□ 文 張聰

微生物種類繁多，并在自然界中廣泛存在，其既可以起到有益作用，也可能給人類帶來危害。微生物引起的食品危害主要是食品的腐敗變質(zhì)，使食品的營養(yǎng)價值降低或完全喪失。其中，隨著食品生產(chǎn)規(guī)模的擴大和食品貿(mào)易的國際化，食源性致病微生物的控制面臨嚴峻挑戰(zhàn)—食源性致病微生物導致的全球食品安全問題不斷發(fā)生。例如，單增李斯特菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌和阪崎克羅諾桿菌等廣泛存在，且與疾病暴發(fā)密切相關。

為有效管控食品中的致病微生物，我國制定了《食品安全國家標準 食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》（GB 14881-2013）。其中提到，食品加工過程中的微生物監(jiān)控是確保食品安全的重要手段，是驗證或評估目標微生物控制程序有效性，以及確保整個食品質(zhì)量和安全體系持續(xù)改進的工具。

由此看來，食品微生物檢驗是衡量食品安全質(zhì)量的重要指標，也是判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況的重要手段。然而，普通檢測手段往往僅能檢測食品中微生物的種類和數(shù)量，并不能進行追根溯源。因此，高效準確、信息容量大的高通量基因測序技術在近幾年被逐漸應用到食品微生物檢驗領域，其可在信息缺乏或多種微生物存在的情況下對食源性致病微生物進行溯源和分析，以此為食源性微生物疾病預防和控制提供重要的依據(jù)。為了解高通量基因測序技術這一高精尖技術的發(fā)展，詳細分析該技術在食品微生物領域的應用，《食品安全導刊》雜志特設“高通量基因測序技術用于食品微生物鑒定和溯源”專題，邀請專家進行深入探討，來看看他們都說了些什么吧。

問：高通量基因測序技術在醫(yī)學領域已經(jīng)得到長足發(fā)展，但其在食品領域的應用是怎樣的？能否談談高通量基因測序技術的前世今生？

曾靜：高通量基因測序技術又稱下一代測序技術（NGS）。相對于一代測序技術，高通量測序技術具有準確、靈活、高通量及單堿基成本低等優(yōu)勢。在微生物高通量測序中，全基因組測序技術應用較為廣泛，它能檢測樣品中各遺傳物質(zhì)的相關性，從而追溯致病菌暴發(fā)源頭，因此很快在食品領域得到了廣泛的應用，為各類食源性致病菌的遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹構建、致病機理的理解和微生物溯源提供支持。

談及高通量基因測序技術的發(fā)展歷程，從1990年正式啟動“人類基因組計劃”直到2020年，這這30年的時間里，測序技術擁有17個里程碑式的成果，如2008年癌癥相關的基因測序揭示了基因突變與癌癥的相關性等；這30年也是測序技術飛速發(fā)展的時期，特別是在醫(yī)學領域，其已經(jīng)用于癌癥的預測與治療，并給無數(shù)患者帶來生的希望。

測序技術在醫(yī)學領域的應用也帶動了其在微生物領域的發(fā)展應用。2008年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）啟動了國家微生物全基因組計劃；2012年，F(xiàn)DA和美國疾病控制與預防中心（CDC）宣布啟動“10萬基因組計劃”，即對約10萬種重要的食品來源的致病菌（包括沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌等重要致病菌）進行測序，并將測序信息儲存在國家生物技術信息中心（NCBI）的公共數(shù)據(jù)庫；2014年，美國CDC啟動了基于全基因組測序技術的高級生物學檢測項目，并宣布在2018年將全基因組測序技術用于單核細胞增生李斯特氏菌的分子分型，以便快速準確地鎖定病因食品；2015年，歐盟食品安全局（EFSA）將全基因組測序技術用于食品中重要食源性致病菌的鑒定、分子分型、耐藥、血清分型等。

在我國，中科院微生物所于2018年牽頭組織發(fā)起了全球模式微生物基因組測序計劃—從全球微生物資源保藏中心選擇目前未進行測序的模式微生物菌株（包括細菌、古細菌和可培養(yǎng)真菌），5年內(nèi)完成超過10 000種的細菌、真菌、古菌模式菌株基因組測序，建立全球微生物模式菌株基因組測序合作網(wǎng)絡；2013年，國家食品安全風險評估中心（CFSA）首次在國內(nèi)采用全基因組測序技術處理新西蘭恒天然嬰兒配方食品污染可疑肉毒梭菌的食品安全應急事件；2015年，國家食品安全風險評估中心啟動了《國家食源性致病微生物全基因組測序數(shù)據(jù)庫》的構建工作，致力于病因食品的快速準確識別。

問：據(jù)了解，高通量測序技術在我國食品微生物領域的應用還停留在科學研究和數(shù)據(jù)庫構建階段，尚未在食品微生物檢測實驗室得到普及。那么，國家出臺了哪些政策與法規(guī)來助推和規(guī)范該技術的發(fā)展？

姜毓君：目前，我國關于高通量基因測序技術在微生物檢測領域的應用已經(jīng)發(fā)布了系列標準，如《環(huán)境微生物宏基因組檢測 高通量測序法》（GB/T 40226-2021）、《高通量基因測序技術規(guī)程》（GB/T 30989-2014）及《用于病原微生物高通量檢測的核酸提取技術規(guī)范》（GB/T 40458-2021）。此外，我國也設定了全球首個針對基因測序儀的行業(yè)標準—《高通量測序儀標準》（YY/T 1723-2020）。以上種種，均體現(xiàn)了我國在高通量基因測序領域的前瞻性和先進性。

杜欣軍：《高通量基因測序技術規(guī)程》（GB/T 30989-2014）適用于對動物組織、血液、糞便、口腔黏膜、毛發(fā)、植物組織、土壤、微生物等生物樣品進行檢測。該標準詳細規(guī)定了高通量基因測序相關的指標要求及條件，如測序通量、堿基識別正確率、堿基識別質(zhì)量、主要儀器設備要求、測序設備推薦使用條件、實驗室條件、試劑及溶液配制要求、測序過程等內(nèi)容。

目前，在流行病調(diào)查、病原溯源方面，國家市場監(jiān)督管理總局、疾控中心、衛(wèi)生健康委員會等職能部門已經(jīng)使用高通量測序技術對微生物進行監(jiān)控。國家“十三五”重點研發(fā)計劃設立的一些項目就包括針對微生物高通量測序、數(shù)據(jù)庫建立、溯源平臺與風險評估進行的研究，并已取得了不錯的進展。相信，在這些項目的支撐下，高通量測序技術的應用將來會越來越成熟、越來越規(guī)范，也將在流行病控制、食品安全保障方面發(fā)揮更大的作用。此外，《2035年遠景目標綱要》提出，圍繞基因與生物技術，加快基因組學研究應用，加快體外診斷研發(fā)；《“十四五”生物經(jīng)濟發(fā)展規(guī)劃》也在推動基因檢測、生物遺傳等先進技術與疾病預防的深度融合。

問：為什么要對食品中的微生物進行鑒定和溯源？在什么情況下需要進行這一操作？

白莉：食源性疾病是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題，頻發(fā)的食源性疾病事件不僅危害人類健康，也會造成嚴重的經(jīng)濟損失。在食品產(chǎn)業(yè)高度工業(yè)化的國家，一家公司生產(chǎn)的食品可快速銷往全國或全球，致使食源性疾病暴發(fā)呈現(xiàn)跨國界、跨區(qū)域、進展快、難預測等特點，如2011年德國產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌O104:H4污染芽苗菜和2017年南非單核細胞增生李斯特菌污染肉制品引起的暴發(fā)事件等。如何從散發(fā)病例的復雜食物暴露中快速識別病因食品的關聯(lián)性，進而確定暴發(fā)事件并迅速采取有效的處置措施是各國食源性監(jiān)測體系面臨的挑戰(zhàn)。

美國是最早建立食源性疾病暴發(fā)主動監(jiān)測系統(tǒng)的國家，美國CDC逐步建立基于實驗室的食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡（PulseNet），其在食源性疾病的暴發(fā)識別、調(diào)查、溯源、預警及疾病負擔研究中得到成功應用。歐盟也設有與美國相類似的監(jiān)測系統(tǒng)，其也在食源性暴發(fā)事件中發(fā)揮著快速識別及預警作用。近期全球多國報告單相鼠傷寒沙門菌污染巧克力產(chǎn)品事件就是最好的實例。2022年3月27日，英國衛(wèi)生安全局（UK Health Security Agency，UKHSA）向世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）通報了一組由來源不明的序列 型（Sequence Typing，ST）34型單相鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium4,[5],12:i:-）引發(fā)的聚集性病例，隨后歐洲多個國家陸續(xù)報告了相關病例。通過流行病暴發(fā)溯源調(diào)查，應用全基因組測序技術確定了A公司在比利時工廠B生產(chǎn)的巧克力產(chǎn)品為病因食品。對涉事企業(yè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，是兩株單相鼠傷寒沙門菌導致此次暴發(fā)事件。

董慶利：由于食品風險環(huán)節(jié)復雜多變，故僅檢測某廠家或某批次食品中是否有特定微生物的效果微乎其微，只有通過溯源技術對所分離的微生物進行特征分析，揭示其可能來源，識別可能的傳播途徑，進而制定相應的防控措施，才能有效管控污染來源。典型應用場景如下。

第一，食品及環(huán)境中微生物多樣性及溯源研究。對生產(chǎn)過程中車間人員手部和設備表面進行微生物污染調(diào)查。從樣本中分離菌株，得到各類微生物的相對豐度，即多樣性；若通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)同種微生物高度相關，則推測人員手部與設備表面存在交叉污染；若物料容器中多次分離出某菌，則提示容器是污染源之一。

第二，常見食源性致病菌風險分析。研究泡菜發(fā)酵操作與其中致病菌檢出間的關聯(lián)性，分析泡菜中致病菌存在的風險。如家庭泡菜易出現(xiàn)腸桿菌屬和假單胞菌屬，工業(yè)泡菜中李斯特菌屬出現(xiàn)機率較大，發(fā)酵時間與葡萄球菌屬和李斯特菌屬出現(xiàn)概率呈正相關。

問：目前，國內(nèi)外進行食源性致病微生物鑒定與溯源的水平如何？

白莉：隨著新一代測序技術的發(fā)展，基于全基因組測序的分子分型技術在食源性疾病聚集性病例識別和暴發(fā)溯源調(diào)查中已顯示出極大的應用價值和發(fā)展?jié)摿Γ⒅饾u成為國際研究熱點，歐美相關國家已相繼開展研究和布局。

在歐美等國，因全基因組測序技術具有更高的分辨率，已逐步取代傳統(tǒng)的分型方法，如PFGE、MLVA和MLST，并用于一系列高優(yōu)先級的食源性致病菌。比如，美國CDC于2013年開始使用該技術監(jiān)測單核細胞增生李斯特菌，到2019年全面取代PFGE成為識別和監(jiān)測的金標準，并用于非傷寒沙門菌、單核細胞增生李斯特菌、彎曲菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(STEC)的監(jiān)測。

目前，我國食源性疾病監(jiān)測報告系統(tǒng)中每年報告近萬起暴發(fā)事件，識別的事件多暴發(fā)在同一就餐地點（家庭、賓館）或集中供餐場所（學校），跨區(qū)域的暴發(fā)較少。雖然我國已建立基于流行病學調(diào)查和實驗室確證（PFGE/WGS）食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測體系，但在快速識別方面仍存在一定的不足。如何快速識別未知病因食品的關聯(lián)散發(fā)病例，并在短時間內(nèi)確認為暴發(fā)事件，及時發(fā)布風險預警來降低食源性疾病風險，是下一步工作中需要直面的挑戰(zhàn)性課題。美國食源性暴發(fā)識別系統(tǒng)從消費者暴露病因食品、發(fā)病后就醫(yī)（第1～5天），到臨床樣本分離株在公共衛(wèi)生實驗室完成全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）和其他檢測上傳至PulseNet（第16～22天），再到美國CDC基于數(shù)據(jù)庫中病例信息的比對識別確定關聯(lián)病例并確定是否為暴發(fā)事件（第23天），只需3～4周的時間。確定為暴發(fā)事件后，公共衛(wèi)生和監(jiān)管機構將聯(lián)合啟動暴發(fā)調(diào)查，收集流行病學和衛(wèi)生學調(diào)查、臨床和實驗室檢驗資料；當明確食源性疾病暴發(fā)的病因食品后，政府會立刻向公眾發(fā)出警示并召回食品。借鑒美國CDC和ECDC應對此類暴發(fā)的成熟體系和措施，基于我國現(xiàn)有食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測體系，完善處置過程不同環(huán)節(jié)（疾控、監(jiān)督、哨點醫(yī)院）的職責和銜接，加強流行病學數(shù)據(jù)和菌株信息共享，提高監(jiān)測數(shù)據(jù)分析及預警能力，從技術層面上提升此類事件應急管控措施的時效性，有助于為政府食品安全管理部門的快速決策提供科學依據(jù)，實現(xiàn)食品安全防控從被動應付向主動防控的戰(zhàn)略轉變，進而提高公共安全防控水平。

董慶利：進入“十三五”以來，國內(nèi)對微生物全基因組測序技術已經(jīng)取得共識，但需要迅速將該技術普及并用于食源性致病菌鑒定、分型及溯源。傳統(tǒng)的食源性疾病暴發(fā)中，病原菌的確認通常需要幾周或更長時間，全基因組測序技術可在幾天內(nèi)確定致病菌—及時控制并召回病因食品，并為有效診治患者提供強有力的技術支持。另外，宏基因組測序及宏轉錄組測序技術目前在國內(nèi)和國際社會呈快速發(fā)展勢頭。隨著微生物組學的發(fā)展和配套生物信息方法學技術的進一步開發(fā)，下一代測序也將成為食源性致病菌基因組數(shù)據(jù)平臺中不可或缺的一部分。希望在不久的將來，下一代測序技術能與更多新興方法相結合，使其不僅應用于食源性致病菌的檢測識別及溯源，還能為推動食品安全事業(yè)發(fā)展作出貢獻。

問：您所在的單位是否會用到高通量測序技術？其主要用于哪方面的研究？在此過程中，該技術幫助貴單位取得了怎樣的成果？

白莉：國家食品安全風險評估中心以國家食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡（TraNet）為基礎，首次建成了基于全基因組測序分型技術的新型食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡，這也是我國首個實現(xiàn)國家、省、市三級實際應用的分子溯源網(wǎng)絡。該技術的推廣和使用不僅需要解決龐大基因組數(shù)據(jù)的傳輸、儲存、快速計算和精準比對，還需要成熟易用的生物信息學分析流程和標準化解釋系統(tǒng)。針對上述問題，一方面研究團隊搭建了我國首個全基因組數(shù)據(jù)計算云引擎，即將標準化的數(shù)據(jù)分析流程轉移到云端，此舉在很大程度上降低了數(shù)據(jù)分析、運算及使用門檻。另一方面，研究團隊開發(fā)了基于阿里云OSS的全基因組測序三級架構原始測序數(shù)據(jù)交付中心，實現(xiàn)了原始數(shù)據(jù)的實時快速上報及安全傳輸。在此基礎上，還建立了基于原始及拼接后數(shù)據(jù)的全基因組特征基因圖譜識別算法。通過以上兩種分析方式的相互校正，顯著提高了全基因組特征基因分析的準確性，同時建立了分辨力高、重復性好的全基因組多位點序列分型（wgMLST）與核心基因組多位點序列分型（cgMLST）標準化方法，以及結合流行病學信息構建了溯源分析知識庫，實現(xiàn)了不同實驗室間測序數(shù)據(jù)的快速分析、比對與共享。

此外，研究團隊還進一步研究并整合了美國國家生物技術信息中心（NCBI）、抗性基因數(shù)據(jù)庫（CARD）、耐藥基因數(shù)據(jù)庫（ResFinder）、致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫（VFDB）等公共數(shù)據(jù)庫中的特征基因數(shù)據(jù)，開發(fā)了常見食源性致病菌毒力因子、耐藥基因、血清分子分型等自動化分析功能模塊，有助于各級實驗室開展食源性微生物遺傳與變異特征、致病和耐藥機制及菌株進化等方面的基礎研究。目前，分子溯源網(wǎng)絡已經(jīng)在泰國腸炎沙門氏菌暴發(fā)病例的跨省溯源、冷凍飲品中單核細胞增生李斯特氏菌的跨省追蹤等事件調(diào)查中得到成功應用。該網(wǎng)絡的建成和運行，也將為我國食源性疾病暴發(fā)的快速調(diào)查和精準溯源提供技術支撐。

杜欣軍：目前，我所參與的科研項目有很多會涉及高通量基因測序技術，主要是基因組和轉錄組測序方面。在此過程中，會運用比較基因組學、轉錄組技術對各類食源性致病微生物的侵染、抗逆等相關功能基因進行通量化分析。例如，最近承擔的國家重點研發(fā)計劃項目“致病微生物功能基因深入分析與溯源技術研究”，就基于大量的致病微生物基因組測序結果，以傳統(tǒng)分型方法為參考，通過設置合理的閾值獲得不同致病菌的多態(tài)性標識物，建立基于核心功能基因以及全基因組的微生物精準溯源技術，從而實現(xiàn)食源性致病微生物的精準溯源追蹤。該成果將為我國生物性食品安全危害因子的檢測與控制提供系統(tǒng)的理論指導與技術支持，進而幫助提升食源性微生物管控水平、提高我國食品安全保障能力。

李慧：中糧營養(yǎng)健康研究院作為中糧集團核心研發(fā)機構，是國內(nèi)首家以企業(yè)為主體的、針對中國人的營養(yǎng)需求和代謝機制進行系統(tǒng)性研究以實現(xiàn)國人健康訴求的研發(fā)中心。針對食品微生物安全開展的研發(fā)技術支持和技術服務工作，中糧營養(yǎng)健康研究院食品安全研究團隊會結合不同食品行業(yè)的特點，依據(jù)《食品安全國家標準 食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》（GB 14881-2013）食品加工過程的微生物監(jiān)控程序指南，建議食品加工過程環(huán)境微生物監(jiān)控程序，開展環(huán)境微生物監(jiān)控工作。同時，也會根據(jù)不同食品加工企業(yè)的實際情況開展可培養(yǎng)微生物分離技術及鑒定工作，并結合高通量基因測序技術的測序深度大和準確度高等優(yōu)勢，采用高通量基因測序技術對生產(chǎn)環(huán)境中的微生物進行溯源和分析，以便及時確認污染微生物來源，達到徹底消除微生物污染源的目的。

曾靜：在海關檢測工作中，一些高端水產(chǎn)，如皇帝蟹、龍蝦、三文魚等，往往來自不同國家、不同海域。因此，進境時的必檢項目有單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等。但因弧菌屬的微生物在遺傳特性和生理生化表型上比較相近，甚至于在顯色平板上不具有明顯的特征，所以采用傳統(tǒng)方法完全準確鑒定弧菌到種水平往往較為困難，這時全基因組測序就顯出它的優(yōu)勢。

我實驗室分離了4株非典型弧菌，它們在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顏色與溶藻弧菌相同，而VITEK和微生物質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）均鑒定為副溶血性弧菌。采用全基因組測序技術將4株菌進行全基因組測序，利用平均核苷酸一致性分析方法確定弧菌的種，測序結果與魔鬼弧菌的平均核苷酸一致性值約為98%，與溶藻弧菌和副溶血性弧菌的平均核苷酸一致性值分別為92%和84%，因此判定為魔鬼弧菌。如上，測序技術具有其他方法和技術不可比擬的分辨率和準確性，傳統(tǒng)方法雖然是菌株鑒定的金標準，但是細菌的染色體較小，適應環(huán)境過程中易產(chǎn)生變異，造成生化反應不典型，難以鑒定到種水平。被傳統(tǒng)方法鑒定為副溶血性弧菌，通過基因測序，依據(jù)平均核苷酸一致性原則判定為魔鬼弧菌，而魔鬼弧菌并不屬于食源性致病微生物。同時，還得到了大量遺傳、耐藥性、致病基因信息。

問：以華大智造為代表的國產(chǎn)高通量基因測序儀器品牌經(jīng)歷多年的發(fā)展，已經(jīng)獲得了長足的進步，您認為其應朝著什么方向繼續(xù)努力？

曾靜：華大智造作為我國高通量基因測序方面的龍頭企業(yè)，在測序技術上得到快速發(fā)展的事實是有目共睹的—研發(fā)出用戶體驗良好的測序平臺，并參與國家的“人類基因組計劃”等，這些年華大智造展現(xiàn)的成績非常突出，也是我國許多科技企業(yè)學習的楷模。至于測序行業(yè)的未來努力方向，目前難以做到的是“標準化”，只有做到全方位的標準化，測序結果的準確性才會更高。

對于儀器設備的需求，在入境口岸，針對入境人員攜帶病原檢測，這時需要傻瓜型的微量測序儀—易攜帶、界面友好、操作簡單、速度快，以及結果報告準確；在海關檢測實驗室，則需要具備強大的數(shù)據(jù)庫、對操作人員無需特殊培訓、自動建立基因文庫、自動拼接、自動結果分析，并給出準確結果的測序儀。

姜毓君：高通量測序技術的特點之一是操作步驟多、程序復雜，既包括實驗室內(nèi)的標本預處理、核酸提取及其片段化、建庫、擴增、靶序列富集、混樣、測序前準備及測序，也包括測序后的數(shù)據(jù)質(zhì)量分析、比對、變異分析、注釋和結果報告與解釋等生物信息學分析流程。任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都會影響檢測結果的準確性，導致研究失去可靠價值。隨著研究人員對高通量基因測序技術的需求日漸提高，考慮到實驗結果的準確性與及時性，在未來發(fā)展中，通過檢測技術及儀器的提高，來減少測序步驟，提高應用性，從而實現(xiàn)自動化是關鍵要求。

未來，高通量測序技術將進一步在以下方面為食品微生物研究提供重要支持。

第一，利用基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡重構與模擬，能夠對微生物進行系統(tǒng)水平的研究，并為微生物的調(diào)控提供重要線索。

第二，利用基因組技術與轉錄組、代謝組等其他組學技術相結合，能夠更加全面地研究食品微生物群落的代謝物、代謝能力、生態(tài)組成和動態(tài)變化等信息。

第三，利用生物信息學工具和大數(shù)據(jù)的方法，建立預測模型，對食品微生物及其群落的特征及其變化進行研究，也將成為一個重要的方向。

綜合幾位專家的觀點來看，高通量測序在食品微生物鑒定和溯源領域的確是一個極具前景的科學，其數(shù)據(jù)可用于進一步分析包括基因預測和注釋、比較基因組學和進化分析，為微生物特征提供更清晰的圖像，并做出更精確的結論，進而為食品安全管理提供新的思路和方法。

未來，伴隨高通量基因測序技術的進一步發(fā)展，其測序質(zhì)量更高、成本更低、速度更快，并將在食品領域得到更廣泛的應用，從而進一步推進食品領域各類相關研究、以及技術產(chǎn)品的發(fā)展和革新，為高品質(zhì)食品的研發(fā)、食品安全的保障做出更大的貢獻。