陳羽中，譚錦萍，戚 平，周慶瓊，陳 婷，黃小清

（廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511410）

嬰幼兒食品中肌醇含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法為GB 5009.270—2016第二法氣相色譜法[1]，氣相色譜法靈敏度高，但衍生過程較為煩瑣，在測定嬰幼兒乳粉、奶制品、功能飲料等樣品時費時不易操作[2]，特別是在干燥這個步驟中，往往1批30個的樣品需要花費24 h進行干燥處理，步驟也很煩瑣，需要分幾步轉(zhuǎn)移樣品[3]。另外由于嬰幼兒奶粉的基質(zhì)復(fù)雜，往往在衍生后的提取中會出現(xiàn)嚴(yán)重乳化現(xiàn)象，難以得到澄清的提取層，進樣液也常發(fā)現(xiàn)有溶劑渾濁的現(xiàn)象，色譜圖可見明顯的基質(zhì)干擾[3]。為了解決以上問題，本實驗對前處理過程進行了方法優(yōu)化，改變了干燥方法，增加了凈化步驟，使上述問題得到了顯著改善，解決了以往的技術(shù)難題，為本實驗提高了工作效率。

1 材料與方法

1.1 實驗原理

本實驗將試樣中的肌醇用水和乙醇提取后，分取提取液進行氮吹干燥，加入硅烷化試劑衍生，正己烷提取后經(jīng)水洗凈化，經(jīng)氣相色譜分離，外標(biāo)法定量。

1.2 材料與試劑

材料：嬰幼兒乳粉（市售）；肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.9%，德國，Dr Ehrenstorfer公司）；質(zhì)控樣品為嬰幼兒/成人營養(yǎng)食品（National Institute of Standards and Technology，NIST），SRM/RM編號：1849a，Order編號：1905870。

試劑：無水乙醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；N,N-二甲基甲酰胺（99.9%，上海，安譜公司）；三甲基氯硅烷/TMCS（≥99%，REGIS）；六甲基二硅氮烷（≥98%，美國，阿法埃莎（Alfa Aesar）；正己烷（色譜純，美國Fisher Chemical公司）；無水硫酸鈉（色譜純，德國Sigma公司）；硅烷化試劑：三甲基氯硅烷和六甲基二硅氮烷和N,N-二甲基甲酰胺按體積比1∶2∶8混合超聲后無白色渾濁，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器與設(shè)備

8890氣相色譜儀：配氫火焰離子化檢測器（美國Agilent公司）；MS204TS/02 萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超純水機（美國Milipore公司）；MS 3digital 渦旋混合器（德國IKA公司）；2600TH型數(shù)控超聲波清潔器（上海安譜公司）；2-16KL 型高速離心機（德國Sigma公司）；N-EVAPTM112 氮吹儀（美國Organomation公司）；SW22振蕩水浴鍋（德國Julabo公司）；色譜柱：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，美國 Agilent公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品前處理

提取：稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品于50 mL離心管中，加入40 ℃一級水12 mL溶解并超聲提取10 min，用95%乙醇定容至50 mL，搖勻靜置20 min后于6 000 r·min-1離心3 min。過濾后取上清液5 mL于25 mL衍生瓶。

干燥：向衍生瓶中加入2 mL無水乙醇，在80 ℃水浴下氮吹至干后放烘箱中100 ℃烘干1 h。

衍生提取：向上述衍生瓶中加入5 mL硅烷化試劑，立馬蓋上蓋子，超聲溶解5 min后放于80 ℃水浴振蕩中振搖45 min后取出冷卻至室溫。加入5 mL正己烷，渦旋混合30 s后于8 000 r·min-1離心3 min。

水洗凈化：取上層液2 mL加入2 mL水搖勻后于8 000 r·min-1離心3 min，取上層液于預(yù)先加少許無水硫酸鈉的15 mL離心管中，渦旋后過0.4 μm的濾膜，待測。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.100 mg·mL-1）：稱取 50 mg（精確到0.1 mg）的肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用25 mL水溶解并用95%乙醇定容至50 mL，搖勻。取1 mL此溶液，用70%乙醇稀釋至10 mL。分別吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于衍生瓶中，按上述1.4.1步驟進行“衍生提取”操作。

1.4.3 儀器條件

進樣口溫度：280 ℃；分流比10∶1；柱溫：起始溫度 60 ℃，以 20 ℃·min-1升到 240 ℃，保持1 min；然后以20 ℃·min-1升到260 ℃，后運行300 ℃，保持3 min。恒定流量：1.8 mL·min-1；進樣量：1 μL；檢測器（FID）溫度：300 ℃。

1.4.4 計算公式

樣品中肌醇的含量X按以下公式計算：

式中：X為樣品中肌醇含量，mg/100 g；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得試樣測定液肌醇的含量，μg；f為試樣測定液所含肌醇換算成試樣中所含肌醇的系數(shù)為10；m為試樣的質(zhì)量，g；100為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法對比

2.1.1 干燥時間對比

兩種干燥方法處理時間對比見表1。前處理干燥的步驟改用氮吹代替旋蒸，既節(jié)省了溶劑使用量也大大縮短了實驗時間，平均每個樣品可縮短12.5 min的干燥時間，有效提高實驗效率。本方法前處理簡單，需要很少的有機溶劑，對操作者和環(huán)境的危害小。

表1 兩種干燥方法處理時間對比

2.1.2 水洗凈化前后樣液對比

上機樣品對比見圖1。由圖1可知，增加的水洗步驟能使樣品得到進一步凈化，消除正己烷提取后的乳化現(xiàn)象。

2.1.3 色譜圖上的背景干擾對比

色譜圖上的背景干擾對比見圖2和圖3。由圖2和圖3可知增加的水洗步驟能使樣品得到進一步凈化，減少由于雜質(zhì)給儀器帶來的污染及有效減少色譜圖上的背景干擾，有效提高定性和定量的準(zhǔn)確性。

2.2 方法驗證

（1）通過采用質(zhì)控樣品分別按照方法優(yōu)化前與方法優(yōu)化后進行試驗，得到樣品結(jié)果與證書值（405.2±7.6）mg·kg-1做比較，每方法各平行6個樣品。

優(yōu)化前方法回收率在103.1%～114.7%，重復(fù)性條件下平行6樣結(jié)果的變異系數(shù)為3.70%，標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～200 μg時，校正方程的相關(guān)系數(shù)均為0.993。優(yōu)化后方法回收率在98.7%～101.7%，符合GB/T 27404—2008附錄F中回收率95%～105%（含量＞100 mg·kg-1時）的要求。重復(fù)性條件下平行6樣結(jié)果的變異系數(shù)為1.14%，符合GB/T 27404—2008附錄F中變異系數(shù)的要求；標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～200 μg時，校正方程的相關(guān)系數(shù)均為0.998，線性范圍滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求?？梢?，優(yōu)化后方法具更高的準(zhǔn)確度和精密度，見表2。

表2 兩種前處理方法質(zhì)控樣品結(jié)果比較

（2）選擇質(zhì)控樣品通過人員比對實驗對方法進行確認(rèn)。人員獨立測定結(jié)果的回收率分別為99.8%和100.1%，準(zhǔn)確度和精密度均符合標(biāo)準(zhǔn)要求；標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～200 μg時，校正方程的相關(guān)系數(shù)均為0.999，線性范圍滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求。不同人員獨立測定結(jié)果的相對偏差為0.30%，人員比對結(jié)果符合不同人員獨立測定結(jié)果相對偏差不大于10%的驗證方案要求。見表3。

表3 質(zhì)控樣品人員比對結(jié)果

經(jīng)驗證，新建立的方法有效解決了肌醇檢測技術(shù)中的難點，優(yōu)化后方法的各項技術(shù)指標(biāo)均達到標(biāo)準(zhǔn)要求，表明該檢測方法是有效的，滿足項目開展的要求，符合預(yù)期用途。

3 結(jié)果與討論

在肌醇檢驗檢測的前處理過程中，涉及衍生化的操作，目前主要是分為完全衍生化和非完全衍生化，其各自的產(chǎn)物不同，完全衍生化生成的是一個硅氧環(huán)己烷，不完全衍生化生成的是兩種產(chǎn)物[4]。而其衍生化程度與反應(yīng)過程的溫度有關(guān)，當(dāng)水浴溫度在70 ℃以下，待測物肌醇不能與硅烷化試劑結(jié)合生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的六（三甲硅氧基）環(huán)己烷，而是生成結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的β-四聯(lián)樹膠醛醣和五（三甲硅氧基）肌醇[5]；當(dāng)水浴溫度分別為80 ℃、90 ℃時，硅烷化反應(yīng)完全，反應(yīng)產(chǎn)物是單一的、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的六（三甲硅氧基）環(huán)己烷；如果水浴達到90 ℃或以上時，生成的產(chǎn)物由于水浴溫度太高而易揮發(fā)，導(dǎo)致其測定值的濃度降低，影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

總結(jié)以上實驗方法，除反應(yīng)對溫度敏感，還涉及人員在以下方面的實驗操作注意事項：①對于N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷和六甲基二硅烷胺烷，必須保證當(dāng)三者混合后無白色渾濁現(xiàn)象時方可使用；②硅烷化試劑放干燥柜中保存，避免吸水；③衍生實驗過程應(yīng)嚴(yán)格避免有水。