嚴(yán)玉玲，郭 焰，豆一玲，黃文書

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830021；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052）

無核白葡萄果呈橢圓形，果糖含量多，是葡萄中的“綠色明珠”[1]。該品種含糖量可達(dá)20%～30%，含酸量種類多，富含多種蛋白質(zhì)和營養(yǎng)素。時常食用能有效抗氧化、耐衰老、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)心血管及內(nèi)分泌系統(tǒng)。近年來，葡萄醋飲料受到老百姓的喜愛，是在現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)上加工而成的，營養(yǎng)價值頗為豐厚?？谖渡屑?，深受消費者喜愛[2-3]。無核白葡萄營養(yǎng)價值高但其加工水平較低，基本處于初級加工階段[4]。

液態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高、易于操控的優(yōu)點，但仍有不足之處，最明顯的缺點是菌種單一、酸味濃厚。保證在不改變酵母菌生長狀態(tài)的基礎(chǔ)上，盡量食用混合菌種來發(fā)酵，能為發(fā)酵階段提供豐富的風(fēng)味物質(zhì)[5-6]。利用新疆富足的葡萄資源研發(fā)葡萄醋產(chǎn)品不僅符合未來的市場發(fā)展方向，還減少了銷售新鮮葡萄的壓力。更重要的是，提供了深度加工和綜合利用葡萄的實用方法，為未來葡萄醋飲料的工業(yè)生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核白葡萄，市售；高活性干酵母，深圳尚格酵母有限公司提供；乳酸菌，學(xué)院保藏；中科AS1.41活性醋酸桿菌，上海佳民釀造食品有限公司提供；果膠酶（50 000 U/g），（食品級），上海祁邦實業(yè)有限公司提供；蔗糖（食品級），符合GB/T 317—2006標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器和設(shè)備

HPS-250型生化培養(yǎng)箱，黑龍江月東電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-2型恒溫水浴鍋，北京市山島儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海中安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州凈化有限公司產(chǎn)品；WYT型手持糖度儀，成都光學(xué)廠產(chǎn)品；PHS-3C型pH計，江蘇億達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 無核白果醋制備工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）原料預(yù)處理[7]。甄選葡萄粒，清洗揉碎，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的異維C鈉溶液以進(jìn)行顏色保護(hù)。

（2）果膠酶處理。將0.1%果膠酶加入帶有葡萄果皮的果汁中，于50℃下保持1 h，然后加熱至70～80℃以滅活果膠酶10 min，增加果汁產(chǎn)量，這有助于提升在后發(fā)酵時菌體與果汁的接觸率。

（3）成分調(diào)整。如果未涉及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，則每千克糖可以生產(chǎn)約0.67 kg醋酸，可以通過預(yù)期的酒精含量添加蔗糖來調(diào)節(jié)葡萄汁的糖含量。加入檸檬酸，將發(fā)酵原料的酸含量調(diào)節(jié)至0.8%～1.2%。將調(diào)整后無核白葡萄果汁裝入容器中，于65℃水浴條件下進(jìn)行滅菌處理0.5 h。

（4）酵母活化。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～5%的蔗糖溶液，煮沸，將其冷卻至35～40℃，加入活性干酵母，水化處理15～20 min，溫度冷卻至34℃，活化2 h后存儲[8]。

（5）混菌酒精發(fā)酵。按比例量取酵母菌和乳酸菌，以一定的比例與無核白葡萄汁混合，于37℃水浴中溫育，直到出現(xiàn)了大量氣泡后才能活化，將其接種到處理過的果汁中并在合適的溫度下發(fā)酵。當(dāng)液面無氣泡產(chǎn)生標(biāo)志著發(fā)酵完成[9]。

（6）醋酸發(fā)酵。將保存在斜面上的醋酸菌接種到含有醋酸菌的活化培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)24 h，然后用顯微鏡檢查，確保細(xì)菌良好。細(xì)菌數(shù)量增加10%后，將酒精發(fā)酵液和醋酸菌種子混合均勻置于33℃的環(huán)境中。發(fā)酵完成后，進(jìn)行粗過濾和用澄清劑的澄清。

1.3.3 混菌酒精發(fā)酵試驗

將滅菌后的無核白葡萄原液，冷卻至室溫后，按5%總接種量接入擴(kuò)培后的酵母菌和乳酸菌，2種菌分別按4∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶4（V/V）的比例混合，用紗布封口，30℃下恒溫靜置發(fā)酵，定期觀察發(fā)酵液的變化情況，并規(guī)律地測定發(fā)酵液酒精含量，糖分占比等參數(shù)確定適宜的混合菌配比。

酵母菌與乳酸菌的總接種量分別為1%，3%，5%，7%，9%。在設(shè)定的條件下發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束，最后檢測發(fā)酵液中酒精含量可知酵母和乳酸菌最佳配比的數(shù)值[10-11]。

1.3.4 無核白果醋發(fā)酵單因素試驗

分別選取醋酸菌接種量（5%，8%，10%，12%，15%，20%）、初始酒精度（3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%）、發(fā)酵的溫度（22，25，28，30，32，35℃）、發(fā) 酵 液pH值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5）對這4個因素進(jìn)行單因素試驗，根據(jù)發(fā)酵液中酸的總含量確定適宜的發(fā)酵條件，便于響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.3.5 無核白果醋發(fā)酵響應(yīng)面試驗

在單因素測試結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用發(fā)酵后測得的酸的總含量為響應(yīng)值，選取接種量（X1）、初始酒精含量（X2）和發(fā)酵的溫度（X3）為響應(yīng)值面分析因素，設(shè)計了三因素三水平，一共15個測試點的響應(yīng)面分析試驗。

響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計

1.3.6 測定方法

酸的總含量測定，NaOH滴定法（GB 7698—2014）；酒精度，蒸餾比重法；pH值的測定，PHS-3C型pH計；可溶性固形物，手持糖度計法。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌酒精發(fā)酵過程試驗結(jié)果

2.1.1 酵母菌和乳酸菌接種配比的優(yōu)化

酵母菌與乳酸菌最佳配比試驗見表2。

表2 酵母菌與乳酸菌最佳配比試驗

由表1可知，當(dāng)酵母和乳酸菌的配比為3∶2時，測得的酒精度為7.8%，此時為最高含量為總酸含量為3.6 g/L，最小殘?zhí)呛繛?.1 g/L，其他比例產(chǎn)生的酒精相對較低，因此可以確定酵母和乳酸菌的最佳配比為3∶2。

2.1.2 酵母菌和乳酸菌接種量的優(yōu)化

菌種接種量對酒精發(fā)酵過程的影響見圖1。

圖1 菌種接種量對酒精發(fā)酵過程的影響

由圖1可知，接種1%的酵母時，由于接種量過低，酵母繁殖緩慢，容易生長細(xì)菌，進(jìn)而造成發(fā)酵過程中產(chǎn)生較少的酒精；當(dāng)接種的酵母為5%或7%時，發(fā)酵達(dá)到7 d時，產(chǎn)生的酒精度低于3%接種產(chǎn)生的酒精含量?？赡苁怯捎诮湍附臃N量過高，容易產(chǎn)生過多的代謝廢物，從而影響正常的發(fā)酵過程。因此，可以確定混合發(fā)酵時的細(xì)菌接種總量為5%，其中酵母接種量為3%，乳酸菌接種量為2%。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 醋酸菌接種量對無核白果醋發(fā)酵的影響

醋酸菌接種量對產(chǎn)酸率的影響見圖2。

圖2 醋酸菌接種量對產(chǎn)酸率的影響

由圖2可知，5%的醋酸菌接種量不足以使得發(fā)酵快速完成，所需時間較長。酸生成速度慢，發(fā)酵完成的時間較長，發(fā)酵全部完成時的酸的總量也很低。當(dāng)大于10%的接種量時早期產(chǎn)酸速度高，隨著時間的推移，后期菌體代謝能力降低生長速度放緩慢，對于發(fā)酵整體不易調(diào)控。在接種量為8%～10%時酸的生長數(shù)量十分迅速，在完成總體發(fā)酵時酸總量也十分高。接種量不大時菌體的生長速度慢，發(fā)酵周期也會受到影響，進(jìn)而影響生產(chǎn)效率，所需的成本較高；相反，接種量大的菌體生產(chǎn)旺盛，菌種的壽命縮短，前期營養(yǎng)的消耗較大，影響到材料的轉(zhuǎn)化效率，所需的經(jīng)濟(jì)成本也過大。只有在接種量適中的區(qū)間，菌體生長能縮短發(fā)酵所需要時間，使發(fā)酵過程中盡量不會被污染，整體增加產(chǎn)品的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)品質(zhì)量。在研究無核白葡萄果醋發(fā)酵的影響條件中，醋酸菌接種量最合適的范圍是8%～10%。

2.2.2 發(fā)酵液初始酒精度對無核白果醋發(fā)酵的影響

初始酒精度與總酸含量之間的關(guān)系見圖3。

圖3 初始酒精度與總酸含量之間的關(guān)系

由圖3可知，開始發(fā)酵的酒精度越高，間接影響著總酸生成量。總酸含量隨著一開始的酒精度數(shù)升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在7%（V/V）時可達(dá)到最大值，此時的數(shù)值為6 g/100 mL。原因可以歸結(jié)為酒精度數(shù)有助于菌的生成，為菌的生長提供了良好的生存環(huán)境。由圖3可知，7%是最合適的酒精度數(shù)。

2.2.3 醋酸發(fā)酵溫度對無核白果醋發(fā)酵的影響

醋酸發(fā)酵溫度與總酸含量之間的關(guān)系見圖4。

圖4 醋酸發(fā)酵溫度與總酸含量之間的關(guān)系

由圖4所知，溫度對總酸的含量有著十分重要的影響，溫度越高分子運(yùn)動越劇烈，但是這個影響并不是一直正相關(guān)，轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)在30℃，大于這個溫度，酸的總量不會迅速增長。由圖4可知，總酸含量增速降低，29℃為最適溫度。

2.2.4 發(fā)酵液pH值對無核白果醋發(fā)酵的影響

發(fā)酵液pH值對總酸含量的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵液pH值對總酸含量的影響

由圖5可知，當(dāng)醋酸菌在菌落環(huán)境pH值為3.5時，底酸濃度太高的話不利于醋酸菌生長繁殖，從而導(dǎo)致在6 d以后醋酸菌不再繁殖，轉(zhuǎn)化率幾乎不再增長；而當(dāng)pH值為5.5時，在6 d以后產(chǎn)酸量反而逐漸降低，原因可能是出現(xiàn)嚴(yán)重的過氧化現(xiàn)象。因此最優(yōu)的初始pH值應(yīng)在4.0～5.0。

此模型用來探究影響試驗的條件具體硬性的效果如何。

Box-behnken試驗設(shè)計結(jié)果分析見表4。

表4 Box-behnken試驗設(shè)計結(jié)果分析

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化醋酸發(fā)酵結(jié)果

探究無核白果醋發(fā)酵最合適條件，響應(yīng)值設(shè)定為總酸含量。通過響應(yīng)面軟件設(shè)計三因素三水平分析試驗。

Box-behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計表及結(jié)果見表3。

表3 Box-behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計表及結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

根據(jù)測定結(jié)果建立相關(guān)的數(shù)學(xué)模型為：

由表4可知，模型的Prob＞F項小于0.05（數(shù)據(jù)＜0.0001），說明處理后的數(shù)據(jù)結(jié)果十分突出，當(dāng)X1、X2、X3的Prob＞F值小于0.01，無核白葡萄果醋發(fā)酵總酸含量與醋酸菌的接種量、初始酒精度和發(fā)酵的溫度呈正相關(guān)。當(dāng)Prob＞F值為＞0.01（為0.058 8），失擬項不明顯，選擇擬合模型。此外，利用軟件計算顯示相關(guān)模型系數(shù)R2=98.32%，大于90%。模型預(yù)判貼近，通過軟件分析得到相關(guān)變異系數(shù)（CV），變異系數(shù)反映模型的置信度，CV值越低模型的執(zhí)行度越高，試驗的CV值為2.66%。說明此模型具有指導(dǎo)價值，可以進(jìn)一步研究應(yīng)用。

2.3.2 無核白醋酸發(fā)酵試驗的響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化[12]各因素相互作用對醋酸發(fā)酵的曲面響應(yīng)圖見圖6。

圖6 各因素相互作用對醋酸發(fā)酵的響應(yīng)曲面圖

由圖6（a）可知，發(fā)酵液酸的含量大的菌種條件分別為接種量為10%，初始酒精度為6%。由圖6（b）可知，接種量為10%時，發(fā)酵溫度為28.96℃時，發(fā)酵液中總酸含量達(dá)到最大值。由圖6（c）可知，初始酒精度為6%時，發(fā)酵溫度為28.96℃時，總酸最多。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，得出醋酸發(fā)酵的最佳條件為接種量10%，初始酒精度6%，發(fā)酵溫度28.96℃，依據(jù)模型方程預(yù)測得到發(fā)酵液總酸含量6.65 g/100 mL。

2.3.3 驗證試驗

為檢驗此模型可靠性，根據(jù)試驗的結(jié)果對接種量、初始酒精度及發(fā)酵溫度進(jìn)行微調(diào)，選擇10%接種量，6%初始酒精度，28.5℃環(huán)境溫度作為發(fā)酵過程的外界條件操作試驗，最終發(fā)酵液中總酸含量為6.67 g/100 mL，與模型預(yù)測的值（6.65 g/100 mL）相差較小，說明了回歸方程對實際應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面軟件探究了無核白葡萄果醋醋酸發(fā)酵條件的影響值，利用模型最終確定接種量為10%，初始酒精度為6%，溫度為28.5℃。發(fā)酵完成后發(fā)酵液中的總酸含量為6.67 g/100 mL。同時，發(fā)酵中途加入乳酸菌多菌種的共同發(fā)酵，能提高體系中風(fēng)味物質(zhì)的含量，進(jìn)而使得后期生產(chǎn)的飲料口感更好?；炀l(fā)酵工藝試驗結(jié)果表明，釀酒酵母和乳酸菌的總菌接種量為5%，接種比例為3∶2時，發(fā)酵效果最佳。