羅卓雅，譚宏淵，謝佳琳，田帝，胡婷，吳鵬

（黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）系多孔菌科真菌茯苓，被譽為中藥“四君八珍”之一，為國家藥食同源中藥材品種[1]。茯苓多糖是茯苓菌核中占比較高的生物活性成分[2]。國內(nèi)外研究表明茯苓多糖具有多種功能特性[3-6]，如增強細(xì)胞免疫反應(yīng)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[7-10]，其在食品加工及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛。

目前，提取茯苓多糖的方法有很多，如復(fù)合酶法[11]、微波輔助提取法[12]、熱水浸提法[13]等。復(fù)合酶法提取茯苓多糖，雖然效果好，但對酶解條件要求較高；微波輔助法提取茯苓多糖，提取率高，但溫度和時間都需要精準(zhǔn)控制；熱水浸提法提取茯苓多糖，提取時間長且提取率較低。本試驗利用堿液提取茯苓多糖，并采用傅里葉紅外光譜和紫外可見分光光譜對堿溶性茯苓多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，再以VC為對照，對其體外抗氧化能力進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九資河茯苓：市售；氫氧化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；乙二胺四乙酸、維生素C（VC）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、水楊酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機（DFT-200C）、真空冷凍干燥機（FDU-1200）：上海比朗儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：金壇市順華儀器有限公司；臺式高速離心機（TG16-WS）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2600）：島津儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet-6700）：美國熱電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿溶性茯苓多糖的提取

1.3.1.1 茯苓粉制備

將茯苓塊洗凈烘干12 h后，用高速萬能粉碎機粉碎，過60目篩，即得茯苓粉。

1.3.1.2 堿液浸提

將濃度為0.6 mol/L的NaOH溶液與茯苓粉按照50∶1（mL/g）的液料比在 4 ℃恒溫水浴鍋中浸提 1 h[14]。堿液浸提結(jié)束后，取上清液，配制0.5 mol/L的鹽酸對其進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)pH值為7，避免多糖在堿性條件下發(fā)生水解。

1.3.1.3 離心

中和后的多糖提取液在8 000 r/min條件下離心10 min，去除上清液，得到多糖沉淀。

1.3.1.4 真空冷凍干燥

采用真空冷凍干燥機，在-60℃～-50℃條件下將多糖沉淀真空冷凍12 h，即得堿溶性茯苓多糖。

1.3.2 傅里葉紅外光譜分析

利用傅里葉紅外光譜儀，在400 cm-1～4 000 cm-1波數(shù)下采用KBr壓片法對堿溶性茯苓多糖樣品進(jìn)行掃描分析[15]。

1.3.3 紫外可見分光光譜分析

利用紫外可見分光光度計，通過固體樣品掃描法對堿溶性茯苓多糖樣品進(jìn)行掃描[16]，掃描波長為190 nm～600 nm。

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 還原能力的測定

在5支試管中分別加入2.5 mL不同濃度的多糖樣品溶液[17]、2.5 mL pH6.6磷酸鹽緩沖溶液，混勻后，加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，搖勻后于50℃水浴20min。加入2.5mL的10%三氯乙酸溶液，于3000r/min離心10 min后，取上清液5 mL，分別添加5 mL蒸餾水和1 mL的0.1%三氯化鐵溶液，于700 nm測定吸光度A[18]。以蒸餾水替代樣品溶液作為空白組，于700 nm測定吸光度A0，每個樣品平行測定3次，取平均值，以VC為對照。還原能力（ΔA）計算公式如下。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定

在5支試管中分別加入不同濃度多糖樣品溶液2.5 mL，再加入2 mL的0.15 mmol/L DPPH-乙醇溶液[19]，搖勻后靜置30 min，測定其吸光度（AX）；以2 mL無水乙醇代替樣品溶液后測定其吸光度（A0）；取等濃度的樣品溶液與相等體積無水乙醇混合，測定其吸光度（AX0）。試驗平行測定3次，取平均值，以VC為對照。DPPH自由基清除率計算公式[20]如下。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

在5支試管中分別加入2.5 mL不同濃度多糖樣品溶液，再加入5.7 mL的100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）[21]，置于25℃水浴鍋中恒溫水浴10 min。然后加入25℃預(yù)熱好的6 mmol/L鄰苯三酚溶液0.1 mL，搖勻后，在320 nm處測定其反應(yīng)1 min時的吸光度（A）[22-23]。再取第6支試管用0.2 mL蒸餾水代替0.2 mL樣品溶液作為空白組，其余試劑不變，于320 nm處測定其反應(yīng)1 min時的吸光度（A0）。超氧陰離子自由基清除計算公式如下。

1.3.4.4 羥基自由基清除能力測定

在5支試管中依次加入1.5mL的0.75mmol/L鄰二氮菲試劑[24]、3 mL pH7.4的150 mmol/L磷酸緩沖液[25]、1.0 mL的0.75 mmol/L FeSO4試劑，迅速混勻，再分別加入3 mL不同濃度的多糖樣品溶液，1 mL 0.01%的H2O2溶液，用蒸餾水定容至10 mL，水浴溫度設(shè)置為37 ℃，加熱 1 h，在 510 nm 處測定其吸光度（AX）[26]。在1支試管中不添加FeSO4試劑和H2O2溶液，其余步驟均相同，在510 nm處測定其吸光度（A1）。在另一只試管中添加H2O2溶液，不加FeSO4試劑，其余步驟均相同，在510 nm處測定其吸光度（A0）。

羥基自由基清除率計算公式如下[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019軟件進(jìn)行處理，并采用SPSS20.0進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)，用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜掃描分析

堿溶性茯苓多糖紅外光譜掃描圖譜見圖1。

由圖1可知，3 419 cm-1處強且寬的吸收峰為O—H與C—H的伸縮振動，為糖類物質(zhì)的特征吸收峰；在2890cm-1處為C—H的伸縮振動吸收峰、1640cm-1處為CO的伸縮振動吸收峰；在1 372 cm-1處為C（CH3）2面內(nèi)彎曲振動吸收峰、1 162 cm-1處為C—O面內(nèi)彎曲振動吸收峰；1 078 cm-1和1 039 cm-1處均為C—O—C的伸縮振動吸收峰；890 cm-1處的吸收峰為C—H面外彎曲振動。由此表明提取得到的堿溶性茯苓多糖樣品是β型多糖。

2.2 紫外可見分光光譜掃描分析

堿溶性茯苓多糖紫外可見吸收光譜見圖2。

由圖2可知，提取的堿溶性茯苓多糖在波長約230 nm處有典型的糖類物質(zhì)特征吸收峰，且僅有一個特征吸收峰，而研究表明核酸和蛋白質(zhì)的紫外吸收圖譜中均無此特征吸收峰[28]，進(jìn)一步說明此多糖為均一組分。

2.3 還原能力測定

試驗以VC作為參照，采用鐵氰化鉀還原法考察堿溶性茯苓多糖的還原能力，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，堿溶性茯苓多糖和VC的還原能力均隨著濃度的增加逐步增大。濃度為0.2 g/L～0.4 g/L時，VC的還原能力高于堿溶性茯苓多糖，當(dāng)濃度到達(dá)一定值（0.6 g/L）后，VC的還原能力低于堿溶性茯苓多糖。當(dāng)濃度為1.0 g/L時，堿溶性茯苓多糖達(dá)到本試驗所設(shè)濃度梯度范圍內(nèi)的最大還原能力。

2.4 DPPH自由基清除能力

堿溶性茯苓多糖及VC的DPPH自由基清除能力見圖4。

由圖4可知，堿溶性茯苓多糖的DPPH自由基清除率高于VC。濃度為0.2 g/L～0.8 g/L時，DPPH自由基清除率隨濃度增加而升高，濃度為0.8 g/L～1.0 g/L時DPPH自由基清除率隨濃度增加緩慢下降。當(dāng)濃度為0.8 g/L時，堿溶性茯苓多糖的DPPH自由基清除率最大，為61.21%，說明堿溶性茯苓多糖有較好的DPPH自由基清除能力。

2.5 超氧陰離子自由基清除能力

堿溶性茯苓多糖及VC的超氧陰離子自由基清除能力見圖5。

由圖5可知，堿溶性茯苓多糖清除超氧陰離子自由基的能力隨濃度增大呈上升趨勢，張培等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)茯苓多糖的超氧陰離子自由基清除率與其濃度呈正相關(guān)。在所選試驗濃度范圍內(nèi)，堿溶性茯苓多糖超氧陰離子自由基清除率隨濃度增加快速升高，但均低于VC，在濃度為1.0 g/L時，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到最大值，為63.27%。

2.6 羥基自由基清除能力

堿溶性茯苓多糖及VC對羥基自由基的清除能力見圖6。

由圖6可知，堿溶性茯苓多糖的羥基自由基清除率隨著濃度的增加逐漸上升，但增長較緩慢。堿溶性茯苓多糖的羥基自由基清除率略低于VC。在濃度為1.0 g/L時，堿溶性茯苓多糖的羥基自由基清除率達(dá)到最大值，為62.32%，可見堿溶性茯苓多糖對羥基自由基有較好的清除能力。

3 結(jié)論

本試驗采用堿法提取九資河茯苓多糖，得到的堿溶性茯苓多糖為β型多糖。通過測定其還原能力和對3種不同體系自由基的清除率，研究了堿溶性茯苓多糖的體外抗氧化活性。試驗結(jié)果表明，九資河堿溶性茯苓多糖抗氧化能力較強，且在考察濃度范圍內(nèi)，隨著堿溶性茯苓多糖的濃度增加，其還原能力逐步增強。雖然在超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力試驗中，堿溶性茯苓多糖的超氧陰離子自由基和羥基自由基清除率均略低于VC，但仍具有一定的自由基清除能力。本試驗為九資河堿溶性茯苓多糖的提取和應(yīng)用提供了新思路，為九資河茯苓的深加工提供參考。