。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達(dá)水平 抽取大鼠腹主動(dòng)脈血，4 ℃ 3 500 r/min 離心5 min，按照ELISA 試劑盒說明，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 的含量。

1.2.5 Western blotting 分析將-80 ℃各組大鼠結(jié)腸組織勻漿后，提取總蛋白，用3 000 r/min 的離心機(jī)離心10 min，取上清液。電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST 清洗后，加入一抗TLR4、MyD88 和NFκB p65（1∶1 000），孵育，添加二抗（1∶5 000）、孵育2 h，分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠DAI 評(píng)分、結(jié)腸長度、結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分比較

與對(duì)照組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠DAI 評(píng)分明顯升高；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠DAI 評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短，且具有明顯充血腫脹；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸長度伸長，充血腫脹情況改善（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組及實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。見表1 及圖1。

表1 各組大鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸長度、結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分比較（）

表1 各組大鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸長度、結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分比較（）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05。

圖1 結(jié)腸組織病理切片（HE染色×200）：A.對(duì)照組；B.模型組；C.實(shí)驗(yàn)組

2.2 各組大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平升高，IL-10 表達(dá)水平降低；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平降低，IL-10 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)水平比較（） pg/mL

表2 血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)水平比較（） pg/mL

2.3 各組小鼠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平均明顯升高；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65 蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組小鼠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05。

3 討論

克羅恩病是炎癥性腸病的一種，針對(duì)該疾病的確切發(fā)病機(jī)制沒有明確的定論，多數(shù)研究認(rèn)為和遺傳、環(huán)境、感染、免疫系統(tǒng)異常及腸道炎癥相關(guān)［7］。其中免疫因素是重要的發(fā)病因素，主要原因是免疫細(xì)胞會(huì)調(diào)控炎癥反應(yīng)，免疫因素紊亂，導(dǎo)致發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)生炎癥性腸病［8］。目前已研究證實(shí)，腸道黏膜免疫系統(tǒng)所致的炎癥反應(yīng)在克羅恩病的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，是導(dǎo)致腸道損傷、功能障礙的重要原因［9］。實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸長度長于模型組，表明微生物多糖可以增加克羅恩病小鼠的體重及結(jié)腸長度。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平降低，IL-10表達(dá)水平升高，提示微生物多糖通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)改善小鼠的炎癥反應(yīng)。

TLR 主要作用是識(shí)別病原微生物，而TLR4 主要是通過非特異性的方式結(jié)合并啟動(dòng)病原相關(guān)分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，釋放腸道的炎癥介質(zhì)，參與克羅恩病的發(fā)病。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在正常人的腸道中TLR4 水平降低，但在克羅恩病中有著較高的表達(dá)水平，這證明了TLR4 在克羅恩病中的作用［10］?？肆_恩病小鼠模型的MyD88 蛋白水平明顯高于對(duì)照組。MyD88 含有TLR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，與Toll 的結(jié)構(gòu)域相互作用，TLR4 可以激活MyD88 通路，最終激活NF-κB，NF-κB 是激活炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。但微生物多糖調(diào)控后，MyD88 的表達(dá)降低，所以微生物多糖抑制這一通路。NF-κB廣泛存在于各種組織中，主要作用是調(diào)節(jié)炎癥，同時(shí)也是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在腫瘤及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用。研究表明NF-κBP65 蛋白在克羅恩病高表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)了在模型組小鼠中NF-κBP65 的蛋白水平明顯高于對(duì)照組，證明TLR4/MyD88/NF-κB 在克羅恩病炎癥反應(yīng)中有著重要的作用。

綜上所述，克羅恩病結(jié)腸組織中有著高表達(dá)的TLR4、MyD88 和NFκB，并且微生物多糖是通過TLR4/MyD88/NF-κB 通路調(diào)控克羅恩病腸道炎癥免疫反應(yīng)。