龍亞麗，王軍乾，潘陽(yáng)陽(yáng)，，王 萌，趙 凌，馬文斌，張 虔，王靖雷，余四九，王立斌*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是分布在我國(guó)青藏高原的特有畜種(占世界牦?？倲?shù)的95%)，生活在海拔2 500 m～5 000 m高寒低氧環(huán)境中，是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳钗镔Y來(lái)源。一般在放牧飼養(yǎng)條件下，公牦牛3歲～4歲以后才能達(dá)到性成熟，種用期限較短，嚴(yán)重制約著牦牛的繁殖率和出欄率。因此，明確牦牛睪丸發(fā)育與退化的分子調(diào)控機(jī)制，充分利用公牦牛的配種能力，對(duì)提高牦牛生產(chǎn)能力具有重要意義。

抑制素(inhibin，INH)是一種由性腺分泌的糖蛋白激素，由α和β兩個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵聯(lián)結(jié)而成，主要有INHA(αβA)和INHB(αβB)兩種形式[1]。INHβB作為評(píng)估睪丸組織功能正常與否的激素受體，是睪丸產(chǎn)生精子的主要標(biāo)志，也是INH在雄性血清中存在的唯一形式[2]；INHβB受垂體-性腺軸的反饋調(diào)節(jié)，影響生精上皮的功能[3]；INHβB不僅可作為檢查性腺功能正常與否的睪丸特異性標(biāo)記物[4]，也可作為精子發(fā)生的動(dòng)力學(xué)標(biāo)志物[5]；其表達(dá)水平影響睪丸的體積的大小及精子的數(shù)量[6]。促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH)是下丘腦-垂體-性腺軸中的重要神經(jīng)內(nèi)分泌產(chǎn)物，控制著類固醇激素的合成和配子的產(chǎn)生[7]；FSH能夠選擇性刺激支持細(xì)胞分泌INHβB，LH則能夠選擇性地刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌INH[8]。在公畜中，F(xiàn)SH起著促進(jìn)睪丸足細(xì)胞合成、分泌雄激素、刺激生精上皮發(fā)育和精子發(fā)生的作用[9]，F(xiàn)SH與FSHR結(jié)合才能傳遞信號(hào)，因此激素反應(yīng)的強(qiáng)度和靶點(diǎn)都受FSHR水平和細(xì)胞特異性表達(dá)的控制[10]。FSH通過(guò)與FSHR結(jié)合促進(jìn)精子發(fā)生，同時(shí)FSHR起著激活性腺支持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用[11]。有研究表明，LH通過(guò)與LHR結(jié)合促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，促進(jìn)精子的生成和成熟。LH對(duì)雄性第二性征的發(fā)生、類固醇的生成和配子的發(fā)生也起著重要的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，竹鼠在敲除LHR后內(nèi)外生殖器官明顯萎縮，且可導(dǎo)致雄雌鼠的不孕不育[13-14]。

雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育過(guò)程中INH、FSH和LH三者之間存在互相調(diào)控作用，且在不同物種中，三者的調(diào)控存在差異，尚未有其在牦牛上的研究報(bào)道。本研究通過(guò)分析牦牛睪丸發(fā)育過(guò)程中INHβB、FSHR和LHR的表達(dá)差異，從表達(dá)水平和細(xì)胞定位兩個(gè)層面為進(jìn)一步闡明INH、FSH和LH在牦牛睪丸發(fā)育及精子生成中發(fā)揮的作用提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 INHβB抗體(abcam)、FSHR抗體(Ab-AF5242)、LHR抗體(bs-6431R)、二抗(Goat Anti-Rabbit IgG)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；β-actin(13E5)Rabbit mAb，Cell Signaling公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒，Omega(北京)公司產(chǎn)品；GoscriptTMReverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega(美國(guó))公司產(chǎn)品；DAB顯色液，Invitro‐gen Zymed(美國(guó))公司產(chǎn)品；免疫組化染色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GoTaq?Green Master Mix 2×，Promega(美國(guó))公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Roche生物科技公司產(chǎn)品；顯微照相裝置(DP71)，日本Olympus公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光儀，上海Roche生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 樣品取自甘肅省甘南藏族自治州某屠宰場(chǎng)，采集不同年齡健康公牦牛的睪丸組織(1歲、3歲、5歲和9歲牦牛各3頭)。頸動(dòng)脈放血處死后，30 min內(nèi)采集睪丸組織樣品，生理鹽水沖洗2次～3次，一部分用錫箔紙包裹保存于液氮中，用于RT-qPCR和Western blot試驗(yàn)；另一部分固定于40 mg/mL的多聚甲醛溶液中用于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的牛INHβB、FSHR和LHR基因序列在NCBI Primer-Blast設(shè)計(jì)引物，所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，具體引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 RNA提取及基因表達(dá)水平檢測(cè) 取出睪丸組織樣品加液氮研碎，稱取0.1 g組織放入離心管；用TransZol試劑盒提取組織中的RNA，置-80 ℃保存；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20 ℃保存。RT-qPCR反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s,58 ℃30 s,72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min；共40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。根據(jù)每個(gè)樣品的Ct值，用2-ΔΔct法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 蛋白質(zhì)提取及其相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 加液氮研碎組織，稱取0.1 g加入離心管；加入RIPA裂解緩沖液，置于搖床2 h；組織完全裂解后，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，小心取上清液，置-80 ℃保存；蛋白變性：蛋白原液與4×蛋白上樣緩沖液按3∶1混合，100 ℃ 10 min，置-20 ℃保存。配制100 mg/mL蛋白分離膠和50 mg/mL蛋白濃縮膠，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)；轉(zhuǎn)膜；一抗孵育4 ℃冰箱過(guò)夜；二抗孵育；用化學(xué)發(fā)光儀掃描目的條帶，利用Image J軟件對(duì)INHβB、FSHR和LHR蛋白條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定，根據(jù)灰度值分析INHβB、FSHR和LHR蛋白相對(duì)表達(dá)量(目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值)。

1.2.5 INHβB、FSHR和LHR的定位 用40 mg/mL多聚甲醛固定的睪丸組織樣品，用紗布包裹置于流水中沖洗24 h，制作石蠟切片。切片、脫蠟，在pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)中進(jìn)行抗原修復(fù)，加熱沸騰15 min，冷卻至常溫；免疫組化試劑盒(抗兔)孵育二抗；以二氨基聯(lián)苯胺染色法用DAB顯色液進(jìn)行顯色；蘇木精復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片，晾干。最后用IHC方法檢測(cè)INHβB、FSHR和LHR在睪丸組織中的定位。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 單因素方差法分析3種基因與蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，利用SPSS25.0處理數(shù)據(jù)，Graphpad prism8.3.0制圖。

2 結(jié)果

2.1 INHβB、FSHR和LHR mRNA在不同年齡牦牛睪丸中的表達(dá)

INHβB、FSHR和LHRmRNA在不同年齡段牦牛睪丸中均有表達(dá)，且在不同年齡段之間其表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)。隨著牦牛年齡的增長(zhǎng)，INHβB、FSHR和LHR的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，5歲時(shí)表達(dá)量最高，顯著高于其他3個(gè)年齡段(圖1)。

A.INHβB;B.FSHR;C.LHR;不同小寫(xiě)字母代表組間差異顯著,P<0.05

2.2 INHβB、FSHR和LHR蛋白在不同年齡牦牛睪丸中的表達(dá)

INHβB、FSHR和LHR蛋白在不同年齡牦牛睪丸中均有表達(dá)(圖2)。隨著年齡的增長(zhǎng)，3種受體蛋白的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖3)，5歲時(shí)達(dá)到最高，顯著高于其他3個(gè)年齡段P<0.05)；不同年齡蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)與基因表達(dá)的變化趨勢(shì)相似。

1.1歲；2.3歲；3.5歲；4.9歲

A.INHβB;B.FSHR;C.LHR;不同小寫(xiě)字母代表組間差異顯著,P<0.05

2.3 INHβB、FSHR和LHR蛋白在不同年齡牦牛睪丸中的定位

INHβB、FSHR和LHR蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中均有表達(dá)，1歲主要表達(dá)于生精小管和初級(jí)精母細(xì)胞各級(jí)生精細(xì)胞；3歲隨著睪丸發(fā)育體積和功能的不斷完善，管腔明顯較1歲時(shí)增大，主要表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞、睪丸生精小管、支持細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞；5歲生精小管管腔較3歲進(jìn)一步增大，主要表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞、睪丸生精小管、支持細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞；9歲生精小管管腔增大，但此時(shí)生精小管管腔中的細(xì)胞分泌變少，且出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，主要表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞、睪丸生精小管、支持細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞(圖4、圖5和圖6)。

A1～D2.INHβB蛋白陽(yáng)性表達(dá)；E1～E4.陰性對(duì)照;ST.生精小管;PS.初級(jí)精母細(xì)胞;SS.次級(jí)精母細(xì)胞;SC.睪丸支持細(xì)胞;Ley.睪丸間質(zhì)細(xì)胞;S.精子

A3～D4.FSHR蛋白陽(yáng)性表達(dá)；F1～F4.陰性對(duì)照;ST.生精小管; PS.初級(jí)精母細(xì)胞; SS.次級(jí)精母細(xì)胞; SC.睪丸支持細(xì)胞; Ley.睪丸間質(zhì)細(xì)胞; S.精子

3 討論

在雄性動(dòng)物體內(nèi)，促性腺激素INH、FSH和LH通過(guò)與受體結(jié)合影響雄性生殖。INH主要由睪丸分泌，通過(guò)血液循環(huán)調(diào)節(jié)動(dòng)物的生殖活動(dòng)，有INHβA和INHβB兩種形式，由位于生精小管基底膜上的睪丸支持細(xì)胞分泌產(chǎn)生的INHβB是生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子β家族中的一員，有支持精子發(fā)生的作用[15]，被認(rèn)為是雄性支持細(xì)胞功能及生精功能的潛在標(biāo)志物[16]，INHβB水平的迅速增加與支持細(xì)胞的增加呈正相關(guān)影響睪丸的體積和精子生產(chǎn)[17]。男性血清INHβB和小鼠睪丸INHβB水平隨年齡的順延呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)[18-19]，大鼠體內(nèi)INHβB水平呈現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)，并受支持細(xì)胞的活性和數(shù)量影響[20]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，INHβB在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及各級(jí)生精細(xì)胞中表達(dá)，且INHβB基因和蛋白在牦牛睪丸中的表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，5歲牦牛睪丸中表達(dá)量最高，此研究結(jié)果與劉敏清等[21]一致，他認(rèn)為牦牛性成熟前，睪丸僅有少量的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，隨著年齡的增加，睪丸體積增大、生精功能不斷完善、各類生殖細(xì)胞增多、生精和生殖能力隨年齡增加表現(xiàn)為先上升后下降的過(guò)程，符合睪丸發(fā)育的變化過(guò)程。公牦牛1歲、3歲和5歲INHβB表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況的原因可能與牦牛在1歲時(shí)出現(xiàn)精原細(xì)胞，3歲達(dá)到性成熟，產(chǎn)生精子，5歲生殖能力旺盛相關(guān)，INHβB可能參與了睪丸的生精功能，在牦牛睪丸的發(fā)育過(guò)程發(fā)揮著重要作用。

FSH與分布在性腺中的特異性受體FSHR結(jié)合，作用于睪丸支持細(xì)胞及曲細(xì)精管，促進(jìn)各級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)育及精子的成熟，F(xiàn)SH對(duì)睪丸發(fā)育以及促進(jìn)精子發(fā)生起著極為重要的作用。在山羊中，睪丸的精原細(xì)胞和支持細(xì)胞中有FSHR的表達(dá)，F(xiàn)SHR的表達(dá)量隨著年齡的增加而升高[22]，說(shuō)明FSHR的表達(dá)量與睪丸的曲細(xì)精管發(fā)育以及精子的生成密切相關(guān)；大鼠中，睪丸FSHR的水平在出生后隨日齡的增加而升高，60日齡時(shí)達(dá)到最高水平[23]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR主要表達(dá)在牦牛睪丸的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及各級(jí)生精細(xì)胞中；FSHR基因和蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中均有表達(dá)，隨年齡的增長(zhǎng)FSHR基因和蛋白在牦牛睪丸組織中逐漸升高，5歲時(shí)達(dá)到最大值，到9歲表達(dá)量明顯下降。張宜等[22]認(rèn)為FSHR主要表達(dá)于分化后的支持細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)支持細(xì)胞的分化與精子的形成。本試驗(yàn)有效驗(yàn)證了FSHR在一定程度上影響牦牛睪丸的發(fā)育過(guò)程及生精能力。FSHR表達(dá)趨勢(shì)與產(chǎn)舒恒一致，他的研究結(jié)果表明梅山公豬睪丸組織中FSHR的表達(dá)，呈先上升后下降的趨勢(shì)。

LH是由垂體前葉分泌的一種促性腺激素，通過(guò)與LHR結(jié)合對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，LH是睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮的重要激素，與LHR結(jié)合，激活睪丸間質(zhì)細(xì)胞中腺苷酸化酶，使膽固醇進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，促進(jìn)睪酮合成，睪酮又能促進(jìn)精子的生成和雄激素的成熟[24]。研究發(fā)現(xiàn)，LHR在性腺和非性腺組織中均有表達(dá)[25]，但在睪丸組織中表達(dá)量較高[26]。由此推斷，LHR對(duì)性腺的發(fā)育起著十分重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LHR蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中均有表達(dá)，主要定位于睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞中，這一結(jié)果與他人研究結(jié)果相一致[27]。LHR在豬和梅山公豬睪丸中的表達(dá)量有隨年齡增長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果相似，LHR基因和蛋白在牦牛睪丸中的表達(dá)水平隨著年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在5歲時(shí)最高，LHR通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)激素調(diào)控牦牛初情期發(fā)育和精子發(fā)生，對(duì)公牦牛生殖系統(tǒng)起著重要作用。

本研究結(jié)果表明，INHβB、FSHR和LHR在不同年齡牦牛睪丸組織中均有表達(dá)，且在性成熟前，其表達(dá)量隨年齡的增加而升高，年老時(shí)又逐漸下降，3種受體表達(dá)量的變化趨勢(shì)相似，其對(duì)牦牛睪丸的發(fā)育和精子的形成具有促進(jìn)作用。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，INHβB、FSHR和LHR主要存在于睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞中。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索抑制素聯(lián)合激素調(diào)控牦牛睪丸發(fā)育過(guò)程提供了基礎(chǔ)資料。