徐甘霖，王文亮

深圳市兒童醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 深圳 518000

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多因素引發(fā)，以氣道高 反應(yīng)性和氣道慢性炎癥為特異性表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，好發(fā)于兒童群體。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兒童哮喘發(fā)病率隨環(huán)境的惡化逐年上升［1］。氣道慢性炎癥反應(yīng)引發(fā)的氣道結(jié)構(gòu)重塑，進(jìn)而使得氣道發(fā)生氣流阻塞被認(rèn)為是哮喘發(fā)生的重要病理過程［2］。磷脂酰肌醇3 激酶（P13K）蛋白激酶B（AKT）信號通路是參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞增值、凋亡的重要信號通路，P13K/AKT在哮喘氣道重塑病理發(fā)展中的作用已逐漸被證實(shí)，然而其具體調(diào)控機(jī)制仍尚未明確［3］。近來發(fā)現(xiàn)［4］，miRNA的表達(dá)與氣道變應(yīng)性炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，且與健康兒童比較，哮喘患兒外周血miRNA 水平明顯不同。miR-123 是最新發(fā)現(xiàn)的miRNA，可通過參與調(diào)控相關(guān)信號通路的表達(dá)，以促進(jìn)下游靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增值、侵襲［5］。然而其是否可通過調(diào)控P13K/AKT信號通路的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)哮喘患兒病情的發(fā)展仍尚未見系統(tǒng)報(bào)道。基于此背景，本研究以支氣管哮喘患兒為研究對象，探討miR-123 的表達(dá)變化與其病情的關(guān)系，旨在明確miR-123 對哮喘患兒病情的預(yù)測價(jià)值，以期為后續(xù)臨床早期的預(yù)測評估及靶向治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2020年12月深圳市兒童醫(yī)院收治的支氣管哮喘患兒50 例（研究組），同期選擇體檢健康兒童50例（對照組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年）》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。無嚴(yán)重先天性疾病，如先天性心臟病等。年齡4～12歲。無活動(dòng)期急慢性肺部疾病?；純杭覍僮栽负炇鹬橥鈺?。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并真菌感染等傳染性呼吸道疾病。合并先天性氣道疾病。合并免疫系統(tǒng)重癥疾病。心、肝、腎臟功能異常及重癥疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 血清指標(biāo)檢測 研究組入院后次日采用EDTA 抗凝管（濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司）采集空腹（8 h）外周靜脈血5 mL，采血時(shí)患兒均處于發(fā)病急性期，同期采集對照組受試者5 mL空腹外周靜脈血。隨后分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，引物設(shè)計(jì)參考王重植［7］。隨后滴入1 mL TRLzol（廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司），提取總RNA，試劑盒購置于：上海雙贏生物科技有限公司。miR-123、P13K、AKT mRNA 的表達(dá)嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組受試者白細(xì)胞介素4（IL-4）和干擾素-γ（IFN-γ）表達(dá)情況，試劑盒購置于上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司。

1.2.2 兩組受試者肺功能檢查 采用肺功能檢查儀進(jìn)行肺功能相關(guān)指標(biāo)檢查，包括呼氣峰流量（PEF）、第1 秒用力呼氣量（FEV1）和肺活量（VC），儀器購置于濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組受試者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA表達(dá)、IL-4和IFN及肺功能情況。采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。采用多元線性回歸及l(fā)ogistics回歸模型進(jìn)行回歸分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般資料情況

兩組受試者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組受試者一般資料情況（±s） 例（%）

表1 兩組受試者一般資料情況（±s） 例（%）

維度性別（images/BZ_30_1428_385_1450_428.png±s，男/女）年齡（images/BZ_30_1428_385_1450_428.png±s，歲）對照組（n=50）75/25 6.78±1.27研究組（n=20）88/32 6.57±1.31 t/χ2值0.08 1.23 P值0.78 0.22

2.2 兩組受試者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA 表達(dá)、血清IL-4和IFN-γ及肺功能情況

研究組miR-123、P13K、AKT mRNA、IL-4 均顯著高于對照組，而IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA表達(dá)、血清IL-4和IFN-γ及肺功能情況（±s）

表2 兩組受試者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA表達(dá)、血清IL-4和IFN-γ及肺功能情況（±s）

組別研究組（n=50）對照組（n=50）t值P值組別研究組（n=50）對照組（n=50）t值P值miR-123 mRNA 2.71±0.65 1.21±0.31 22.41 0 IFN-γ（ng/mL）49.67±13.22 86.71 ±15.71 18.7 0 PI3K mRNA 2.57±0.57 1.32±0.27 21.32 0 IL-4（ng/mL）176.72±12.15 76.75 ±16.21 50.89 0 AKT mRNA 2.67±0.43 1.37±0.22 28.89 0 FEV1（mL）520.34±96.75 967.63±32.47 47.53 0 PEF（L/s）2.17±0.48 3.81±0.72 19.45 0 VC（L）2.30±0.41 3.52±0.62 16.85 0

2.3 miR-123 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

miR-123 mRNA 的表達(dá)與P13K、AKT、IL-4呈顯著正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與IFN-γ、PEF、FEV1和VC呈顯著負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 miR-123 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 miR-123 mRNA表達(dá)的多元線性回歸分析結(jié)果

以miR-123 mRNA 的表達(dá)為因變量納入多元線性回歸模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P13K、AKT、IL-4、IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 為影響其表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 miR-123 mRNA表達(dá)的多元線性回歸分析結(jié)果

2.5 支氣管哮喘發(fā)病的logistics回歸分析結(jié)果

以支氣管哮喘患兒病情為因變量納入logistics 回歸模型，單因素分析結(jié)果顯示，miR-123、IFN-γ、IL-4、AKT、P13K和肺功能為影響患兒病情的危險(xiǎn)因素、多因素結(jié)果顯示，miR-123、IFN-γ、IL-4、AKT、P13K和肺功能為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 支氣管哮喘發(fā)病的logistics回歸分析結(jié)果

3 討論

氣道重塑是機(jī)體受損的修復(fù)機(jī)制，由中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等參與發(fā)生，其特征表現(xiàn)為平滑肌增生肥大、上皮下纖維化和上皮脫離等［8］。近來研究證實(shí)［9］，非致死性哮喘氣道壁厚度顯著低于致命性哮喘患者。炎癥因子的過度表達(dá)是這一過程發(fā)生、發(fā)展的重要誘因之一，而T 細(xì)胞（Th）的過度活化和增值與氣道慢性炎癥的持續(xù)激活密切相關(guān)。IFN-γ、IL-4 分別由Th1 和Th2 分泌，Th1 通過分泌IFN-γ 對Th2 性細(xì)胞因子IL-4 發(fā)揮拮抗作用，以維持機(jī)體Th1/Th2 平衡［10］。然而顧紅丹等［11］證實(shí)，哮喘患兒Th1/Th2 平衡顯著失衡，且IFN-γ 的表達(dá)明顯降低，而IL-4 的表達(dá)明顯上調(diào)。本次實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，與對照組兒童相比，研究組患兒血清IL-4表達(dá)明顯更高，而IFN-γ的表達(dá)明顯更低，表明T細(xì)胞的表達(dá)紊亂在哮喘發(fā)生的基礎(chǔ)病理中扮演著尤為重要的角色。故進(jìn)一步探討并明確哮喘患兒T細(xì)胞紊亂表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制，對疾病的早期評估預(yù)防和靶向治療均意義重大。

P13K是酪氮酸相關(guān)激酶，涉及細(xì)胞從生長到凋亡的廣泛反應(yīng)，與早期T 細(xì)胞活化密切相關(guān)［12］。研究證實(shí)［13］，P13K是激活CD3+活化Th2細(xì)胞表達(dá)的關(guān)鍵上游分子，其具有三類，其中I類又可分為a和b兩種亞型。p110催化亞基和p85調(diào)節(jié)亞基在正常機(jī)體中通過相互作用以抑制P13K的表達(dá)活性，當(dāng)上游信號被激活，如感染、炎癥和細(xì)胞因子等刺激，二者相互作用被解除致使P13K活化表達(dá)。重要的是在這一過程中，ART 作為調(diào)控細(xì)胞凋亡和存活的重要因子亦被磷酸化和募集，并通過介導(dǎo)下游炎癥因子的表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步活化激活［14］。潘凌宇等［15］報(bào)道提示，P13K/PKB信號通路的異常激活是導(dǎo)致哮喘發(fā)生、發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)。常興等［16］報(bào)道顯示，P13K 信號通路的異常激活與支氣管哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，并且報(bào)道指出，以P13K信號通路的相關(guān)調(diào)控機(jī)制作為靶點(diǎn)進(jìn)行靶向藥物的研究對哮喘的早期治療十分重要。劉楠等［17］證實(shí)，和厚樸酚可通過抑制P13K/ART 信號通路的表達(dá)，進(jìn)而抑制OVA 致哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研究組患兒外周血P13K和Akt mRNA表達(dá)均顯著高于對照組，提示在支氣管哮喘患兒病發(fā)的基礎(chǔ)病理環(huán)節(jié)中P13K/ART信號通路的異常激活發(fā)揮著重要作用?？紤]慢性炎癥的持續(xù)激活被證實(shí)是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的重要病理機(jī)制，而上游P13K/ART信號通路作為T細(xì)胞活化的重要調(diào)節(jié)信號，其信號被異常激活可引發(fā)下游炎癥因子的表達(dá)上調(diào)。值得一提的是，近年來多項(xiàng)研究證實(shí)，在哮喘患兒痰液中存在明顯的miRNA異常表達(dá)。吳媛媛等［18］證實(shí)，miRNA的差異化表達(dá)可為哮喘小鼠的治療通過新靶點(diǎn)。黃青華等［19］研究證實(shí)，miRNA-19a可通過靶向調(diào)節(jié)P13K/ART的表達(dá)從而促進(jìn)哮喘大鼠的病情發(fā)展。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研究組患兒外周血mi-123 mRNA 表達(dá)水平顯著高于對照組，證實(shí)miR-123 mRNA 的異常激活可能是哮喘患兒病發(fā)的新靶點(diǎn)。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒外周血miR-123 的表達(dá)與P13K、AKT、IL-4、IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 顯著相關(guān)，提示miR-123可能通過靶向調(diào)控P13K/Akt 信號通路的表達(dá)進(jìn)而對下游T細(xì)胞因子的分泌產(chǎn)生影響，進(jìn)而促進(jìn)患兒肺功能降低。多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，P13K、AKT、IL-4、IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 的改變是影響miR-123 表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，考慮哮喘患兒肺功能的持續(xù)惡化與慢性炎癥的持續(xù)激活和炎癥水平的上升密切相關(guān)，而IL-4 和IFN-γ 是T 細(xì)胞重要的細(xì)胞因子可反映機(jī)體T細(xì)胞活化狀態(tài)和炎癥反應(yīng)水平，而P13K/AKT 信號通路是調(diào)控IL-4和IFN-γ的重要上游信號，前者的表達(dá)異常有效促進(jìn)了IL-4和IFN-γ的活化表達(dá)，而miR-123 似乎在這一反應(yīng)中扮演了始動(dòng)因素的角色，當(dāng)患兒機(jī)體受到刺激后，miR-123 的表達(dá)上調(diào)，并通過激活下游相關(guān)反應(yīng)進(jìn)而參與哮喘病情的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步明確miR-123-P13K/AKT 信號通路的價(jià)值，研究者以哮喘患兒病情為因變量納入logistics 回歸分析，多因素分析結(jié)果顯示，肺功能、miR-123、P13K和AKT為影響其病情的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，明確了臨床可通過早期監(jiān)控患兒外周血miR-123表達(dá)情況對其病情發(fā)展做出預(yù)測評估，亦為后續(xù)哮喘患兒的靶向治療提供了新思路。

綜上所述，支氣管哮喘患兒外周血miR-123-P13K/AKT 信號通路呈異常表達(dá)，可作為預(yù)測評估患兒病情的可靠血清標(biāo)志物。然而本次實(shí)驗(yàn)尚存不足，即本次實(shí)驗(yàn)為臨床研究，未對相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探究，故而需進(jìn)一步設(shè)置動(dòng)物實(shí)驗(yàn)予以論證。