李名武， 王勤志， 孫法瑞

（鄂東醫(yī)療集團市 黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，湖北 黃石 435000）

骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年人群，隨著治療方法的不斷改進，患者生存率有所提高[1]，但由于骨肉瘤的侵襲性強、復(fù)發(fā)率高、易早期發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移，使得患者總體預(yù)后仍然較差[2]。黏蛋白16（mucin 16，MUC16）是黏蛋白家族成員，在上皮保護和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，與信號通路傳導(dǎo)調(diào)控及免疫應(yīng)答關(guān)系密切[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，MUC16參與了卵巢癌[4]、膽囊癌[5]、子宮內(nèi)膜癌[6]、肺癌[7]等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。然而，關(guān)于MUC16與骨肉瘤關(guān)系的研究較少。為此，本研究擬探討MUC16對人骨肉瘤細胞系U2OS增殖和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

人骨肉瘤細胞系U2OS購自上海通派生物科技有限公司，McCoy's 5A培養(yǎng)液購自上海研生生物技術(shù)科技有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司。MUC16干擾序列和對照序列由上海美軒生物科技有限公司設(shè)計合成。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Trizol提取試劑均購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，MUC16和內(nèi)參引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自上?？迫A生物工程股份有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京博潤萊特科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司。兔抗人MUC16單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗人上皮型鈣黏蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）多克隆抗體、兔抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白（neuropathic-cadherin，N-Cad）單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。StepOne實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，DP-6100型酶標儀購自北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)U2OS細胞。培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化，接種于6孔板，密度為2.5×106/孔，待細胞融合度為80%以上時，按Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書對細胞進行分組轉(zhuǎn)染。（1）sh-MUC16組：轉(zhuǎn)染MUC16干擾序列sh-1（5'-ACAGCAGCATCAAGAGTTATT-3'）、si-2（5'-GGAGCAAGTCTTTCTAGATAA-3'）；（2）sh-Control組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列（5'-GGAATCTCATTCGATGCATAC-3'）；（3）空白組：不作任何處理。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測MUC16 mRNA表達 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細胞，胰蛋白酶消化，加入細胞裂解液，采用Trizol提取試劑提取總RNA，采用UV-1801紫外/可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）檢測純度和濃度，以吸光度（A）260nm/A280nm比值＞1.80為合格。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模板進行擴增。PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，36個循環(huán)；74 ℃延長3 min。每份樣本設(shè)6個復(fù)孔。MUC16上游引物為5'-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA- 3'，下游引物為5'-ACCAGTGGGCATTCCAGAAAGAGA-3'；β-actin上游引物為5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3'，下游引物為5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3'。采用2-ΔΔCt法計算MUC16 mRNA相對表達量。

1.2.3 U2OS細胞增殖活性檢測 采用MTT法檢測U2OS細胞增殖活性。取各組U2OS細胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板，密度為5 000個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12、24、48、72和96 h時每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，充分振蕩5 min，使結(jié)晶充分溶解后，采用DP-6100型酶標儀測定各孔490 nm波長處的A值。重復(fù)3次。

1.2.4 細胞遷移實驗 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細胞，胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，離心取沉淀，用不含血清的培養(yǎng)液重懸，取200 μL（約1×105個細胞）置于Transwell小室的上室，下室加入含血清的完全培養(yǎng)液600 μL，培養(yǎng)24 h，去除散落細胞，用甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用CKX53型顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）觀察，隨機取5個高倍鏡視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.2.5 細胞侵襲實驗 取基質(zhì)膠50 μL，稀釋后均勻涂抹在Transwell小室上室，過夜風干備用。其他實驗步驟同“細胞遷移實驗”。

1.2.6 U2OS細胞MUC16、E-Cad和N-Cad表達 采用免疫印跡法檢測U2OS細胞的蛋白表達。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細胞，胰蛋白酶消化，收集U2OS細胞并置于裂解液中，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量測定。取50 μg總蛋白，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入兔抗人MUC16單克隆抗體（1∶500稀釋）、兔抗人E-Cad多克隆抗體（1∶1 000稀釋）、兔抗人N-Cad單克隆抗體（1∶800稀釋），4 ℃過夜孵育，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液沖洗3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗（青島捷世康生物科技有限公司），室溫孵育120 min，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J圖像分析軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）進行分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參蛋白，計算MUC16、E-Cad和N-Cad的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組MUC16 mRNA表達比較

sh-MUC16組、sh-Control組和空白組之間MUC16 mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=106.005，P＜0.001）。sh-MUC16組MUC16 mRNA相對表達量（0.33±0.09）顯著低于sh-Control組（1.03±0.12）和空白組（1.00±0.07）（P＜0.05），而sh-Control組與空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細胞增殖活性比較

sh-MUC16組培養(yǎng)24、48、72和96 h細胞增殖活性（A值）低于sh-Control組和空白組（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組培養(yǎng)不同時間細胞增殖活性（A值）比較

圖1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組培養(yǎng)不同時間細胞增殖活性（A值）比較

2.3 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細胞遷移和侵襲能力比較

sh-MUC16組遷移和侵襲細胞數(shù)均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05）。見表2、圖2和圖3。

表2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)比較

圖2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細胞遷移情況（×200）

圖3 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細胞侵襲情況（×200）

2.4 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組MUC16、E-Cad和N-Cad表達比較

sh-MUC16組MUC16和N-Cad相對表達量均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），E-Cad相對表達量高于sh-Control組和空白組（P＜0.05）。sh-Control組與空白組之間MUC16、E-Cad和N-cad相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖4。

表3 3個組MUC16、E-Cad和N-Cad相對表達量比較

圖4 3個組MUC16、E-Cad和N-Cad表達免疫印跡圖

3 討論

骨肉瘤是一種起源于間充質(zhì)細胞的惡性腫瘤，臨床目前以手術(shù)切除輔以化療的綜合治療方案為主，但復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子生物學(xué)角度尋找與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的敏感基因，為腫瘤的早期診療及改善預(yù)后提供了新的方向。

黏蛋白作為一種高相對分子質(zhì)量、高度糖基化的蛋白，參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展，且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[9]。MUC16蛋白是黏蛋白家族中最大的一種，定位于人染色體19p13.2，其陽性表達可促進膽囊癌的發(fā)生，與膽囊癌的惡性程度和浸潤程度密切相關(guān)，可作為膽囊癌的標志物[10]。另外，MUC16還與多種腫瘤相關(guān)，可促進肺腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[11]，也可作為卵巢癌重要的免疫治療靶基因[12]。本研究通過轉(zhuǎn)染干擾序列的方法特異性沉默U2OS細胞中MUC16基因的表達。結(jié)果顯示，sh-MUC16組MUC16 mRNA和蛋白表達量均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說明sh-MUC16組MUC16表達被成功抑制。有研究結(jié)果顯示，MUC16過表達可賦予上皮來源的腫瘤細胞抗凋亡的能力[13]。本研究結(jié)果顯示，sh-MUC16組培養(yǎng)24、48、72和96 h細胞增殖活性低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說明沉默U2OS細胞的MUC16基因表達可抑制細胞增殖活性，提示MUC16可能參與了骨肉瘤細胞的增殖過程。KANWAL等[14]發(fā)現(xiàn)，MUC16基因過表達可促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，sh-MUC16組遷移和侵襲細胞數(shù)均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說明沉默U2OS細胞中的MUC16基因表達可抑制細胞遷移和侵襲，提示MUC16與骨肉瘤細胞遷移和侵襲有關(guān)。

目前，關(guān)于MUC16參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制研究較多。SHEN等[15]的研究結(jié)果顯示，MUC16通過Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化介導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2表達增強了宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力。李新等[16]的研究結(jié)果表明，MUC16通過磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路調(diào)節(jié)膽囊癌細胞的增殖和遷移。MUC16的C'端通過與β-連環(huán)蛋白的相互作用激活Wnt信號通路，促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在骨肉瘤細胞的增殖、侵襲中發(fā)揮了重要作用[18]，而在這個過程中，上皮標志物E-Cad表達減少，間充質(zhì)標志物N-Cad表達增多，從而使骨肉瘤細胞的遷移能力更強[19]。本研究結(jié)果顯示，sh-MUC16組N-Cad相對表達量低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），而E-Cad相對表達量高于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說明沉默U2OS細胞中的MUC16基因表達可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究尚有不足之處：（1）未設(shè)計干擾后恢復(fù)表達的實驗；（2）僅選用了1株細胞，未用第2株骨肉瘤細胞進行驗證；（3）未深入探討MUC16的具體作用過程及涉及的信號通路。下一階段將開展多株骨肉瘤細胞的研究，同時對可能涉及的機制開展進一步的驗證性研究。

綜上所述，沉默U2OS細胞中的MUC16基因表達可抑制細胞增殖活性，減少細胞遷移和侵襲，其機制可能與抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。