張 晰， 段明玥， 于 壯， 魏孟姣， 張艷敏

（1.西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 610113）

家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H）是一種常染色體單基因顯性遺傳代謝性疾病，編碼低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）的LDLR基因是最常見(jiàn)的致病基因，LDLR基因突變可致細(xì)胞膜表面的LDLR缺失或功能異常，影響機(jī)體低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）的代謝，導(dǎo)致膽固醇代謝障礙，最終使血清低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平升高[1-2]。根據(jù)基因型，F(xiàn)H可分為雜合型家族性高膽固醇血癥（heterozygous familial hypercholesterolemia，HeFH）和純合型家族性高膽固醇血癥（homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH）。HeFH攜帶1個(gè)致病等位基因，HoFH攜帶2個(gè)致病等位基因。HoFH較為罕見(jiàn)，患病率為1/100萬(wàn)～3/100萬(wàn)，HeFH患病率為0.20%～0.48%[1]。我國(guó)人群FH患病率為0.18%[2]。HoFH患兒的LDL-C水平是正常兒童的6～10倍，皮膚肌腱黃色瘤及早發(fā)冠心?。╟oronary heart disease，CHD）風(fēng)險(xiǎn)增加等是HoFH典型的臨床特征；如未經(jīng)治療，HoFH患兒青少年期即可發(fā)生CHD，在30歲之前就可能因心肌梗死而死亡，甚至有發(fā)生猝死的風(fēng)險(xiǎn)[3]。本研究擬分析1個(gè)FH家系LDLR基因突變及外周血單核細(xì)胞表面LDLR的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年10月西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院確診的1例LDLRE140K突變致HoFH先證者及其家系成員共5例。HoFH診斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲動(dòng)脈粥樣硬化協(xié)會(huì)（European Atherosclerosis Society，EAS）2014年發(fā)布的HoFH管理指南[4]。臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：治療前LDL-C＞13 mmol/L或治療后LDL-C＞8 mmol/L，且10歲之前出現(xiàn)皮膚或肌腱黃色瘤或父母LDL-C水平與雜合型FH一致。先證者基因診斷結(jié)果為L(zhǎng)DLR基因純合突變c.418G＞A（p.E140K）[5]?；蛟\斷標(biāo)準(zhǔn)：LDLR、APOB、PCSK9和LDLRAP1基因檢測(cè)到明確的2個(gè)突變位點(diǎn)。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集先證者及其家系成員臨床資料，包括病史和體格檢查、生化檢測(cè)（血脂、心肌酶、肝腎功等測(cè)定）、心電檢查結(jié)果和超聲心動(dòng)檢查結(jié)果等。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)的檢測(cè) 采集所有對(duì)象外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。取1 mL置于流式上樣管中，加入紅細(xì)胞裂解液（自配），溶血15 min，然后670×g離心5 min，棄上清，向底部的白細(xì)胞層加入磷酸鹽緩沖液（ phosphate-buffered saline，PBS），充分混勻，制備成白細(xì)胞懸液。在白細(xì)胞懸液中加入CD45-PerCP抗體、CD14-FITC抗體（美國(guó)Novus Biologicals公司）和LDLR-APC抗體（美國(guó)BD公司），標(biāo)記有核細(xì)胞，渦旋混勻，室溫避光孵育15 min ，加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞，670 ×g離心5 min，棄上清，最后加入500 μL PBS，渦旋混勻，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)。使用Cellquest軟件（美國(guó)BD公司）進(jìn)行分析，以設(shè)邏輯門的方法在CD45/SSC散點(diǎn)圖中根據(jù)CD14表達(dá)強(qiáng)弱的不同，設(shè)門圈出單核細(xì)胞，每個(gè)樣本設(shè)同型對(duì)照，并采集10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[6]，用平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）單核細(xì)胞LDLR表達(dá)水平表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SigmaStat 3.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同家系成員之間各項(xiàng)目的比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估LDLR與血脂項(xiàng)目之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 先證者及其家系成員的臨床表型分析

先證者（HoFH患兒）TC和LDL-C水平較高，臨床表型重，確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)心血管損傷，頸部超聲提示雙側(cè)頸動(dòng)脈及升主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚并粥樣硬化，心臟彩超提示主動(dòng)脈瓣增厚、鈣化，并出現(xiàn)主動(dòng)脈關(guān)閉不全表現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)可見(jiàn)黃色瘤。先證者父母均為HeFH患者（攜帶雜合突變），TC和LDL-C水平均高于與未攜帶突變（野生型）的家系成員（先證者大姨）（P＜0.05）。先證者父親出現(xiàn)角膜環(huán)，雙側(cè)頸動(dòng)脈硬化，有斑塊形成；先證者母親尚未發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病表型。見(jiàn)表1。

表1 先證者及其家系成員基因型和血脂水平、臨床表型信息

2.2 先證者及其家系成員單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)

先證者（LDLRE140K純合型）、先證者父母（LDLRE140K雜合型）及先證者大姨（野生型）單核細(xì)胞表面LDLR的MFI分別為68.75、126.82、147.6、437.56。見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 先證者及其家系成員單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)散點(diǎn)圖

圖2 先證者及其家系成員單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)峰圖

圖3 先證者及其家系成員單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)

2.3 先證者及其家系成員單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)與TC、LDL-C的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在LDLRE140K基因突變家系成員中，外周血單核細(xì)胞表面LDLR水平與TC、LDL-C均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.682、-0.664，P＜0.05）。

3 討論

FH是一種常染色體顯性遺傳性疾病，主要臨床表現(xiàn)為L(zhǎng)DL-C水平明顯增高、皮膚黃色瘤及早發(fā)CHD，可分為HoFH和HeFH 2種類型。目前，由于臨床對(duì)FH認(rèn)識(shí)不足，其診斷率較低，尤其是兒童HF的管理仍處于探索階段[1]。日本動(dòng)脈粥樣硬化學(xué)會(huì)聯(lián)合工作組發(fā)布的兒童FH指南[7]指出，早期診斷和早期干預(yù)可更好地改善FH患兒的預(yù)后。

本研究檢測(cè)了1例LDLRE140K純合突變的HoFH患兒及其家系成員的外周血單核細(xì)胞表面LDLR表達(dá)水平，結(jié)果顯示，單核細(xì)胞表面LDLR的MFI呈LDLRE140K純合型＜LDLRE140K雜合型＜野生型的趨勢(shì)，提示HoFH患兒LDLR表達(dá)量顯著降低，LDLRE140K變異對(duì)其攜帶者單核細(xì)胞表面LDLR的表達(dá)有顯著的抑制作用，且純合型的抑制作用強(qiáng)于雜合型。FH的致病基因主要包括LDLR、APOB和PCSK9，致病基因通過(guò)影響LDLR的表達(dá)、結(jié)構(gòu)或功能造成機(jī)體膽固醇代謝障礙，最終導(dǎo)致FH[8-9]。LDLR是一類由高爾基體加工后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，功能是介導(dǎo)LDL的攝取，參與LDL代謝過(guò)程，并通過(guò)LDL循環(huán)調(diào)控機(jī)制保證機(jī)體膽固醇水平的動(dòng)態(tài)平衡[10-11]。在所有FH的致病基因中，LDLR基因的突變頻率最高，占總突變頻率的90%以上[12-13]。在高膽固醇血癥患者中可檢出不同的LDLR基因變異[14-16]，但LDLR基因變異對(duì)攜帶者細(xì)胞表面LDLR表達(dá)的影響的相關(guān)研究較少。RODRíGUEZ-JIMéNEZ等[17]的研究結(jié)果顯示，LDLR基因變異可導(dǎo)致LDLR表達(dá)和活性降低。LDLR基因?qū)DLR的影響主要體現(xiàn)在表達(dá)量和內(nèi)化活性功能2個(gè)方面[18-19]。本研究結(jié)果顯示，LDLRE140K突變可影響LDLR的表達(dá)量，即通過(guò)下調(diào)細(xì)胞表面LDLR的表達(dá)引發(fā)FH。后續(xù)將研究LDLRE140K突變對(duì)LDLR功能的影響。

本研究結(jié)果顯示，先證者（LDLRE140K純合突變）、先證者父母（LDLRE140K雜合突變）、先證者大姨（野生型）外周血單核細(xì)胞LDLR表達(dá)量依次升高，血清LDL-C及TC水平依次降低；先證者的臨床癥狀最重，先證者父親的臨床癥狀相對(duì)較輕。提示LDLRE140K突變明顯下調(diào)了單核細(xì)胞表面LDLR的表達(dá)，且下調(diào)程度與基因型有關(guān)。有研究結(jié)果顯示，LDLR缺乏引起的動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白譜可被視為動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，HoFH患者淋巴細(xì)胞表面LDLR表達(dá)量與血清LDL-C、載脂蛋白B水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.700、-0.667，P＜0.01），LDLR的殘留表達(dá)是LDL-C水平的主要決定因素[19-20]。在難以治療的FH患者中，通過(guò)中和抗體等方式增強(qiáng)LDLR表達(dá)可顯著降低血脂水平，有助于改善FH患者的心血管狀況。因此，檢測(cè)外周血單核細(xì)胞表面LDLR水平可為FH患者的血脂評(píng)價(jià)與管理提供重要參考。

綜上所述，LDLRE140K突變可下調(diào)FH患者LDLR的表達(dá)，且下調(diào)程度與基因型有關(guān)。檢測(cè)LDLR基因突變及外周血單核細(xì)胞LDLR的表達(dá)有助于FH的早診早治，減少FH患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生。