陳偉杰，葉 妍

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642；2.深圳計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518131）

左旋肉堿（L-carnitine），也稱肉毒素或維生素BT，其作為跨線粒體膜酰基載體促進(jìn)脂肪酸的β氧化，并通過血腦屏障改善大腦的認(rèn)知功能[1]。嬰幼兒機(jī)體尚未發(fā)育成熟，無法足量合成左旋肉堿，因此L-肉堿是嬰幼兒必需的營養(yǎng)素。目前，檢測L-肉堿的方法主要有分光光度法[2]、離子色譜法[3]、高效液相色譜法[4]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》（GB 29989—2013）為分光光度法，該法原理為樣品中左旋肉堿經(jīng)蛋白沉淀、皂化等一系列反應(yīng)后生成黃色物質(zhì)，通過其顏色深度間接計算L-肉堿含量。日常檢測中發(fā)現(xiàn)，國標(biāo)法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉時，高氯酸沉淀蛋白質(zhì)后難以過濾，結(jié)果重復(fù)性差，準(zhǔn)確度低。此現(xiàn)象由此類樣品中氨基酸多肽小分子或麥芽糊精的物理性質(zhì)導(dǎo)致，研究發(fā)現(xiàn)，適量Taka淀粉酶酶解，可解決上述問題[6]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有操作簡單、準(zhǔn)確度好、靈敏度高的優(yōu)勢，已有研究使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定嬰幼兒奶粉中左旋肉堿，且取得了良好的效果。

實(shí)驗(yàn)以特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉為例，分別采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》（GB 29989—2013）分光光度法、淀粉酶酶解優(yōu)化的分光光度法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢驗(yàn)，對3種方法測定結(jié)果的精密度、回收率、顯著性差異進(jìn)行分析，為特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方奶粉中左旋肉堿實(shí)驗(yàn)室方法應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器設(shè)備與試劑

材料：市售氨基酸配方奶粉、乳蛋白水解嬰兒配方奶粉。儀器設(shè)備：電子天平、數(shù)字式酸度計PB-10、渦旋振蕩器、離心機(jī)、振蕩水浴槽、超聲提取儀、紫外分光光度計及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀TSQ Quantis。標(biāo)準(zhǔn)品：左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：541-15-1）、左旋肉堿-D3標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：350818-62-1）。試劑：鹽酸、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、2-硝基苯甲酸、高氯酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、乙二胺四乙酸二鈉、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（C8H18N2O4S)、TaKa淀粉酶、乙酰輔酶A（AcetylCoA）和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶A（CAT）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

（1）肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（86.4 mg·L-1）。稱量 20 mg（精確0.000 1 g）L-肉堿于250 mL容量瓶中，用純水定容至刻度。

（2）肉堿標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.08 mg·L-1）。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.25 mL于100 mL容量瓶中，用純水定容至刻度。

（3）左旋肉堿 -D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10.0 mg·mL-1）。準(zhǔn)確稱取100 mg（精確0.000 1 g）D3-左旋肉堿于10 mL容量瓶，用純水定容至刻度。

（4）左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液。①分光光度法。分別吸取系列體積L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液（86.4 mg·L-1）于25 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為 0.864 μg·mL-1、1.730 μg·mL-1、3.460 μg·mL-1、6.910 μg·mL-1、10.400 μg·mL-1和 17.300 μg·mL-1，臨用時配制。②液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。分別吸取系列體積L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.08 mg·L-1）于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為 4.32 μg·L-1、8.64 μg·L-1、21.6 μg·L-1、43.2 μg·L-1、64.8 μg·L-1和 86.4 μg·L-1，臨用時配制。

（5）乙酰輔酶A溶液。于離心管中加入20.0 mg乙酰輔酶A，并加入2.0 mL純水使其溶解，臨用時配制。

（6）乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液。于離心管中加入100 μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶，9 500 r·min-1離心5 min，棄去上層清液，殘渣用2.0 mL純水充分溶解，臨用時配制。

（7）顯色液的配制。①顯色原液。于燒杯中依次放入2-硝基苯甲酸0.050 g、N-2-羥乙基哌嗪-2-乙烷磺酸5.96 g及乙二胺四乙酸二鈉0.185 g后，加入30 mL純水溶解，再用10 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5±1.0，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，純水定容至刻度?？衫洳乇４?個月。②顯色工作液。使用純水將顯色原液稀釋5倍。

（8）TaKa淀粉酶溶液。于燒杯中放入2.50 g TaKa淀粉酶，加入50 mL純水，使其充分溶解，臨用時配制。

1.2.2 分光光度法分析步驟

（1）試樣處理。①分光光度法。稱5 g試樣于燒杯中，取適量（35±5）℃的純水使其溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶后，加入13%高氯酸溶液10 mL，搖勻并靜置20 min，用純水定容至刻度后混勻過濾。取20 mL濾液，用4 mol·L-1氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至12.75±0.25，40 ℃水浴1 h，冷卻后用13%高氯酸調(diào)節(jié)pH值至7.25±0.25。將處理溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，并用純水定容至刻度，于4 ℃冰箱冷藏16 h。取出樣品處理溶液待其常溫，上清液用0.45 μm濾膜過濾備用。②淀粉酶解優(yōu)化的分光光度法。稱5 g試樣于燒杯中，適量溫水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中。加入Taka淀粉酶溶液1 mL并混勻，60 ℃水浴0.5 h，后續(xù)操作與GB 29989—2013分光光度法一致。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將儀器波長調(diào)為412 nm，在比色皿中依次加入標(biāo)準(zhǔn)工作液2 mL，800 μL顯色工作液和100 μL乙酰輔酶A溶液，使用移液槍小心抽提數(shù)次，5 min后歸零。迅速加入100 μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，使用移液槍小心抽提數(shù)次，10 min后測定吸光值。以肉堿標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)，吸光值作縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。GB 29989—2013與淀粉酶酶解優(yōu)化的分光光度法同時測定，兩種方法僅在試樣前處理過程有差異，故兩種方法共用此標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析步驟

（1）色譜分析條件。色譜柱Hypersil GOLDTMPEI HILIC LC（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水。流速：0.3 mL·min-1。柱溫：35 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序：0～1 min（A：20%→95%，B：80%→5%）；1.0～ 4.5 min（A：95%→20%，B：5%→80%）；4.5～ 7.0 min（A：20%，B：80%）保持平衡。

（2）質(zhì)譜分析條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；正離子噴霧電壓：3 500 V；負(fù)離子噴霧電壓：2 500 V；離子轉(zhuǎn)化管溫度：350 ℃；蒸發(fā)器溫度：350 ℃；霧化氣（N2）：45 psig；去溶劑氣（N2）：45 psig。多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)：左旋肉堿，母離子162（m/z），子離子103/60（m/z），碰撞能量20.0/16.5（V）；左旋肉堿-D3，母離子165（m/z），子離子103/63（m/z），碰撞能量20.0/16.5（V）。

（3）試樣處理。稱2.5 g試樣于25 mL比色管中，加入左旋肉堿-D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液200 μL，用10 mL溫水渦旋溶解后，移取10 mL至100 mL比色管，加入0.5 mL鹽酸后搖勻，于60 ℃超聲水解1 h，取出置于常溫，純水定容并搖勻后過濾。取濾液0.050 mL至10 mL容量瓶中并用純水定容，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以肉堿標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)（X），縱坐標(biāo)（Y）為吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分光光度法線性范圍為0～17 μg·mL-1，方程為y=0.051 6x+0.014 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限0.6 mg/100 g；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法線性范圍0～90 ng·mL-1，方程為y=0.012 2x-0.009 4，相關(guān)系數(shù)為 0.999 7，檢出限 0.1 μg·kg-1。

2.2 3種方法結(jié)果對比

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

由表1可知，國標(biāo)法測定三類特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉中左旋肉堿，測定結(jié)果偏差較大。優(yōu)化后的分光光度法測定結(jié)果整體上略低于液質(zhì)聯(lián)用法測定結(jié)果，原因可能為分光光度法基于酶反應(yīng)與顯色反應(yīng)間接計算左旋肉堿含量，此過程的反應(yīng)可能不完全。

表1 3種方法的左旋肉堿測定結(jié)果（n=6）

2.2.2 回收率實(shí)驗(yàn)

由表2可知，國家標(biāo)準(zhǔn)法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉平均加標(biāo)回收率為78.0%～82.5%，回收率較低；優(yōu)化后的分光光度法平均加標(biāo)回收率為93.6%～101.0%；液質(zhì)聯(lián)用法平均加標(biāo)回收率為96.7%～101.0%。

表2 3種方法測得的左旋肉堿加標(biāo)回收率（n=6）

2.2.3 酶解分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法的Levene方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果

分別使用酶解分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法對特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉左旋肉堿進(jìn)行測定，并對結(jié)果進(jìn)行差異性分析，結(jié)果見表3與表4。結(jié)果表明，對于氨基酸配方奶粉，優(yōu)化后的分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法測定結(jié)果方差顯著性=0.533＞0.05，均值顯著性=0.079＞0.05；對于乳蛋白深度水解配方奶粉，優(yōu)化分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法測定結(jié)果方差顯著性=0.365＞0.05，均值顯著性=0.270＞0.05；對于乳蛋白部分水解配方奶粉，優(yōu)化分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法測定結(jié)果方差顯著性=0.295＞0.05，均值顯著性=0.272＞0.05。因此，可認(rèn)為優(yōu)化分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉結(jié)果無顯著差異。

表3 優(yōu)化后酶解分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法測定左旋肉堿的數(shù)據(jù)對比

表4 優(yōu)化后酶解分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

對國標(biāo)法、優(yōu)化后的淀粉酶酶解分光光度法及液質(zhì)聯(lián)用法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉左旋肉堿的精密度以及加標(biāo)回收率進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明GB 29989—2013測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉，過濾困難，數(shù)據(jù)離散程度大，回收率低。優(yōu)化后的分光光度法解決了以上3類特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉過濾困難的問題，且結(jié)果滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求。對優(yōu)化后酶解分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法結(jié)果進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，表明兩種方法結(jié)果無顯著差異。后續(xù)對特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉左旋肉堿測定時，可根據(jù)樣品批次量，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件等因素進(jìn)行方法選擇。