梁輝 楊金平 范銀白

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰腺外科，江西南昌330006；2.江西省贛州市立醫(yī)院麻醉科，江西贛州341099；3.江西省贛州市人民醫(yī)院體檢科，江西贛州 341000

原發(fā)性肝癌簡稱肝癌，已躍居世界惡性腫瘤致死病因第2位[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（mam malian target of rapamycin complex，mTOR）為相對保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)控細胞增殖、凋亡、自噬、遷移黏附、骨架調(diào)節(jié)等[2]，mTOR有mTORC1/2兩種催化亞基形式存在，其中mTORC1對雷帕霉素敏感，而mTORC2對雷帕霉素不敏感[3]，Rictor在mTORC2所介導(dǎo)的腫瘤活化機制中扮演重要角色[4]。微RNA（microRNA，miRNA）可通過和下游靶基因的3′-非翻譯區(qū)相結(jié)合，以調(diào)控細胞基因轉(zhuǎn)錄后水平，參與細胞存活率、凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。miR-424-5p為肝癌組織中低表達的新型miRNA，過表達后可抑制肝癌進展[7]。自噬是由溶酶體介導(dǎo)的降解途徑，可降解細胞器內(nèi)受損及冗余成分成小分子，供細胞再利用，對細胞內(nèi)環(huán)境起維穩(wěn)作用，如何誘導(dǎo)癌細胞自噬性死亡為肝癌治療研究重點[8-9]。本文將研究miR-424-5p/Rictor/mTORC信號軸誘導(dǎo)肝癌細胞自噬性死亡的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌細胞Hep-3B購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。常規(guī)復(fù)蘇肝癌細胞Hep-3B，細胞常規(guī)培養(yǎng)于Dulbecco′s改良培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液，37℃，CO2濃度5%，隔天換液，細胞密度達50%～70%時更換為不含胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2 儀器與試劑

人肝癌細胞Hep-3B購自中國科學(xué)院上海細胞所；PBS緩沖液購自范德生物科技公司；miR-424-5p mimics、miR-424-5p inhibitors、Rictor過表達質(zhì)粒、Rictor siRNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；FBS購自美國Invitrogen公司；DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；100U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素購自北京Solarbio公司；轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司；兔抗Lc3-Ⅱ抗體、兔抗Lc3-1抗體、兔抗Beclin1抗體、兔抗P62抗體購自Abcam公司；pmiR-REPORTTMLucifeRase系統(tǒng)購自美國Promega公司；DMSO購自美國Sigma公司；總RNA抽提試劑盒、Custom gene qRT-PCR定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas有限公司；PCR引物購自上海生工公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗、FITC標記的二抗及ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司；7900HT Real-time PCR儀購自美國ABI公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，激光共聚焦顯微鏡購自無錫聯(lián)發(fā)易創(chuàng)科技有限公司；CCK8試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司；FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司；超低溫冰箱購自日本Sanyo公司；雙報告基因檢測分析儀購自美國Promega公司。

1.3 分組及方法

取1×106個處于對數(shù)生長期的Hep-3B細胞，種植于6孔板中。①對照組：PBS；②過表達miR-424-5p組：轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimics；③干擾miR-424-5p表達組：轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor；④過表達Rictor組：轉(zhuǎn)染Rictor過表達質(zhì)粒；⑤干擾Rictor表達組：轉(zhuǎn)染Rictor siRNA。

1.4 觀察指標

1.4.1 細胞活性CCK-8實驗檢測細胞活性，描繪細胞生長曲線。

1.4.2 細胞凋亡及細胞周期收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，800 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，乙醇固定，PBS洗滌，加1 g/L核糖核酸酶200 μl，37℃孵育30 min，加入PI染液1 ml，4℃避光放置30 min后予以流式細胞儀檢測。

1.4.3 自噬情況①透射電鏡法觀察切片自噬體形成，采用激光共聚焦顯微鏡分別在488、587 nm激發(fā)波長下觀察自噬小體、自噬溶酶體形成；②RT-PCR、Western blot檢測細胞Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1、P62 mRNA和蛋白表達水平。

1.4.4 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/蛋白激酶B/mTORC1信號軸激活情況①RT-PCR測定miR-424-5p/Rictor/mTORC2/蛋白激酶B（protein kinases B，Akt）/mTORC1信號軸關(guān)鍵分子mRNA表達水平；②采用Western blot法檢測Rictor、mTORC2、Akt、mTORC1蛋白表達。

1.4.5 miR-424-5p與Rictor靶向關(guān)系驗證以肝癌細胞Hep-3B基因組DNA為模板，利用熒光素酶活性實驗驗證miR-424-5p與Rictor的靶向關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間行LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hep-3B細胞中miR-424-5p表達

miR-424-5p在Hep-3B細胞中低表達，表達量為（0.45±0.05），大小為307 bp（圖1）。

圖1 Hep-3B細胞中miR-424-5p表達

2.2 各組細胞凋亡、細胞活性、細胞周期的比較

過表達miR-424-5p組G0+G1期細胞比例高于對照組，而細胞活性低于對照組，干擾miR-424-5p表達組及過表達Rictor組G0+G1期細胞比例低于過表達miR-424-5p組，細胞活性高于過表達miR-424-5p組、干擾Rictor表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組、干擾Rictor表達組的G0+G1期細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。過表達miR-424-5p組細胞凋亡率高于對照組，干擾miR-424-5p表達組及過表達Rictor組細胞凋亡率低于過表達miR-424-5p組，干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組干擾Rictor表達組的細胞凋亡率比較，無明顯差異（圖2～3，表1）。

圖2 各組細胞凋亡情況

圖3 各組細胞活性的比較

表1 各組細胞周期構(gòu)成的比較（%，±s，n=10）

表1 各組細胞周期構(gòu)成的比較（%，±s，n=10）

注G0、G1、S、G2、M為細胞周期；與對照組比較，aP＜0.05；與過表達miR-424-5p組比較，bP＜0.05

組別G0+G1SG2+M對照組過表達miR-424-5p組干擾miR-424-5p表達組過表達Rictor組干擾Rictor表達組F值P值47.15±4.86 64.32±6.57a 53.87±5.43b 50.18±5.23b 57.62±5.89ab 14.146＜0.001 25.53±2.62 23.88±2.47 19.46±1.98a 17.23±1.85ab 21.35±2.26ab 21.798＜0.001 27.96±2.85 11.02±1.24a 27.98±2.86b 32.76±3.35ab 31.42±3.25ab 96.839＜0.001

2.3 自噬小體、自噬溶酶體形成情況的比較

過表達miR-424-5p組在488、587 nm激發(fā)波長下發(fā)現(xiàn)自噬小體、自噬溶酶體，且多于對照組（圖4）。

圖4 自噬小體、自噬溶酶體形成情況的比較

2.4 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸激活情況

過表達miR-424-5p組Rictor、mTORC2、Akt、mTORC1的mRNA表達水平低于干擾miR-424-5p表達組及過表達Rictor組，高于干擾Rictor表達組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組、干擾Rictor表達組的Rictor水平均高于對照組，干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組的mTORC2、Akt、mTORC1表達水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組、干擾Rictor表達組的Rictor、mTORC2、Akt、mTORC1表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2～3，圖5～6）。

圖5 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸mRNA表達水平（n=10）

表2 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸mRNA表達水平的比較（±s，n=10）

表2 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸mRNA表達水平的比較（±s，n=10）

注與對照組比較，aP＜0.05；與過表達miR-424-5p組比較，bP＜0.05；mTORC2：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2；Akt：蛋白激酶B；mTORC1：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1

組別RictormTORC2AktmTORC1對照組過表達miR-424-5p組干擾miR-424-5p表達組過表達Rictor組干擾Rictor表達組F值P值0.26±0.03 0.37±0.04a 0.48±0.05ab 0.59±0.06ab 0.32±0.04ab 84.951＜0.001 0.31±0.04 0.38±0.04a 0.52±0.05ab 0.63±0.07ab 0.34±0.04 74.713＜0.001 0.22±0.03 0.29±0.03a 0.42±0.04ab 0.58±0.06ab 0.25±0.03 139.684＜0.001 0.36±0.07 0.45±0.05a 0.56±0.06ab 0.72±0.08ab 0.41±0.04 54.079＜0.001

2.5 各組自噬標志蛋白表達水平的比較

過表達miR-424-5p組Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1表達水平最低，P62表達水平最高。過表達miR-424-5p組Lc3-Ⅱ、Beclin1水平低于對照組，P62水平高于對照組，干擾miR-424-5p組僅Lc3-Ⅱ高于對照組，過表達Rictor組Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1高于對照組，干擾Rictor組Lc3-Ⅱ水平低于對照組，而P62水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組的Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ水平高于過表達miR-424-5p組，干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組、干擾Rictor表達組的Beclin1高于過表達miR-424-5p組，而P62低于過表達miR-424-5p組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干擾miR-424-5p表達組、過表達Rictor組、干擾Rictor表達組的Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1、P62比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表3 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸蛋白表達水平的比較（±s，n=10）

表3 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸蛋白表達水平的比較（±s，n=10）

注與對照組比較，aP＜0.05；與過表達miR-424-5p組比較，bP＜0.05；mTORC2：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2；Akt：蛋白激酶B；mTORC1：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1

組別RictormTORC2AktmTORC1對照組過表達miR-424-5p組干擾miR-424-5p表達組過表達Rictor組干擾Rictor表達組F值P值0.16±0.02 0.29±0.03a 0.45±0.03ab 0.56±0.07ab 0.22±0.04ab 157.644＜0.001 0.25±0.02 0.41±0.05ab 0.49±0.05ab 0.58±0.06ab 0.34±0.03ab 82.980＜0.001 0.31±0.04 0.38±0.04a 0.46±0.05ab 0.58±0.06ab 0.32±0.04ab 57.798＜0.001 0.26±0.03 0.36±0.03a 0.46±0.05ab 0.52±0.06ab 0.33±0.04a 56.737＜0.001

表4 各組自噬標志蛋白表達水平的比較（±s，n=10）

表4 各組自噬標志蛋白表達水平的比較（±s，n=10）

注與對照組比較，aP＜0.05；與過表達miR-424-5p組比較，bP＜0.05

組別Lc3-ⅡLc3-ⅠBeclin1P62對照組過表達miR-424-5p組干擾miR-424-5p表達組過表達Rictor組干擾Rictor表達組F值P值0.20±0.02 0.14±0.02a 0.26±0.03ab 0.34±0.03ab 0.16±0.02a 110.001＜0.001 0.14±0.02 0.11±0.02 0.15±0.03b 0.21±0.03ab 0.13±0.04 16.905＜0.001 0.25±0.03 0.16±0.02a 0.28±0.03b 0.35±0.03ab 0.27±0.03b 58.375＜0.001 0.18±0.02 0.38±0.04a 0.21±0.03b 0.16±0.03b 0.33±0.04ab 87.685＜0.001

圖6 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信號軸蛋白表達水平（n=10）

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

miR-424-5p對Rictor的表達有直接抑制作用，Western blot結(jié)果顯示，對照組、過表達miR-424-5p組、干擾miR-424-5p組的Rictor相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.727，P＜0.05）；過表達miR-424-5p組Rictor相對表達水平低于對照組、干擾miR-424-5p組，干擾miR-424-5p組Rictor相對表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖7～8）。

圖7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（n=10）

3 討論

miRNA表達或功能異常介導(dǎo)肝癌發(fā)生發(fā)展[10-11]，miR-424-5p作為新型miRNA其抑癌作用在胃癌、胰腺癌等中已被證實[12-13]。但關(guān)于miR-424-5p的抑癌機制仍未完全明確。自噬自身水平?jīng)Q定了腫瘤細胞最終命運，溫和而輕微的保護性自噬可促進細胞存活，而激烈或長時間的致死性自噬可能導(dǎo)致細胞自噬性死亡[14]。葉明等[15]發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)胞質(zhì)性自噬體可導(dǎo)致肝癌細胞、肝細胞特殊性核溶解與細胞死亡，但目前miR-424-5p是否可誘導(dǎo)肝癌細胞自噬研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-424-5p會誘導(dǎo)肝癌細胞Hep-3B發(fā)生凋亡、G0+G1期占比較高、細胞活性低，而低表達miR-424-5p可能促進肝癌細胞Hep-3B發(fā)生增殖、G0+G1期比例高、細胞凋亡減少，提高細胞活性。miR-424-5p過表達可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，而miR-424-5p低表達發(fā)揮相反作用[16]。也有研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p可抑制ICC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，抑制其腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖8 干擾miR-424-5p組、過表達miR-424-5p組、對照組的Western blot結(jié)果

前期研究發(fā)現(xiàn)，mTORCl/2雙重抑制劑OSI-027可同時下調(diào)mTORCl和mTORC2底物磷酸化，雷帕霉素處理或沉默mTORCl基因會導(dǎo)致Akt（Ser473）磷酸化水平上調(diào)，此外mTORC2在維持肝癌細胞生物學(xué)特性方面具有重要作用，且其激活與Akt途徑活化有關(guān)。當(dāng)前有學(xué)者認為Rictor是定義mTORC2的核心成分[18-19]。Rictor可直接影響mTORC2組裝，使改變mTORC2活性，調(diào)控Akt（Ser473）磷酸化，影響細胞增殖、分化[20-21]。自噬有助于應(yīng)對缺氧、饑餓等刺激下細胞存活。在自噬信號網(wǎng)絡(luò)中，Rictor參與mTORC2組裝，mTORC2可調(diào)控Akt（Ser473）磷酸化，Akt再通過激活下游mTORC1途徑，最終調(diào)控細胞自噬。本研究結(jié)果表明，miR-424-5p可通過靶向Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1發(fā)揮抑癌作用，同時miR-424-5p可直接抑制Rictor的表達，與既往研究[22-23]相似。

Beclin1屬于編碼調(diào)節(jié)自噬的蛋白質(zhì)，在自噬中起核心作用[24-25]，而Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ為自噬小體膜上標記蛋白，P62則是Lc3-Ⅱ底物，可和Lc3-Ⅱ組成復(fù)合物，最終被自噬溶酶體降解[26]。本研究表明miR-424-5p可調(diào)節(jié)自噬水平而抑制肝癌細胞自噬，最終影響其發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-424-5p可通過調(diào)控Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1表達影響自噬，從而抑制肝癌細胞增殖，促進其凋亡。但這一機制僅為miR-424-5p的一個作用方面，關(guān)于其在肝癌細胞中的其他作用機制仍有待進一步研究。