劉芮，張文成

（合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601）

食源性致病菌引起的食品安全問題嚴重危及人類生命安全[1]。大腸桿菌是一種條件致病菌，可引起腸道、膀胱、泌尿道等各種組織和器官的感染或全身播散性感染[2]。金黃色葡萄球菌最大的致病性來自于其產(chǎn)生的高度耐藥的腸毒素，其會引起食物中毒[3]。此外，金黃色葡萄球菌感染會導致白細胞和巨噬細胞的破壞和免疫功能的下降[4]。丙二酸鹽克羅諾桿菌為羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.），屬于革蘭氏陰性菌，是一種治愈率極低、致死性極強的食源性致病菌，尤其易感染新生兒[5]。食源性致病菌引起的食物中毒日益嚴重和普遍，開發(fā)相應的防腐劑顯得尤為重要。其中，人工合成防腐劑及其副產(chǎn)品可能會引發(fā)人體器官功能障礙，存在損害人體健康的風險。因此，研究開發(fā)天然食品防腐劑成為一個重要課題[6]。相關(guān)學者對天然物質(zhì)的抗菌保鮮活性進行了大量的基礎(chǔ)理論和應用研究[7-9]。

銀杏（Ginkgo biloba L.，GBL），作為我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，含有多種活性成分，包括黃酮類、內(nèi)酯類、酚類、萜類、多糖等活性物質(zhì)[10]。研究表明銀杏黃酮化合物具有廣譜抑菌效果，對細菌、真菌都有不同程度的抑制作用。作為天然物質(zhì)的銀杏黃酮化合物對人體沒有毒副作用并且具有預防心腦血管疾病、糖尿病等生理功效[11]，在國外已被用作食品添加劑[12]。然而，植物中黃酮類化合物含量低，純化工藝復雜，產(chǎn)量低，純度低，限制了黃酮類化合物的開發(fā)應用[6]。本研究采用大孔樹脂純化銀杏黃酮提取物，以提高其抑菌活性。通過測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），比較純化前后銀杏黃酮提取物對致病菌的抑菌活性，并探討其可能的抑菌機理，以期為開發(fā)安全、高效、廣譜的天然植物源防腐劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

銀杏黃酮提取物：合肥拓峰生物有限公司；NKA-9大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；黃酮標準品（槲皮素、山奈酚、異鼠李素）：北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸桿菌（CMCC 44102）：中國菌種保存中心保存；丙二酸鹽克羅諾桿菌（LMG 23826）：合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院微生物實驗室保存；甲醇（色譜級）：德國默克公司；LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，分析純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；四環(huán)素（分析純）：上海易恩化學技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；2，7-二氯熒光素二醋酸酯（分析純）：北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1260液相色譜儀：美國安捷倫公司；Varioskan Flash全波長掃描酶標儀：美國Thermo公司；ZHJH-C超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；KQ-300E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS離心機：湖南湘立科學儀器有限公司；Regulus 8230高分辨率場發(fā)射掃描電鏡：日本日立公司；FLS980熒光分光光度計：英國愛丁堡儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 銀杏黃酮提取物的純化

用乙醇溶解銀杏黃酮提取物配成0.8 mg/mL的溶液，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值為5。將100 mL預處理后的NKA-9大孔樹脂濕法裝柱到玻璃層析柱（500mm×25mm）中。將550mL銀杏黃酮提取物溶液以1mL/min的流速加入層析柱中，吸附完全后，用100mL蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)。以70%乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫層析柱，直至流出的洗脫液為無色。收集洗脫液，濃縮干燥后得到銀杏黃酮純化物，采用硝酸鋁比色法[13]測得總黃酮含量從20.69%提高到56.42%。

1.3.2 高效液相色譜分析

采用高效液相色譜法對樣品進行測定。采用C18柱（5 μm，4.6 mm ×150 mm），柱溫為30℃，流動相為溶劑 A（0.1%甲酸水溶液）和溶劑 B（甲醇），體積比 1∶1，流速0.7 mL/min，檢測波長360 nm。梯度洗脫條件：0～15 min 35%B、15 min～30 min 40%B、30 min～45 min 50%B、45 min～70 min 55%B。

1.3.3 MIC和MBC的測定

MIC和MBC采用二倍稀釋法進行測定。用10%DMSO溶解銀杏黃酮純化物，配成濃度為7.2 mg/mL的純化物溶液。取無菌96孔板，1號孔中加入100 μL純化物溶液和100 μL LB肉湯培養(yǎng)基，2號～7號孔中分別加入 LB肉湯培養(yǎng)基100 μL。從1號孔吸取100 μL加到2號孔，再從2號孔中吸取100 μL加入3號孔，依次進行二倍稀釋，從7號孔中吸取100 μL溶液棄去。隨后，從每個孔中吸出10 μL懸浮液用致病菌菌液代替，使菌液的最終接種濃度為107CFU/mL。含有107CFU/mL濃度的菌液和四環(huán)素溶液培養(yǎng)物孔為作為陽性對照。另外用10%的DMSO溶劑作為陰性對照。96孔板在37℃培養(yǎng)24 h后測定OD600值，OD600值變化小于0.05的濃度即為MIC。從濃度高于MIC的孔中取100 μL培養(yǎng)液涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h，無菌落生長的最低濃度即為MBC。

1.3.4 細菌生長曲線測定

在無菌96孔板中，加入10 μL生長至對數(shù)期的3種致病菌菌液，再加入90 μL銀杏黃酮純化物溶液使最終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，對照組添加90 μL的LB肉湯培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個平行，37℃孵育24 h，前12 h每小時測定OD600，24 h后再次測定OD600，繪制細菌生長曲線。

1.3.5 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

掃描電鏡觀察操作參照Bajpai等[14]的方法。向?qū)?shù)期的致病菌菌液（107CFU/mL）加入最終濃度為MIC的銀杏黃酮純化物，37℃孵育8 h。8 500 r/min離心5 min，收集細菌沉淀，用無菌PBS洗滌2次。將細菌重懸于含2.5%戊二醛的溶液中，4℃孵育過夜以固定細胞。離心后分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液每15 min進行梯度洗脫。干燥后，樣品噴金。采用高分辨率場發(fā)射掃描電鏡進行觀察。

1.3.6 堿性磷酸酶活性測定

收集對數(shù)期的致病菌菌液，調(diào)節(jié)菌液濃度為107CFU/mL，8 500 r/min離心5 min收集細菌沉淀，用無菌PBS洗滌2次，使細菌重懸于無菌PBS中，加入最終濃度分別為MIC和MBC的銀杏黃酮純化物溶液，置于37℃下孵育24 h。每隔2 h離心（8 500 r/min，5 min）取上清液，用AKP測定試劑盒檢測上清液中AKP活性。

1.3.7 活性氧檢測

參考Dwivedi等[15]方法，對細胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）進行檢測，研究銀杏黃酮化合物對致病菌細胞的氧化應激作用。將3種致病菌培養(yǎng)至對數(shù)中期，細胞濃度為107CFU/mL。將致病菌菌液與20 μmol/L的2，7-二氯熒光素二醋酸酯混合，在37℃下孵育1 h。6 000 r/min離心10 min收集細胞沉淀，去除細胞外多余的2，7-二氯熒光素二醋酸酯。用無菌PBS重懸細菌，加入到最終濃度為1/2MIC、MIC和MBC的銀杏黃酮純化物溶液中，37℃孵育12 h，使用熒光分光光度計檢測熒光強度，參數(shù)設(shè)置為激發(fā)光波長495 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗重復3次，結(jié)果以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)處理以及作圖使用 GraphPad Prism 8以及Microsoft Excel軟件。p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化前后黃酮組分分析

銀杏黃酮提取物、銀杏黃酮純化物以及標準品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 銀杏黃酮提取物、銀杏黃酮純化物以及標準品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography image of flavonoid extraction and purified flavonoids from Ginkgo biloba L.and standard sample

如圖1所示，槲皮素、山奈酚和異鼠李素的保留時間分別為 44.572、59.446、63.355 min，銀杏黃酮提取物和銀杏黃酮純化物均檢測出這3種組分。銀杏黃酮提取物純化前后的色譜圖存在較大差異，通過對保留時間和峰面積進行分析，得到純化前后3種主要的黃酮類化合物含量，見表1。

表1 純化前后黃酮類化合物含量Table 1 Flavonoid content before and after purification

槲皮素、山奈酚和異鼠李素是黃酮類化合物中的黃酮醇類，也是抑菌活性很強的一類黃酮類化合物[16]。由表1可以看出，銀杏黃酮純化物中槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量較純化前顯著增加（p<0.05），三者含量分別為51.77%、5.82%、1.54%。

2.2 抑菌活性

純化前后銀杏黃酮對3種致病菌的抑菌活性見表2。

由表2可知，銀杏黃酮純化物對3種致病菌的抑菌效果明顯優(yōu)于銀杏黃酮提取物。銀杏黃酮提取物對3種致病菌的MIC分別為0.900、1.800、1.800 mg/mL，MBC不小于3.600mg/mL。銀杏黃酮純化物對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為0.450mg/mL和0.900mg/mL，對于大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌的MIC均為0.900 mg/mL，MBC均為1.800 mg/mL。陽性對照四環(huán)素作為一種革蘭氏陰性菌（G-）抗生素，對大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌的MBC較小，說明對G-的殺菌效果更強。通過比較3種致病菌，銀杏黃酮化合物對于革蘭氏陽性菌（G+）——金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好，MIC和MBC均較其他兩種致病菌小。銀杏黃酮純化物中山奈酚含量顯著提高，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚對于G+尤其是金黃色葡萄球菌的抑制作用要強于G-，如Tajuddeen等[17]從植物中提取出的山奈酚對金黃色葡萄球菌的MIC僅為6.25 μg/mL。

表2 純化前后銀杏黃酮對3種致病菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of flavonoids from Ginkgo biloba L.against three pathogens before and after purification

2.3 細菌生長曲線

不同濃度的銀杏黃酮純化物對3種致病菌生長的影響見圖2。

圖2 不同濃度銀杏黃酮純化物作用下的致病菌生長曲線Fig.2 Growth curves of pathogens treated with different concentration of purified flavonoids from Ginkgo biloba L.

如圖2所示，當銀杏黃酮純化物濃度為1/4MIC時，3種致病菌的遲緩期有所延長，但總體上仍保持典型的細菌生長曲線，與對照組無明顯差別。當銀杏黃酮純化物濃度為1/2MIC時，細菌的生長受到一定程度的抑制，表現(xiàn)出較長的遲緩期，延遲了細菌進入穩(wěn)定期的時間，且細菌數(shù)總量減小。經(jīng)MIC濃度的銀杏黃酮純化物處理后，3種致病菌均被完全抑制且不再增殖。表明低濃度的銀杏黃酮純化物能延緩細菌的生長和繁殖。

2.4 掃描電鏡

銀杏黃酮純化物處理后的3種致病菌掃描電鏡圖見圖3。

圖3 銀杏黃酮純化物處理前后致病菌的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of pathogens treated with different concentration of purified flavonoids from Ginkgo biloba L.

如圖3所示，未處理的金黃色葡萄球菌（圖3A）呈規(guī)則球狀，表面光滑，邊界清晰，而當MIC濃度的銀杏黃酮純化物處理8 h后（圖3B）菌體表面存在凸起和凹陷，部分細胞破裂，內(nèi)容物溢出，細胞邊界模糊。正常大腸桿菌（圖3C）呈規(guī)則的桿狀，而經(jīng)MIC濃度的銀杏黃酮純化物處理后菌體（圖3D）呈現(xiàn)畸形凹陷，細胞形態(tài)完全破壞，大量細胞堆積在一起。丙二酸鹽克羅諾桿菌在處理前（圖3E）是飽滿立體的，MIC濃度的銀杏黃酮純化物處理后，菌體細胞變短變細，絕大部分菌體出現(xiàn)萎縮凹陷，部分細胞出現(xiàn)干癟或空洞，細胞形態(tài)完全被破壞。這種形態(tài)異常主要是由膜結(jié)構(gòu)的破壞和內(nèi)容物泄漏所導致的[18]。

2.5 AKP活性

銀杏黃酮純化物對致病菌AKP活性的影響見圖4。

圖4 銀杏黃酮純化物對致病菌AKP活性的影響Fig.4 Effect of purified flavonoids from Ginkgo biloba L.on AKP activity of pathogens

AKP僅存在于細胞壁和細胞膜之間，所以正常情況下胞外不能檢測到AKP活性。致病菌菌液中AKP的活性可以反映細菌細胞壁的完整性[19]。如圖4所示，與對照組相比，銀杏黃酮純化物處理4 h～12 h的3種致病菌菌液中的AKP活性均顯著提高（p<0.05）。菌液中檢測到的AKP活性在8 h～10 h時維持在較高水平，說明此時細胞壁破裂程度較大，有大量AKP泄漏到細胞外。銀杏黃酮純化物對3種致病菌的抑菌活性不同，金黃色葡萄球菌菌液中檢測到的AKP活性最大值為80.338 U/L，而大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌菌液中AKP活性最大值分別為69.255 U/L和68.676 U/L，這主要與G+（金黃色葡萄球菌）和G-（大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌）細胞壁結(jié)構(gòu)和組成的差異有關(guān)。G-具有雙層外膜，脂多糖包裹的外膜對小分子物質(zhì)的進出具有很大的阻礙。大多數(shù)小分子物質(zhì)無法快速穿過G-的外膜，G-特殊的雙膜結(jié)構(gòu)可以保護其抵御抗菌物質(zhì)的滲入[20-21]。從這個角度來看，G-的細胞壁外較厚的脂多糖外膜可以提供額外的保護，抵御胞外抗菌化合物的作用。

2.6 ROS分析

在不同濃度的銀杏黃酮純化物處理下，3種致病菌細胞內(nèi)的ROS水平見圖5。

圖5 銀杏黃酮純化物處理后細胞內(nèi)ROS水平Fig.5 Intracellular ROS level of purified flavonoids from Ginkgo biloba L.after treatment

研究表明，過量的外源性ROS可以損傷細胞內(nèi)的DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，并且會引起細菌生長減緩[22-23]。如圖5所示，對照組中，3種致病菌細胞內(nèi)檢測到的熒光強度為3 425～3 557，濃度為1/2MIC的銀杏黃酮純化物處理后，熒光強度變化不顯著（p>0.05）。隨著黃酮濃度的增大，熒光強度顯著增強。在MIC和MBC濃度時，檢測到的熒光強度分別為4 606～4 700和6 687～6 788，與對照組相比增加顯著（p<0.05），說明經(jīng)MIC濃度的銀杏黃酮純化物處理后便可引起致病菌細胞內(nèi)ROS水平增長。在細胞中ROS水平突然增多時，通常都伴隨著抗氧化系統(tǒng)活性的減弱[24]，因此推測MIC濃度的銀杏黃酮純化物處理后的致病菌細胞內(nèi)ROS水平升高，可能是由于黃酮類化合物抑制了抗氧化酶活性，從而使ROS增多，使得致病菌產(chǎn)生氧化損傷從而生長減緩。

3 結(jié)論

采用大孔樹脂純化銀杏黃酮提取物，槲皮素、山奈酚、異鼠李素這3種黃酮化合物均得到明顯的富集，含量分別提高到51.77%、5.82%和1.54%。銀杏黃酮純化物對3種致病菌均有明顯的抑制作用，銀杏黃酮純化物抑菌效果較未純化前增強，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好，MIC為0.450 mg/mL，MBC為0.900 mg/mL。通過抑菌機理試驗表明，銀杏黃酮純化物能夠破壞致病菌細胞形態(tài)，導致細胞活力喪失。銀杏黃酮純化物能明顯提高細胞膜的通透性，破壞細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)，使細菌細胞內(nèi)容物泄漏。另外，銀杏黃酮純化物處理后的致病菌細胞內(nèi)ROS水平升高，使致病菌細胞發(fā)生氧化損傷，致使細胞死亡。