張愛華 朱一辰 綜述 劉文虎 審校

Klotho基因最初被認(rèn)為是一種抗衰老基因[1],對(duì)其所編碼蛋白質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)和功能等研究的深入,發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白具有多種生物學(xué)功能。目前研究最多且相對(duì)較為清楚的是α-Klotho亞型,其主要表達(dá)于近端腎小管上皮細(xì)胞[2-3],存在膜型和可溶型兩種形式。膜型作為成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF-23)的共受體,參與調(diào)節(jié)整個(gè)機(jī)體或腎臟局部鈣、磷及維生素D的代謝[4];可溶型可由膜型胞外段裂解而來,也可直接由mRNA剪切合成[5],既能以自分泌和(或)旁分泌的形式調(diào)節(jié)腎臟局部的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡等[6],也可隨血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)隔部位發(fā)揮組織器官保護(hù)作用[7]。

移植腎功能延遲恢復(fù)(DGF)及慢性移植腎功能不全是影響移植腎器官生存和受者預(yù)后的重要因素[8-9]。腎小管的缺血-再灌注損傷(IRI)和各種形式的排斥反應(yīng)在其中扮演了關(guān)鍵性角色[10]。作為主要表達(dá)在腎臟的抗老化、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡分子,Klotho也通過多種作用形式參與其中,已有研究者開始嘗試探索干預(yù)Klotho對(duì)移植腎的保護(hù)作用。

α-Klotho蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

人Klotho基因位于13號(hào)染色體(13q12)[5],由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,可編碼α、β和γ三種Klotho蛋白,最主要的為α-Klotho。膜型α-Klotho是含有1 014個(gè)氨基酸殘基的Ⅰ型跨膜糖蛋白[1],胞外段含有兩個(gè)獨(dú)立的糖基水解酶結(jié)構(gòu)域(KL1和KL2),是α-Klotho活性和功能的主要承載者;跨膜結(jié)構(gòu)域含20個(gè)氨基酸殘基。胞內(nèi)段較短,僅由9個(gè)氨基酸殘基組成。膜型主要存于腎臟和腦脈絡(luò)叢[6],如前述,腎臟主要表達(dá)在近端腎小管上皮細(xì)胞,是FGF-23的共受體?？扇苄挺?Klotho游離存在于血液、尿液、腦脊液等體液中,有裂解型和分泌型兩種形式。裂解型源自膜型胞外段的裂解。依據(jù)裂解部位的不同,有兩種不同的分子量。長裂解型由去整合素金屬蛋白酶10和17(ADAM10和ADAM17)裂解而成,KL1和KL2均包含在內(nèi),分子量約130 kD;短裂解型由β淀粉樣蛋白分泌酶(BACE1)裂解而成,僅含KL1,分子量約65 kD。分泌型α-Klotho則是由細(xì)胞直接分泌,是在轉(zhuǎn)錄水平即拼接為不同的mRNA,直接翻譯成僅含KL1的蛋白質(zhì),是可溶型α-Klotho的主要來源。雖然分子量與短裂解型相當(dāng),但C末端的氨基酸序列并不完全相同[5]?？扇苄挺?Klotho具有卓越的抗氧化、抗炎癥、抗凋亡能力,但此三種之間的是否有所差異尚不清楚。這四種形式的α-Klotho蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

α-Klotho與移植腎功能相關(guān)的臨床證據(jù)

基于α-Klotho定位及生物學(xué)功能的上述特性,腎移植領(lǐng)域?qū)ζ涞年P(guān)注度越來越高。Kimura等[11]檢測(cè)了腎移植受者手術(shù)前后尿液中的可溶型α-Klotho,發(fā)現(xiàn)受者移植前24 h尿α-Klotho水平僅為活體供者的十分之一,術(shù)后第2天即明顯增高,至第5天基本與正常供者相當(dāng)。Thongprayoon 等[12]對(duì)2019年10月后的研究進(jìn)行了Meta分析,共10個(gè)隊(duì)列431例受者，發(fā)現(xiàn)移植后受者血清α-Klotho水平顯著增高,且與其估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)相匹配。Shikida等[13]進(jìn)一步回顧性分析了41例活體供腎受者,發(fā)現(xiàn)移植前血清可溶型α-Klotho的水平低者在術(shù)后3月內(nèi)更容易出現(xiàn)eGFR的顯著下降(下降≥30%)。

這些研究僅分析了可溶型α-Klotho,未涉及腎組織局部的α-Klotho;且測(cè)定值有的來自于供者,有的來自于受者,有的是受者和供者的混合。為此,Kim等[14]特定評(píng)價(jià)了供者血液和腎組織中α-Klotho水平對(duì)移植腎功能的預(yù)測(cè)價(jià)值，研究入選了60例尸體腎移植受者。在獲取供腎前留取供者血標(biāo)本;在植入受者即刻行供腎腎活檢。根據(jù)供腎α-Klotho的表達(dá)水平將受者分為兩組,結(jié)果顯示高表達(dá)組術(shù)后1周eGFR的改善顯著優(yōu)于低表達(dá)組[63.9±28.2 mL/(min·1.73 m2)vs47.5 ± 21.9 mL/(min·1.73 m2),P=0.030],提示供腎α-Klotho的水平與移植后腎功能的早期恢復(fù)密切相關(guān)。根據(jù)供體血清可溶型α-Klotho分組的組間比較初步分析未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;但在排除了活檢證實(shí)的急性排斥反應(yīng)后,α-Klotho的有益作用得以彰顯,血清α-Klotho高的供者其受者在術(shù)后12月時(shí)eGFR顯著更高[67.5±14.5 mL/(min·1.73 m2)vs53.5±10.8 mL/(min·1.73 m2),P=0.043]。因此，該研究者認(rèn)為供者α-Klotho是尸腎預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子。這一推測(cè)符合腎移植的具體病情,畢竟進(jìn)入終末期腎病后,原腎本身的α-Klotho產(chǎn)生非常有限。

Pazik等[15]進(jìn)一步分析了170例尸體腎供者Klotho基因型對(duì)移植后早期移植腎形態(tài)和功能的影響。主要關(guān)注了Klotho基因rs9536314的多態(tài)性。結(jié)果顯示G等位基因攜帶者(GG型或GT型)第3個(gè)月蛋白尿發(fā)生率明顯高于TT單倍型(24.4%vs9.5%,P=0.030,OR=3.09，95%CI 1.22～7.69);第3個(gè)月GFR中位數(shù)顯著低于TT型[35.0(20.4～76.6) mL/(min·1.73 m2)vs46.3(15.5～96.8) mL/(min·1.73 m2),P=0.001]。

α-Klotho改善移植腎功能的機(jī)制研究

盡管臨床證據(jù)極大推動(dòng)了相關(guān)機(jī)制的研究,但由于腎移植動(dòng)物模型建立困難及其對(duì)供腎時(shí)效性的較高要求(包括盡可能短的熱缺血和冷缺血時(shí)間),目前的證據(jù)多來自體外實(shí)驗(yàn)或單純?nèi)毖俟嘧⒛Ｐ汀?/p>

α-Klotho減輕IRICastellano等[2]發(fā)現(xiàn)，IRI發(fā)生24 h后,豬腎組織中的α-Klotho顯著降低。Panah等[16]則揭示α-Klotho mRNA的下調(diào)在IRI后3 h即已開始,可持續(xù)3～4 d之久;并推測(cè)α-Klotho可穩(wěn)定核因子κB(NF-κB)異二聚體p50/p65與核抑制因子κB(IκB)形成的復(fù)合物,從而抑制移植腎IRI時(shí)炎癥因子和氧化應(yīng)激的高度活化,阻斷急性腎損傷(AKI)的發(fā)生。α-Klotho缺乏也與移植腎受者內(nèi)皮功能障礙有關(guān)[17]。Zhang等[18]評(píng)估了腎小管上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT),證實(shí)α-Klotho能經(jīng)由Wnt/β-Catenin信號(hào)通路抑制EMT,減輕移植功能障礙的發(fā)生發(fā)展。Li等[19]進(jìn)一步在動(dòng)物水平驗(yàn)證了上述結(jié)果。他們從C57BL/6小鼠中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),轉(zhuǎn)染Klotho-GFP腺病毒,再將其移植到AKI小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)Klotho-GFP-BMSCs移植小鼠IRI后的腎纖維化程度顯著低于假手術(shù)組,并再次證實(shí)是通過抑制腎小管上皮細(xì)胞的Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的。

α-Klotho減輕排斥反應(yīng)α-Klotho也被報(bào)道可減輕排斥反應(yīng)。急性血管性排斥以內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷為特征,而α-Klotho對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有抗凋亡、抗炎作用,并能增強(qiáng)其對(duì)活性氧簇的抵抗力。Liu等[20]將豬內(nèi)皮細(xì)胞與α-Klotho預(yù)孵育,然后暴露于異種反應(yīng)性抗體和補(bǔ)體。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示α-Klotho能抑制抗體誘導(dǎo)的VCAM-1和IL-1等促炎基因的表達(dá)和NF-κB的激活、減弱IκBα的磷酸化。此外,α-Klotho還誘導(dǎo)了豬內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒的抗性,IgG和IgM異種反應(yīng)性抗體與豬內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合降低,抗炎基因血紅素加氧酶1(HO-1)的表達(dá)上調(diào)。

增加移植腎α-Klotho表達(dá)的措施

早在2011年,Tataranni等[21]就發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可在一種永生近端腎小管上皮細(xì)胞系中誘導(dǎo)Klotho的表達(dá)。Mizusaki等[22]進(jìn)一步招募了36例腎移植受者,發(fā)現(xiàn)口服依維莫司的患者血清可溶型α-Klotho水平顯著高于未口服者(536.7 pg/mLvs332.4 pg/mL,P=0.026),提示抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)有增加腎移植受者血清可溶型α-Klotho的作用,可能不失為保護(hù)移植腎功能的手段之一。

Castellano等[2]在豬IRI膜型中觀察到補(bǔ)體C1的抑制劑可通過NF-κB信號(hào)通路改善腎臟局部α-Klotho的表達(dá)。而體外實(shí)驗(yàn)則顯示，補(bǔ)體C5a可顯著下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞α-Klotho的mRNA水平。依庫珠單抗是靶向于補(bǔ)體C5的人源化單克隆抗體,抑制C5裂解為C5a和C5b,已被批準(zhǔn)應(yīng)用于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)和非典型溶血尿毒綜合征(aHUS)的治療[23-24],也許不久的將來也能用來防治DGF,實(shí)際上其對(duì)腎移植抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)治療的有效性和安全性已經(jīng)在逐步評(píng)價(jià)中[25]。

Leone等[26]的研究則提示重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)也對(duì)移植腎受者的可溶型α-Klotho有調(diào)節(jié)作用。停用rhEPO 5周后,腎移植受者血清α-Klotho水平顯著降低。在人腎小管上皮細(xì)胞中,rhEPO預(yù)處理可減輕環(huán)孢素所致的Klotho下調(diào)。

綜上所述,高水平的α-Klotho與移植腎功能改善密切相關(guān),可能與其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纖維化和抗排斥等多種生物學(xué)作用有關(guān)。上調(diào)移植腎受者α-Klotho的表達(dá)可能是促進(jìn)移植腎功能早期恢復(fù)、減少慢性腎功能不全發(fā)生發(fā)展的非常有前景的干預(yù)靶點(diǎn)之一。