張亞茹， 凌麗燕， 陳 敏

（1.平湖市第二人民醫(yī)院檢驗科，浙江 平湖 314201；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，上海 200003）

近年來，深部真菌感染的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，患者病死率占住院患者病死率的40%～60%，深部真菌感染引起的侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）已成為威脅免疫功能低下患者生命安全的主要因素之一[1-2]。念珠菌病是由念珠菌屬，尤其是白念珠菌（Candida albicans）引起的一種真菌病，該病原菌既可侵犯皮膚和黏膜，又能累及內(nèi)臟，引發(fā)侵襲性或深部器官念珠菌病，如念珠菌血癥、慢性播散性或肝脾念珠菌病、心內(nèi)膜炎[3]。另外，由于廣譜抗菌藥物、抗癌藥物、免疫抑制劑的泛用和侵入性診療操作、器官移植的廣泛開展，以及人口老齡化等原因，念珠菌病的發(fā)病率大大增高，已成為臨床常見侵襲性真菌感染性疾病，該病進展迅速、診斷困難，患者預(yù)后差，非治療患者死亡率＞90%，由白念珠菌引起的侵襲性念珠菌病已成為院內(nèi)獲得性感染的第四大病因[4]。目前，臨床對念珠菌病的治療依然是首選使用藥物[5-7]。在念珠菌病高危和發(fā)病人群中，使用抗真菌藥物進行預(yù)防和經(jīng)驗治療，在某些情況下，因抗真菌藥物之間存在交叉耐藥性，使得真菌耐藥情況日益嚴重，是臨床治療失敗的主要原因之一[8-9]。隨著被感染患者的增多，抗真菌藥物使用范圍的擴大，以及真菌耐藥性的變遷，對念珠菌進行與臨床相關(guān)的、可重復(fù)的抗真菌藥物敏感性試驗的需求日益增多。念珠菌體外藥物敏感性試驗方法主要有微量肉湯稀釋法、比色法、紙片擴散法和濃度梯度擴散法等。2020年，美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST ）均發(fā)布了最新的微量肉湯稀釋法用于酵母菌體外藥物敏感性試驗[10-13]。2種方法在操作上存在一些差異，但對念珠菌體外藥物敏感性試驗結(jié)果有無差異，鮮有報道。本研究分別采用EUCAST方法和CLSI方法檢測白念珠菌對8種常用抗真菌藥物的敏感性，分析2種方法檢測結(jié)果的差異，為臨床實驗室的實際應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株收集和鑒定

收集2018—2019年上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點實驗室菌株庫保存的42株分離自臨床送檢肺泡灌洗液、穿刺液、引流液和清潔中段尿等體液樣本的白念珠菌非重復(fù)株。所有菌株均采用發(fā)法國生物梅里埃公司基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行鑒定和復(fù)核，不一致結(jié)果采用真菌ITS DNA序列分析進行確認。質(zhì)控菌株近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC258）標準菌株由上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點實驗室菌庫提供。

1.2 方法

1.2.1 制備菌懸液 將保存于-80 ℃的目標菌株復(fù)蘇，于PDA平板[PDA培養(yǎng)基（粉末）購自英國Oxoid公司]35 ℃培養(yǎng)48 h后傳代，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。選取直徑≥1 mm的菌落5個，懸浮于5 mL滅菌0.9%NaCl溶液中，渦旋震蕩15 s，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥氏濁度，制備成濃度為（1～5）×106CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 制備接種懸液 （1）EUCAST方法：將制備的0.5麥氏濁度的菌懸液用含2%葡萄糖的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國ThermoFisher Scientific公司）1∶5稀釋，制備成2倍終濃度為（2～10）×105CFU/mL的接種懸液。（2）CLSI方法：將制備的0.5麥氏濁度的菌懸液用含0.2%葡萄糖的RPMI-1640培養(yǎng)基1∶100稀釋，再1∶10稀釋，制備成2倍終濃度為（1～5）×103CFU/mL的接種懸液。

1.2.3 體外藥物敏感性試驗 根據(jù)EUCAST和CLSI相關(guān)文件[10-13]，選用8種抗真菌藥物（兩性霉素B、阿尼芬凈、卡泊芬凈、氟康唑、伊曲康唑、米卡芬凈、泊沙康唑和伏立康唑）進行體外藥物敏感性試驗。（1）EUCAST要求：用含2%葡萄糖的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋抗真菌藥物至2倍終濃度（氟康唑為0.125～64 mg/L，其他7種抗真菌藥均為0.008～4 mg/L）。（2）CLSI要求：用RPMI-1640培養(yǎng)基將抗真菌藥物稀釋至上述濃度；鋪96孔板（美國Costor公司），每橫排為1種藥物，按照2倍濃度梯度稀釋抗真菌藥物，每孔各加入100 μL抗真菌藥物和100 μL菌懸液，每種藥物至少進行1次重復(fù)。設(shè)定陰性對照和陽性對照孔。EUCAST方法使用平底96孔板，CLSI方法使用U形底96孔板進行孵育。

1.2.4 結(jié)果判讀 將包被好的96孔板置于微生物培養(yǎng)箱，35 ℃培養(yǎng)24 h。EUCAST方法結(jié)果根據(jù)450 nm處最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進行判讀，CLSI方法結(jié)果通過肉眼觀察到的真菌生長情況進行判讀。所有試驗均重復(fù)2次，以保證數(shù)據(jù)的有效性。判讀標準：對比生長對照，兩性霉素B判讀點為完全抑制或顯著減少（抑制率≥50%）；其他7種藥物MIC為對應(yīng)的MIC值，MIC超出試驗范圍的按最高試驗濃度2倍記錄，低于試驗范圍則按最低試驗濃度記錄。

1.2.5 結(jié)果分析 比較2種方法的基本一致性（essential agreement，EA）、分類一致性（categorical agreement，CA）、極重大誤差率（very major error，VME）和重大誤差率（major error，ME）。EA指2種方法結(jié)果相差不超過2個濃度梯度的菌株占所有菌株的百分比；CA指2種方法結(jié)果（耐藥/中介/敏感）相同的菌株占所有菌株的百分比；VME指2種方法中一種為耐藥，另一種為敏感的菌株占所有菌株的百分比；ME是指2種方法中一種為中介，另一種為敏感或耐藥的菌株占所有菌株的百分比。以EA≥90%、CA≥95%、VEM≤1.5%、ME≤3%為標準，判定為2種方法結(jié)果具有一致性[14-15]。

2 結(jié)果

2.1 2種方法MIC值分布

采用EUCAST方法和CLSI方法分別對42株白念珠菌進行體外藥物敏感性試驗，對照孔中的白念珠菌在U形底和平底96孔板中均生長良好，兩性霉素B、阿尼芬凈、卡泊芬凈、氟康唑、伊曲康唑、米卡芬凈、泊沙康唑和伏立康唑的MIC均具有典型性。除EUCAST方法卡泊芬凈MIC值高于CLSI方法外，其他7種抗真菌藥物EUCAST方法的MIC結(jié)果均比CLSI方法的MIC結(jié)果低1～2個稀釋倍數(shù)。EUCAST方法和CLSI方法的總體EA分別為95.2%（氟康唑）、97.6%（米卡芬凈）和100.0%（兩性霉素B、阿尼芬凈、卡泊芬凈、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑）。見表1。

表1 2種方法檢測結(jié)果比較

2.2 2種方法一致性分析

CLSI方法尚無白念珠菌兩性霉素B、伊曲康唑和泊沙康唑的臨床折點，參考流行病學(xué)折點區(qū)別野生型和非野生型[16]。根據(jù)EUCAST和CLSI公布的白念珠菌臨床折點（表2），對2種方法檢測白念珠菌藥物敏感性的一致性進行分析。結(jié)果顯示，兩性霉素B、阿尼芬凈和米卡芬凈2種方法CA為100%；氟康唑EUCAST方法有4株耐藥，2株中介，而CLSI方法這6株菌均為耐藥；伏立康唑有1株EUCAST方法為耐藥，CLSI方法為中介；泊沙康唑EUCAST方法有4株耐藥、1株中介，CLSI方法這5株菌均為耐藥；伊曲康唑有8株2種方法均為耐藥。見表3。

表2 CLSI和EUCAST微量肉湯稀釋法白念珠菌抗真菌藥物敏感性折點

表3 CLSI和EUCAST方法白念珠菌藥物敏感性試驗結(jié)果一致性分析

3 討論

本研究分別采用EUCAST和CLSI推薦的微量肉湯稀釋法分析了42株白念珠菌對8種臨床常用抗真菌藥物的藥物敏感性，結(jié)果顯示，除卡泊芬凈外，7種抗真菌藥物EUCAST方法的MIC值比CLSI方法的MIC值低1～2個稀釋倍數(shù)（卡泊芬凈EUCAST方法的MIC高于CLSI的MIC），幾何均數(shù)EUCAST方法也低于CLSI方法，與PFALLER等[16]的研究結(jié)果一致，本研究卡泊芬凈的結(jié)果與PHILIPS等[17]的研究結(jié)果差異較大，可能與不同研究選擇的方法不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，2種方法的總體EA和CA均為95.2%～100%，提示2種方法的一致性較好；氟康唑的ME為4.8%，泊沙康唑的VME為2.4%，藥物敏感性符合率較差。PFALLER等[16]的研究結(jié)果顯示，114株白念珠菌2種方法的EA和CA均＜95.2%，伊曲康唑和泊沙康唑的VME分別為7.9%和6.4%，而本研究只有泊沙康唑的VME高于要求的1.5%，相比之下，本研究的一致性更好。

EUCAST和CLSI均已將其抗真菌藥物敏感性試驗方法標準化，為協(xié)調(diào)這2種方法的臨床折點做出了巨大努力，調(diào)整了念珠菌氟康唑的臨床折點，減少了2種方法結(jié)果的差異[18]；泊沙康唑在體外對白念珠菌的敏感性高于氟康唑，適合用于治療口咽念珠菌病，但不適用于治療侵襲性念珠菌病，BEREDAKI等[19]在侵襲性念珠菌病的體外藥代動力學(xué)/藥效學(xué)（pharmacokinetics/pharmacodynamics，PK/PD）模型中探索了泊沙康唑?qū)Π啄钪榫寞熜Вl(fā)現(xiàn)其流行病學(xué)界值為0.06 mg/L。而EUCAST公布的臨床折點也為0.06 mg/L。本研究中，2種方法氟康唑和泊沙康唑的藥物敏感性試驗結(jié)果符合率較差，可能與2種藥物在結(jié)果判讀時使用了相同的折點有關(guān)。EUCAST要求的菌濃度為（1～5）×105CFU/mL，CLSI要求的菌濃度為（0.5～2.5）×103CFU/mL，最大濃度相差1 000倍，當使用相同折點判讀時，由于培養(yǎng)基成分、微孔板類型，以及判讀方式不同，很容易使結(jié)果有差異。

卡泊芬凈EUCAST折點尚未公布，由于3種棘白菌素之間存在高度交叉耐藥性，對阿尼芬凈和米卡芬凈均為敏感的分離株應(yīng)被視為對卡泊芬凈敏感。對阿尼芬凈和米卡芬凈（如阿尼芬凈敏感和米卡芬凈耐藥）分類不一致的分離株，應(yīng)通過耐藥基因測序進一步分析[20]。本研究中，阿尼芬凈和米卡芬凈的敏感性均為100%，與上海地區(qū)白念珠菌對棘白菌素類藥物的敏感性一致[21]。近年來，有指南[22]已將新型棘白菌素類藥物列入念珠菌血癥的初始用藥（強烈推薦）。

綜上所述，盡管EUCAST和CLSI方法對白念珠菌孢子濃度、培養(yǎng)基成分、微孔板類型，以及判讀方式有所不同，但本研究結(jié)果顯示，2種方法白念珠菌體外藥物敏感性試驗結(jié)果具有較好的一致性，但氟康唑和泊沙康唑的藥物敏感性符合率未達到要求，可能與本研究參考的折點有關(guān)系。不同的臨床分離株使用不同的方法對常見抗真菌藥物的耐藥性基本一致，但少數(shù)仍然需要協(xié)調(diào)，正確的藥物敏感性試驗結(jié)果能夠幫助臨床實現(xiàn)對念珠菌感染的合理用藥，為臨床有效診斷、治療真菌病提供參考。