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        4種植物提取物的體外抗氧化活性比較

        2022-12-20 04:22:46徐韶棠楊軼浠王藝瑾郭育濤劉雅寧張佳敏覃小穎張玨
        食品研究與開發(fā) 2022年24期
        關(guān)鍵詞:黃草代代清除率

        徐韶棠,楊軼浠,*,王藝瑾,郭育濤,劉雅寧,張佳敏,覃小穎,張玨

        (1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610106;2.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點實驗室,四川 成都 610106;3.四川良源食品有限公司,四川 巴中 636000)

        脂質(zhì)氧化是影響食品品質(zhì)的主要原因之一,其主要產(chǎn)物為醛、環(huán)氧脂肪酸、亞硝基化合物等物質(zhì)。這些物質(zhì)不僅會影響食物的感官品質(zhì),甚至可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。目前使用抗氧化劑是食品抑制脂質(zhì)氧化的主要方法之一[1-3]。然而人工合成抗氧化劑,如丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯和叔丁基對苯二酚等在抗氧化劑中占主導(dǎo)地位[4]。近年來,人們對食品中所添加的人工合成抗氧化劑的安全性問題高度關(guān)注。一些研究表明合成抗氧化劑可能存在諸多副作用,會對人體的肝、脾、肺有不利影響,甚至可能會誘發(fā)惡性腫瘤等[5]。隨著植物資源的開發(fā)和消費者對食品品質(zhì)及安全的要求越來越高,取代有潛在安全風(fēng)險的化學(xué)抗氧化劑已成為當(dāng)今研究的熱點[6]。

        據(jù)報道,植物的抗氧化活性成分主要有黃酮類、多酚類、皂甙類、鞣質(zhì)類、維生素類、褪黑素類等[7]。其中黃酮和多酚類化合物是許多植物提取物的主要抗氧化活性成分,并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗過敏等多種生物活性及藥理作用[8-9]。因植物提取物在對抗氧化應(yīng)激所引起的神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管疾病、炎癥和糖尿病等各疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[10],故對植物的抗氧化活性研究具有重要意義。

        分心木是核桃內(nèi)的木質(zhì)隔膜,性味苦澀,具有很高的藥用價值和良好的抗氧化作用。但是經(jīng)常被當(dāng)作垃圾丟棄,造成很大的浪費[11]。2020年,趕黃草通過國家食品安全風(fēng)險評估中心審查,批準(zhǔn)為新食品原料,成為藥食同源植物之一,其食用安全性受到認(rèn)可。趕黃草作為一種藥食同源植物,具有極高的藥用價值,甚至被賦予了“神仙草”的美譽(yù)[12]。代代花分布廣泛,資源豐富,同時具有很高的藥用價值,但是有關(guān)于代代花的研究報道較少[13]。青蒿作為一種常見的植物,從青蒿中提取的青蒿素可以用來治療瘧疾,因此具有極高的藥用價值[14]。這4種提取物據(jù)報道均含有多糖2.48%~17.12%、黃酮類2.54%~16.40%、多酚類2.39%~6.56%、氨基酸1.00%~3.21%等物質(zhì)[15-19],并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗過敏等多種生物活性及藥理作用。

        因此本研究將分心木、趕黃草、代代花、青蒿4種可食用植物及其副產(chǎn)物進(jìn)行提取,通過DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、鐵離子抗氧化能力法3種體外抗氧化能力測試,對4種植物提取物的抗氧化能力進(jìn)行評價,并將所得到結(jié)果與各植物提取物的總黃酮和總酚含量建立聯(lián)系,以期為天然產(chǎn)物的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        趕黃草(Penthorum chinense Pursh):四川省古藺縣桂花鄉(xiāng)臣相趕黃草種植專業(yè)合作社;分心木(Diaphragma juglandis Fructus)、代代花(Citrus aurantium L.):中國北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司;青蒿(Artemisia annua L.)水提取物:長沙中仁生物科技有限公司。

        總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒(ferric reducing ability of plasma,F(xiàn)RAP微板法):上海源葉生物科技有限公司;蘆丁和亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉(分析純):西安化學(xué)試劑廠;2,2-二苯基-1 苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH) 自由基清除能力檢測試劑盒 、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6磺酸)[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]自由基清除能力檢測試劑盒、沒食子酸、福林-酚(Folin-Ciocaileu)試劑(分析純):北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇:成都市科隆化學(xué)品有限公司;試驗用水為超純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        精密電子天平(AL-104型):上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司;粉碎機(jī)(BJ-300A型):德清拜杰電器有限公司;數(shù)控超聲波清洗器(KH5200DE型):昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV 10D S96型):廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司;冷凍干燥機(jī)(FDU-2110型):東京理化器械株式會社;酶標(biāo)儀(FLEXA-200型):杭州奧盛儀器有限公司;恒溫水浴鍋(HH.S21-8型):上海博迅實業(yè)有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9030B型):上海森信實驗儀器有限公司;超純水制備儀(EPED-EZ-10TJ型):南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;離心機(jī)(5425型):德國艾本德公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品制備

        趕黃草、分心木、代代花經(jīng)晾曬干燥,將樣品粉碎后過60目篩待用。

        1.3.2 植物提取物的制備

        分心木的提取參考肖敏等[20]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取粉碎后的分心木粉末40 g,以60%乙醇提取活性成分,料液比為 1∶30(g/mL),53 ℃超聲輔助提取55 min,抽濾,殘渣反復(fù)提取3次。合并濾液后,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,并冷凍干燥后即可得到約5 g淺棕色粉末即分心木提取物。

        趕黃草的提取參考郭建敏等[21]的方法并稍作修改。準(zhǔn)備稱取粉碎后的趕黃草粉末60 g,以70%乙醇提取活性成分,料液比為 1∶25(g/mL),55 ℃超聲輔助提取40 min,抽濾,殘渣反復(fù)提取3次。合并濾液后,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,并冷凍干燥后即可得到約6 g淺棕色粉末即趕黃草提取物。

        代代花的提取參考郝可欣等[22]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱量粉碎后的代代花粉末50 g,以60%乙醇提取活性成分,料液比為 1∶20(g/mL),55 ℃超聲輔助提取40 min,抽濾,殘渣反復(fù)提取3次。合并濾液后,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,并冷凍干燥后即可得到約5 g棕色粉末即代代花提取物。

        青蒿提取物以純水煮沸回流,按照料液比1∶10(g/mL)提取,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,并冷凍干燥后即可得到棕黃色粉末即青蒿水提取物。

        1.3.3 總黃酮含量的測定

        參考《中國藥典》[23]的方法,并加以改進(jìn)。精密稱定樣品各0.15 g,加入30%乙醇定容至25 mL,超聲處理后過濾。精密量取上述濾液2 mL,加水定容至25 mL作為供試品溶液。分別從供試品溶液中取1 mL置于25 mL容量瓶中,加5%NaNO2溶液1 mL,搖勻,放置6 min,加10%Al(NO3)3溶液1 mL搖勻,放置6 min,加NaOH試液10 mL,再加水至刻度,搖勻,放置15 min,以相應(yīng)試劑為空白,按照紫外可見分光光度法,在500 nm的波長處測定吸光度。

        用無水乙醇將于120℃干燥至恒重的蘆丁對照品稀釋至 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL。按上述方法進(jìn)行操作,以吸光度為縱坐標(biāo)(y)、濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        各提取物的總黃酮含量參考蘆?。╮utin,RT)標(biāo)準(zhǔn)曲線用蘆丁當(dāng)量(每克樣品中黃酮類化合物相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù),mg RT/g)表示,根據(jù)公式(1)計算,每個提取物平行測定3次。

        式中:c為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測液中總黃酮濃度,mg RT/mL;v為各待測樣品提取液總體積,mL;k為待測樣品提取液稀釋倍數(shù);m為提取物粉末質(zhì)量,g。

        1.3.4 多酚含量檢測

        參考章林[24]的方法,并加以改進(jìn)。精密稱定樣品0.2 g加水定容至100 mL為待測液。取0.1 mL待測液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL福林-酚試劑,再加入3 mL濃度為100 g/L的Na2CO3溶液,定容后混勻。然后室溫下避光放置反應(yīng)2 h,在765 nm處測吸光度。

        精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)于 10 mL 容量瓶內(nèi),加 1.0 mL Folin-Ciocaileu試劑,再加入3 mL濃度為100 g/L的Na2CO3溶液,混勻,加水定容,再混勻。然后室溫下避光放置反應(yīng)2 h,在765 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(y)、濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        各提取物的總酚含量參考沒食子酸(gallic acid,GA)標(biāo)準(zhǔn)曲線用沒食子酸當(dāng)量(每克干樣品中酚類化合物相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù),mg GAE/g)表示,根據(jù)公式(2)計算。每個提取物平行測定3次。

        式中:c為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測液中總酚濃度,mg GAE/mL;v為各待測樣品提取液總體積,mL;k為待測樣品提取液稀釋倍數(shù);m為提取物粉末質(zhì)量,g。

        1.3.5 DPPH自由基清除能力檢測

        將4種植物提取物以純水為溶劑,配制成一定濃度的樣品,10 000 r/min室溫離心3 min,取上清液作為待測液。將DPPH母液與無水乙醇按照體積比4∶21的比例配成DPPH工作液。按照DPPH自由基清除能力試劑盒說明書進(jìn)行加樣,混勻后室溫避光靜置30 min后,測定515 nm處的吸光度??瞻卓?、對照孔和測定孔的吸光值分別記為A空白、A對照和A測定。DPPH自由基清除率計算公式如下。

        1.3.6 ABTS+自由基清除能力檢測

        將4種植物提取物以純水為溶劑,配制成一定濃度的樣品,10 000 r/min室溫離心3 min,取上清液作為待測液。根據(jù)比例配成ABTS工作液。按照ABTS+自由基清除能力試劑盒說明書進(jìn)行加樣,充分混勻后室溫避光靜置6min后,測定405nm處的吸光度??瞻卓?、對照孔和測定孔的吸光值分別記為A空白、A對照和A測定。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

        1.3.7 總抗氧化能力檢測(FRAP法)

        將4種植物提取物由純水配制成一定濃度,10 000 r/min室溫離心3 min,取上清液。將FRAP緩沖液、氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TPTZ)溶液、氯化鐵溶液按照體積比 10∶1∶1 配制FRAP工作液。

        標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用純水將亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mmol/L)稀釋至 0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mmol/L。按照T-AOC試劑盒說明書進(jìn)行加樣,置于37℃水浴鍋保溫30 min后,測定593 nm處吸光度值。以系列Fe2+濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        準(zhǔn)確稱取提取物以純水為溶劑,配制成不同的濃度。按照上述方法進(jìn)行加樣,用酶標(biāo)儀檢測593 nm處吸光度。樣品最終的總抗氧化能力以Fe2+的當(dāng)量濃度(FRAP值)表示。

        式中:cFe2+當(dāng)量為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得提取物相對應(yīng)的Fe2+濃度,mmol/L ;c提取物為提取物濃度,mg/mL。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        每組數(shù)據(jù)平行測定3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)的差異顯著性和相關(guān)性,采用Origin 2021軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 總黃酮、總酚含量檢測結(jié)果

        蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程:y=9.195 0x+0.018 9,R2=0.998 6,在測定范圍內(nèi),蘆丁濃度與吸光度呈良好的線性相關(guān)。沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程:y=0.103 4x+0.018 3,R2=0.998 9,在測定范圍內(nèi),蘆丁濃度與吸光度值呈良好的線性相關(guān)。4種植物提取物的總黃酮和總酚的含量,結(jié)果見表1。

        表1 不同植物提取物中的黃酮和多酚含量Table 1 Contents of flavonoids and polyphenols in different plant extracts

        由表1可知,4種植物提取物中分心木提取物的總黃酮含量最高,為(21.87±0.55)mg RT/g,其次是趕黃草提取物,而青蒿和代代花提取物的總黃酮含量最低;趕黃草提取物的總酚含量最高,為(14.78±0.95)mg GAE/g,分心木和代代花提取物總酚含量之間無顯著差異,而青蒿提取物的總酚含量最低。

        2.2 對DPPH自由基清除作用

        DPPH自由基清除率的測試是作為判定樣本抗氧化能力的重要指標(biāo)之一,廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物、食品、保健品及藥品的抗氧化能力研究[25-26]。4種植物提取物對DPPH自由基的清除作用見圖1。

        圖1 4種植物提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH free radical sacvenging activities of four plant extracts

        由圖1可知,在一定濃度范圍內(nèi),4種植物提取物對DPPH自由基的清除率與濃度成量效關(guān)系,DPPH自由基的清除率均隨濃度的升高而增大。分心木和趕黃草提取物對DPPH自由基的清除率略低于VC,青蒿和代代花提取物對DPPH自由基清除率明顯低于VC,這說明了分心木和趕黃草具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

        對植物提取物濃度和相應(yīng)的DPPH自由基清除率進(jìn)行線性回歸分析,并通過回歸方程得到了不同提取物清除率的IC50。IC50值越小則說明該物質(zhì)對自由基的清除率達(dá)到50%時所需要的物質(zhì)濃度越小,對DPPH自由基的清除能力強(qiáng),反之則說明對DPPH自由基的清除能力弱[27]。根據(jù)線性回歸方程可計算出各提取物的IC50值分別為分心木(38.85 μg/mL)、趕黃草(45.88 μg/mL)、青蒿(397.50 μg/mL)、代代花(634.23 μg/mL)。4 種提取物DPPH自由基清除能力的大小順序為分心木>趕黃草>青蒿>代代花。

        2.3 對ABTS+自由基清除作用

        ABTS法可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定,是使用最廣泛的間接檢測方法[28]。4種植物提取物對ABTS+自由基的清除作用見圖2。

        由圖2可知,4種植物提取物對ABTS+自由基的清除率與濃度成量效關(guān)系,在一定濃度范圍內(nèi),濃度越大對ABTS+自由基的清除率越大。4植物提取物對ABTS+由基清除率均小于VC,但也表明了4種植物提取物均具有一定的抗氧化活性。

        圖2 4種植物提取物對ABTS+自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of four plant extracts on ABTS+free radical

        各提取物的IC50值,分別為趕黃草0.81 mg/mL、分心木1.41 mg/mL、青蒿2.16 mg/mL、代代花4.03 mg/mL,4種提取物ABTS+自由基清除能力的順序為趕黃草>分心木>青蒿>代代花。

        2.4 總抗氧化能力

        FRAP法是一種通過鐵離子還原反應(yīng)的能力來測定總抗氧化能力的方法[29]??偪寡趸芰?biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程:y=1.648 3x+0.141 3,R2=0.995,線性關(guān)系良好。4種植物提取物的總抗氧化能力見圖3。

        圖3 4種植物提取物的總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidative capacities of four plant extracts

        由圖3可知,4種植物提取物的總抗氧化能力大小順序為分心木[(3.12±0.14)mmol/g]>趕黃草[(2.74±0.18)mmol/g]>青蒿[(0.45±0.01)mmol/g]>代代花[(0.42±0.03)mmol/g],與對DPPH自由基清除能力的IC50值保持一致。

        2.5 相關(guān)性分析

        植物提取物抗氧化機(jī)制在于清除自由基、降低氧化中間體、抑制酶促氧化等,其抗氧化能力的大小又多與總和總黃酮含量呈正相關(guān)[30-31]。一般來說多酚或黃酮含量越高,化合物抗氧化能力越強(qiáng)[32]。

        采用SPSS17.0軟件對4種不同提取物中總黃酮含量、總多酚含量及抗氧化活性進(jìn)行了Person法相關(guān)性分析,結(jié)果見表2。

        表2 4種植物提取物總酚、總黃酮與抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 2 The relationships of the contents of total polyphenols and total flavonoids with the antioxidant activity of four plant extracts

        由表2可知,總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力呈顯著性相關(guān),總酚含量與各抗氧化能力相關(guān)性不顯著。由此可見,4種植物提取物的抗氧化能力與總黃酮的含量排序基本保持一致。根據(jù)抗氧化能力與總黃酮含量的顯著相關(guān)性可以推測,以2-苯基色原酮所具有的母核的黃酮類化合物所形成的交叉共軛體系,在植物提取物的抗氧化綜合能力的大小比較中占主要因素[33]。

        3 結(jié)論

        對4種植物提取物的總酚、總黃酮含量進(jìn)行測定,同時以DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、總抗氧化能力為指標(biāo),研究了4種植物提取物的抗氧化能力。結(jié)果表明,4種植物提取物均含有豐富的總黃酮和總酚。4種提取物中分心木提取物的總黃酮的含量最高,為(21.87±0.55)mg RT/g。趕黃草提取物的總酚含量最高,為(14.78±0.95)mg GAE/g。4種植物提取物中分心木的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力最強(qiáng),IC50值和 FRAP值分別為 8.85 μg/mL和(3.12±0.14)mmol/g。趕黃草的ABTS+自由基清除能力最強(qiáng),IC50值達(dá)到0.81 mg/mL。因此,分心木和趕黃草的綜合抗氧化能力大于青蒿和代代花。在總黃酮和總酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析中,總黃酮含量和抗氧化能力呈正相關(guān),說明對于這4種植物來說,黃酮類化合物的抗氧化作用占主導(dǎo)地位。

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