李少晗，陳 鑫,張廣智，劉維全，秦 彤*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193)

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)及犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)是目前危害犬的2種主要病原體[1]，二者具有高度接觸傳播性。CDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)，為單股負(fù)鏈不分節(jié)的RNA病毒[2]。發(fā)病犬主要臨床表現(xiàn)為雙相熱、結(jié)膜炎、白細(xì)胞減少、支氣管及肺炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等[3]。犬細(xì)小病毒為單鏈DNA病毒，自1967年發(fā)現(xiàn)至今不斷發(fā)生基因突變及重組并產(chǎn)生多種基因型，在全球范圍內(nèi)廣泛分布[4]。該病毒能夠引起典型出血性腸炎，在犬中傳染性及致病性較強(qiáng)。犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、α-冠狀病毒屬(Coronavirus)，為單股正鏈RNA病毒[5]，存在CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ兩種基因型，氨基酸序列同源性僅為50%[6]。相關(guān)研究表明，CCoV-Ⅰ與CCoV-Ⅱ常在體內(nèi)以混合感染形式存在[7-9]。該病毒在犬群中具有發(fā)病率高、病死率低的特點(diǎn)，但幼犬感染后病死率較高。臨床腹瀉病例中常發(fā)生CPV與CCoV混合感染，同時，CDV感染犬時會引起全身性的免疫抑制現(xiàn)象[10-11]。犬只在發(fā)生3種病毒混合感染時的存活率較低。由于臨床治療手段有限，目前針對該類疾病主要以疫苗免疫預(yù)防為主。因此在疾病早期及時的診斷干預(yù)，將大大降低動物的病死率。

普通PCR/RT-PCR具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但該類方法操作復(fù)雜，耗時長，成本高，因此，在臨床檢測應(yīng)用中，快速、高效的多重PCR正在不斷普及。在本研究中，成功建立了一種同時檢測CDV、CPV、CCoV-Ⅰ 及 CCoV-Ⅱ 的多重PCR方法，可為今后臨床樣品的快速鑒別檢測提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒株 CPV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CPIV、CAV 毒株及大腸埃希氏菌、沙門氏菌、多形擬桿菌菌株，均由本實(shí)驗(yàn)室保存及鑒定。CDV毒株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

1.1.2 主要試劑 LATaqDNA 聚合酶、2×Prime STAR Max DNA Polymerase、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000、pMD19T-Vector，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA/RNA核酸提取試劑盒，艾德萊生物公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京諾唯贊生物公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒及EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit，OMEGA公司產(chǎn)品；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電泳儀、PCR儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Tanon公司產(chǎn)品；細(xì)菌培養(yǎng)箱，上海一恒生物科技有限公司產(chǎn)品；Nanodrop分光光度計，Life Real公司產(chǎn)品；細(xì)菌超凈工作臺，北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心產(chǎn)品；小型臺式離心機(jī)，Thermo公司產(chǎn)品；SHK-99-Ⅱ型臺式空氣恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照GenBank中CDV的H基因序列，CPV的VP2基因序列及CCoV參考文獻(xiàn)[12]設(shè)計合成4對特異性引物(表1)，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 多重PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的構(gòu)建 對CPV的DNA，CDV、CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：LATaq酶 0.5 μL，10×buffer 5 μL,dNTP Mix 8 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL/cDNA 3 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物膠回收后，分別與pMD19-T Vector 16 ℃連接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌液PCR鑒定得到陽性單菌落后，送至北京擎科生物公司進(jìn)行測序，測序成功的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板。

1.2.3 多重PCR的建立 分別以相同濃度的重組質(zhì)粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ、pMD-CCoV-Ⅱ 為模板，設(shè)置退火溫度為48.0 ℃～62.5 ℃，進(jìn)行溫度梯度PCR。采用25 μL反應(yīng)體系：2×Prime STAR Max 12.5 μL，CDV、CPV及CCoV-Ⅰ上、下游引物各0.5 μL，CCoV-Ⅱ上、下游引物各1.0 μL，重組質(zhì)粒pMD-CPV，pMD-CDV，pMD-CCoV-Ⅰ 各0.5 μL，重組質(zhì)粒pMD-CCoV-Ⅱ 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，48.0 ℃～62.5 ℃ 10 s(設(shè)置15個梯度)，72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 多重PCR的特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化后的多重PCR，對3種主要腸道病原菌大腸埃希氏菌、沙門氏菌和多形擬桿菌，以及CPV、CDV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CPIV、CAV及CPV+CDV+CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ 的DNA/cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，來檢測該方法的特異性。

1.2.5 多重PCR的敏感性試驗(yàn) 使用Nanodrop 2000分光光度計，測定重組質(zhì)粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ和pMD-CCoV-Ⅱ 的濃度，將該濃度按照拷貝數(shù)公式進(jìn)行換算?？截悢?shù)(copies/μL)=質(zhì)粒濃度(g/μL)×6.02×1023/(660×質(zhì)粒長度bp)。將各重組質(zhì)粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ和pMD-CCoV-Ⅱ均稀釋至1×1010copies/μL，并進(jìn)行10倍梯度稀釋至1×101copies/μL，用于檢測多重PCR的敏感性，并與單項(xiàng)PCR敏感性進(jìn)行比較。

1.2.6 多重PCR的重復(fù)性 在對多重PCR的重復(fù)性檢測中，選擇3個不同稀釋度質(zhì)粒模板1×108copies/μL、1×107copies/μL和1×106copies/μL，在不同時間點(diǎn)、不同PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，用于檢測該多重PCR方法的重復(fù)穩(wěn)定性。

1.2.7 多重PCR的初步應(yīng)用 用建立的多重PCR方法對2020年-2021年由北京、河北等地區(qū)寵物醫(yī)院采集的50份臨床腹瀉病料進(jìn)行檢測，同時與單項(xiàng)PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的構(gòu)建

對CPV、CDV、CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的DNA/cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物膠回收后連接至pMD19-T Vector，各重組菌液PCR擴(kuò)增片段分別為573、410、289、105 bp，片段大小與預(yù)期相符(圖1)，菌液送至北京擎科生物公司測序比對結(jié)果正確。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1.CPV目的基因; 2.CPV陰性對照; 3.CDV目的基因; 4.CDV陰性對照; 5.CCoV-Ⅰ目的基因; 6.CCoV-Ⅰ陰性對照; 7.CCoV-Ⅱ目的基因; 8.CCoV-Ⅱ陰性對照

2.2 多重PCR的建立

利用確定好的反應(yīng)體系，以重組質(zhì)粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ和pMD-CCoV-Ⅱ?yàn)槟０?，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)。經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時獲得573、410、289、105 bp目的片段，與預(yù)期大小相符。經(jīng)退火溫度條件的優(yōu)化，最終選擇50.7 ℃作為該方法的最佳退火溫度(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照; 2～16.分別為48、48.5、49.3、50.7、52.3、53.6、54.5、55、56、56.5、57.4、58.7、60.3、61.6、62.5℃

2.3 多重PCR的特異性試驗(yàn)

采用建立的多重PCR對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、多形擬桿菌、CPV、CDV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CPIV、CAV及CPV+CDV+ CCoV-Ⅰ+ CCoV-Ⅱ 進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)僅CPV、CDV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ 及CPV+CDV+ CCoV-Ⅰ+ CCoV-Ⅱ 有特異性條帶，而大腸埃希氏菌、沙門氏菌、多形擬桿菌、CPIV及CAV未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖3)。結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照; 2.大腸埃希氏菌；3.沙門氏菌；4.多形擬桿菌；5.CPIV; 6.CAV; 7.CCoV-Ⅱ; 8.CCoV-Ⅰ; 9.CDV; 10.CPV;11.CPV+CDV+ CCoV-Ⅰ+ CCoV-Ⅱ

2.4 多重PCR的敏感性試驗(yàn)

將初始濃度為1×1010copies/μL的重組質(zhì)粒10倍稀釋至1×101copies/μL，取各個稀釋度的重組質(zhì)粒模板進(jìn)行多重PCR和單項(xiàng)PCR。結(jié)果表明，多重PCR可以檢測到CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的最低拷貝數(shù)分別為1×107copies/μL、1×103copies/μL、1×106copies/μL和1×104copies/μL。而單項(xiàng)PCR的最低拷貝數(shù)分別為1×107copies/μL、1×102copies/μL、1×104copies/μL和1×104copies/μL。對于CPV及CCoV-Ⅱ多重PCR與單項(xiàng)PCR的敏感性一致，而針對CDV及CCoV-Ⅰ多重PCR敏感性略遜于單項(xiàng)PCR，但差異不大(圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照；2～11.pMD-CPV質(zhì)粒濃度由1×1010～1×101 copies/μL、pMD-CDV質(zhì)粒濃度由1×1010～1×101 copies/μL、pMD-CCoV-Ⅰ質(zhì)粒濃度由1×1010～1×101 copies/μL和pMD-CCoV-Ⅱ質(zhì)粒濃度由1×1010～1×101 copies/μL

2.5 多重PCR的重復(fù)性

采用建立的多重PCR，對1×108copies/μL、1×107copies/μL和1×106copies/μL 3個不同稀釋度質(zhì)粒模板，在不同時間，使用3個不同的PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，不同條件下的擴(kuò)增結(jié)果相似，證明該方法具有良好的重復(fù)穩(wěn)定性(圖5)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～3.1×108 copies/μL、1×107 copies/μL和1×106 copies/μL稀釋度質(zhì)粒模板第一次擴(kuò)增；4～6.1×108 copies/μL、1×107 copies/μL和1×106 copies/μL稀釋度質(zhì)粒模板第二次擴(kuò)增；7～9.1×108 copies/μL、1×107 copies/μL和1×106 copies/μL稀釋度質(zhì)粒模板第三次擴(kuò)增

2.6 多重PCR的初步應(yīng)用

對2020年-2021年由北京、河北等地區(qū)寵物醫(yī)院采集的50份臨床腹瀉病料進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果表明，CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的陽性率分別為32%(16/50)、24%(12/50)、18%(9/50)、10%(5/50)。雙重感染類型CPV+CCoV-Ⅰ陽性率為2%(1/50)，CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ陽性率為8%(4/50)。三重感染類型CDV+CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ陽性率為2%(1/50)。

同時對50個病料進(jìn)行了常規(guī)單項(xiàng)PCR檢測，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的陽性率分別為30%(15/50)、24%(12/50)、18%(9/50)、16%(8/50)，單項(xiàng)PCR未檢測出CPV+CCoV-Ⅰ混合感染病例；CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ陽性率為12%(6/50)；CDV+CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ 的結(jié)果與多重PCR一致(表2)。

表2 多重PCR及單項(xiàng)PCR臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

近年來在對寵物醫(yī)院臨床犬病例的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，多種病原混合感染的現(xiàn)象普遍存在[13]。常規(guī)PCR具有檢測靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是發(fā)生多種病毒混合感染時，存在操作流程繁瑣、耗時長、成本高的缺點(diǎn)[14]。本研究成功建立了同時檢測CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的多重PCR，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，大大縮短了檢測周期，避免了試劑耗材的浪費(fèi)及大量實(shí)驗(yàn)操作過程中存在的交叉污染現(xiàn)象。本試驗(yàn)中使用的高保真快速DNA聚合酶預(yù)混液，只需在體系中添加酶、ddH2O、預(yù)混合引物及模板即可完成快速高效擴(kuò)增，使得檢測過程更加簡便，同時降低了操作污染的風(fēng)險。

引物設(shè)計是多重PCR建立過程中的首要關(guān)鍵步驟，引物需要設(shè)計在序列保守區(qū)域內(nèi)[15]，避免非特異性擴(kuò)增，具有相似的退火溫度，避免引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)[16]。本研究中針對CPV的VP2基因、CDV的H基因、CCoV的M基因保守序列設(shè)計并合成了4對引物，試驗(yàn)結(jié)果表明，各引物間無相互干擾、特異性強(qiáng)、各個模板擴(kuò)增片段大小合適，易于區(qū)分，分別為573 bp、410 bp、289 bp和105 bp。多重PCR反應(yīng)體系并非單項(xiàng)PCR各反應(yīng)體系的疊加，需要對模板濃度、引物比例、退火溫度及延伸時間等條件進(jìn)行摸索[17-18]。本研究中適當(dāng)提高了CCoV-Ⅱ的模板及引物濃度，并確定了50.7 ℃為最佳退火溫度。本研究建立的多重PCR對CPV及CCoV-Ⅱ的靈敏度與普通PCR一致，而CDV及CCoV-Ⅰ的靈敏性略差于普通PCR，原因可能是在多個模板及多對引物存在的PCR反應(yīng)體系中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)存在競爭不平衡的現(xiàn)象，很難保證針對每一種模板的敏感性達(dá)到最優(yōu)，但該方法在實(shí)際應(yīng)用中能夠較好的滿足檢測需求。在對50份臨床病料檢測過程中發(fā)現(xiàn)，該多重PCR能夠較好的完成單一病原及多重病原混合感染的檢測，結(jié)果與單項(xiàng)PCR結(jié)果大致相同，且對混合感染病例的檢測更加高效便捷，值得后期推廣應(yīng)用。同時在檢測過程中也發(fā)現(xiàn)了一些限制性因素，由于采集病料中的CCoV-Ⅱ病毒粒子含量較低，多重PCR反應(yīng)體系中的各個混合引物組分可能會優(yōu)先擴(kuò)增較高濃度模板，從而降低對CCoV-Ⅱ的檢出率，使得該多重PCR針對CCoV-Ⅱ的陽性檢出率略低于常規(guī)單項(xiàng)PCR。后續(xù)還需不斷提高臨床檢測的樣本量，來更全面的評價該方法，同時也需要不斷深入研究并對此方法進(jìn)一步提升優(yōu)化。

CPV及CDV目前仍是世界范圍內(nèi)犬科動物主要感染的兩大病原體。CPV的遺傳進(jìn)化速度非?？?，已報道發(fā)現(xiàn)有CPV-2/2a/2b/2c及new CPV-2a/2b 6種基因型[4,19-20]，本研究設(shè)計的CPV引物能夠擴(kuò)增不同基因型毒株。CDV常與其他病原體共同感染，有報道指出CDV的感染宿主范圍不斷擴(kuò)大，已有恒河猴感染的報道，這也使得CDV感染人成為可能[21]。CCoV有CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ兩種基因型，由于該病毒難以分離培養(yǎng)，目前關(guān)于此類病毒的研究及報道較少[22-24]。Pratelli A等[25]發(fā)現(xiàn)在CCoV-Ⅱ 跨膜區(qū)和羧基末端，只有少數(shù)分散的替換，而CCoV-Ⅰ的M蛋白中發(fā)生許多類似于貓冠狀病毒典型殘基的替換，基于此可以區(qū)分Ⅰ型和Ⅱ型。在對采集的臨床樣本進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的混合感染普遍存在。隨著新冠疫情的暴發(fā)流行，人們對于犬、貓冠狀病毒的關(guān)注度也在不斷提高，因此，做好對寵物疫病的監(jiān)控，也是對人類健康的保護(hù)。

本研究為CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的檢測提供了一種高效、靈敏、特異、高通量、低成本的檢測方法，可為今后的實(shí)驗(yàn)室診斷、病原學(xué)研究、寵物重要疫病流行監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)查提供幫助。