莫景康，蘇可盈，黎紹基

（廣州工商學(xué)院，廣東廣州 510000）

益生菌是與人體形成共生關(guān)系并對(duì)人體健康有利的微生物，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[1-3]。常見的益生菌包括乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌以及球菌等[4]。益生菌在腸道內(nèi)可以產(chǎn)生分解酶，分解腸道中游離的氨類以及吲哚等有害物質(zhì)，降低有害物質(zhì)對(duì)身體的侵蝕。益生菌不僅能夠促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)身體免疫力、緩解過敏反應(yīng)等，還具有預(yù)防癌癥以及降低膽固醇的功能，能夠產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，激活免疫系統(tǒng)將致癌菌、腸毒素等排出體外，減少癌癥發(fā)病率，還可以通過同化作用抑制膽固醇合成，減少人體對(duì)膽固醇的吸收，維護(hù)腸道健康[5-6]。此外，益生菌對(duì)腸道病原體也有抑制作用[7]。大腸桿菌是重要的腸道病原體，益生菌的抑菌活性是衡量益生菌產(chǎn)品的重要指標(biāo)。

體外消化模型可用于模擬人體腸道消化的真實(shí)生理環(huán)境，通過控制實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的投放，觀察和干預(yù)實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的消化情況和相互作用。體外消化模型可以分為靜態(tài)模型、動(dòng)態(tài)模型等[8-9]，其中靜態(tài)模型制作簡(jiǎn)單，應(yīng)用最為廣泛[10]。張林奇等[11]利用體外腸道模型對(duì)6種益生菌粉進(jìn)行模擬消化的耐受性分析，發(fā)現(xiàn)6種益生菌粉與標(biāo)識(shí)均存在差異。

益生菌的抑菌作用是其重要功能，其在腸道中的活性對(duì)其發(fā)揮益生作用至關(guān)重要。本文研究了益生菌沖劑中的益生菌對(duì)大腸桿菌的抑菌作用，并通過靜態(tài)體外消化模型研究了益生菌沖劑中的益生菌在經(jīng)過胃腸道消化后的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS固體培養(yǎng)基、豬膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰酶、胃蛋白酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS液體培養(yǎng)基，杭州百思生物技術(shù)有限公司；ATCC2592大腸埃希氏菌（大腸桿菌），上海保藏生物技術(shù)中心。

3種益生菌沖劑產(chǎn)品（A、B、C）中的益生菌信息見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用益生菌沖劑信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將有效期內(nèi)的3種益生菌沖劑產(chǎn)品中的益生菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)活化，每24 h傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)菌培養(yǎng)液于4 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液，用生理鹽水懸浮，重復(fù)以上離心、懸浮、離心步驟，最后用新鮮的MRS液體培養(yǎng)基懸浮并稀釋至所需濃度。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)

活菌計(jì)數(shù)依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35—2016）[12]和張林奇等[11]所述的乳桿菌和嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)方法?；罹鷶?shù)達(dá)成率為實(shí)際活菌數(shù)占標(biāo)稱活菌數(shù)的百分比。

1.2.3 大腸桿菌抑菌活性的測(cè)定

大腸桿菌抑菌活性的測(cè)定方法借鑒參考文獻(xiàn)[7]的方法。將大腸桿菌均勻分布于MRS固體培養(yǎng)基表面，取直徑為6 mm的滅菌小圓紙片，蘸取微量益生菌培養(yǎng)液（3種產(chǎn)品益生菌接種濃度統(tǒng)一為2.5×107CFU·mL-1）置于培養(yǎng)基表面，密封膜密封后倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，對(duì)比3種產(chǎn)品中益生菌的抑菌能力。

1.2.4 體外模擬胃腸道消化

（1）人工胃液和腸液的配制。配制方法參照文獻(xiàn)[13]，具體有以下幾方面。①人工胃液的配制。取稀鹽酸（6 mol·L-1）16.4 mL，加入800 mL去離子水?dāng)嚢杌旌?。調(diào)pH值至2.5，將其倒入1 000 mL容量瓶，加入去離子水定容。高壓滅菌后冷卻至室溫，加入10 g胃蛋白酶，攪拌至完全溶解。②人工腸液的配制。稱取6.8 g磷酸二氫鉀，加入500 mL去離子水?dāng)嚢柚寥芙?。用氫氧化鈉（0.1 mol·L-1）調(diào)節(jié)pH值至6.8，繼續(xù)加入去離子水定容至1 L，高壓滅菌后冷卻至室溫，加入豬膽鹽3 g，胰蛋白酶10 g，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙狻?/p>

（2）3種益生菌沖劑活性的測(cè)定。通過體外模擬胃腸道消化測(cè)定3種益生菌沖劑的活性。將1 mL濃度為7.5×107CFU·mL-1的菌液加至20 mL人工胃液中，密封，并于37 ℃中以90 r·min-1恒溫?fù)u蕩培養(yǎng)1 h，然后加入80 mL人工腸液，密封后再放入37 ℃振蕩機(jī)中，120 r·min-1繼續(xù)搖蕩培養(yǎng)2 h。以接種菌液的MRS液體培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照，以無接種菌液的人工胃、腸液為陰性對(duì)照。培養(yǎng)后取1 mL菌懸液用PBS緩沖液（pH 7.2）進(jìn)行梯度稀釋，平板培養(yǎng)后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并按公式（1）計(jì)算存活率。

式中：Ni為ih后的活菌數(shù)；N0為初始活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活菌數(shù)情況

如表2所示，3種益生菌沖劑的活菌數(shù)存在較大差異，3種產(chǎn)品活菌數(shù)均超過1×106CFU·g-1，但均未達(dá)到產(chǎn)品標(biāo)稱活菌數(shù)。其中A產(chǎn)品的活菌數(shù)達(dá)成率最高。

表2 3種益生菌沖劑菌落生長(zhǎng)情況

2.2 抑菌活性

如表3所示，3種產(chǎn)品中的益生菌都表現(xiàn)出了對(duì)大腸桿菌的抑制能力，且抑菌能力的排序?yàn)镃＞A＞B。說明3種益生菌產(chǎn)品都能在大腸桿菌大量存活的大腸環(huán)境中存活，且具有一定的抑菌活性。

表3 3種益生菌產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌抑菌能力

2.3 模擬消化

3種益生菌沖劑產(chǎn)品經(jīng)模擬消化后，僅有A產(chǎn)品具有存活能力（0.000 04%）；B、C產(chǎn)品并沒有生長(zhǎng)繁殖。表明在經(jīng)過體外模擬消化后，大多數(shù)益生菌被胃腸液消化導(dǎo)致失活，僅有極少數(shù)能成功生長(zhǎng)并繁殖，詳見表4。

表4 3種益生菌產(chǎn)品體外模擬消化后的活性

3 結(jié)論

本研究利用大腸桿菌測(cè)試3種產(chǎn)品益生菌的抑菌能力，可發(fā)現(xiàn)3種產(chǎn)品益生菌都有表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌的抑菌能力。經(jīng)模擬胃腸道消化后，3種益生菌產(chǎn)品僅有A產(chǎn)品的益生菌有少量存活。如何提高產(chǎn)品益生菌的耐消化活性是各個(gè)廠家研發(fā)人員需要重點(diǎn)解決的問題。本研究對(duì)益生菌沖劑產(chǎn)品的探究，能為市場(chǎng)監(jiān)管部門提供數(shù)據(jù)支撐，也能幫助企業(yè)開發(fā)出更好的同類產(chǎn)品。