孫江漫， 孟祥兆， 李 敏， 邵 燕， 于洪遠(yuǎn)

（北京航天總醫(yī)院檢驗科，北京 100076）

尿酸作為抗氧化劑，占人體生物體液總抗氧化能力的50%。當(dāng)存在于細(xì)胞質(zhì)或動脈粥樣硬化斑塊的酸性/疏水環(huán)境中時，尿酸會轉(zhuǎn)化為促氧化劑，促進(jìn)氧化應(yīng)激，并通過這種機(jī)制參與人類疾病的病理生理過程。尿酸對腎臟的影響包括腎結(jié)石和腫瘤溶解情況下的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。有研究發(fā)現(xiàn)，血清尿酸水平升高與心血管疾病之間也存在關(guān)聯(lián)，包括冠心?。╟oronary heart disease，CHD）、中風(fēng)、充血性心力衰竭、動脈高血壓、心房顫動，以及因心血管疾病導(dǎo)致的死亡風(fēng)險增加；尿酸升高與心血管疾病、代謝綜合征、胰島素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪肝和慢性腎病也存在關(guān)聯(lián)[1]。尿酸的測定方法有磷鎢酸法、尿酸酶法、高效液相色譜-質(zhì)譜法。目前，臨床實驗室測定尿酸主要采用酶法，特異性高、操作較簡單。酶法又分為紫外分光光度法和酶偶聯(lián)法。本研究擬對美國臨床化學(xué)協(xié)會（American Association for Clinical Chemistry，AACC）推薦的血清尿酸參考測量程序（簡稱參考方法）進(jìn)行優(yōu)化，以期為尿酸常規(guī)測量系統(tǒng)的建立和溯源提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集4 0份無溶血、黃疸、乳糜的臨床剩余單人份血清（尿酸濃度為166.81～1 089.61 μmol/L），用于方法學(xué)比較。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)品SRM 913b（99.8%±0.2%），正確度驗證采用標(biāo)準(zhǔn)品SRM 909C[（278.57±5.95）μmol/L]和國際比對樣本RELA20B、RELA21A。

1.2 主要儀器和試劑

carry100紫外可見分光光度儀（美國安捷倫公司）、ARCHITECT c16000全自動生化分析儀（美國雅培公司）及配套尿酸檢測試劑（16043UN20）、校準(zhǔn)品（50078FD01）和多項定標(biāo)液（50078FD01）；美國sigma公司Trisbase（T1503）、Tris-HCl（T3253）、三氯乙酸（T9159）、碳酸鋰（62470），北京阿匹斯公司牛血清白蛋白（AC0012B）、瑞士Roche公司尿酸酶（10828475）。

1.3 方法

1.3.1 尿酸參考方法的建立 按照AACC推薦的尿酸酶法，并參考文獻(xiàn)[2-3]建立血清尿酸測定參考方法，其原理是尿酸酶可特異性地水解尿酸，生成尿囊素，尿酸在293 nm處有特征性的吸收峰，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度的變化測量樣本中的尿酸含量。操作流程：（1）將0.5 mL樣本、2.5 mL Tris-buffer置于15 mL離心管，在測試管中加入1 mL 0.1 U/L尿酸酶，（37±1）℃水浴60 min；（2）在測試管中加入2 mL 10%三氯乙酸，空白管中加入3 mL 10%三氯乙酸-尿酸酶，放置45 min；（3）將測試管和空白管以1 200×g離心40 min，取上清液，測定293 nm處吸光度值。

1.3.2 尿酸參考方法的優(yōu)化 對建立的尿酸參考方法進(jìn)行優(yōu)化，將最終的反應(yīng)液以1 200 ×g離心40 min，收集上清，移至新的離心管，再次離心15 min，以更徹底地去除干擾。

1.3.3 正確度驗證 采用SRM909C和國際比對樣本RELA20B、RELA21A進(jìn)行正確度驗證。

1.3.4 精密度驗證 留取高值（701.45 μmol/L）、中值（424.22 μmol/L）、低值（221.34 μmol/L）臨床剩余血清樣本，每個濃度值每天測定5次，連續(xù)5 d。

1.3.5 線性評估 參考方法的線性范圍為119.05～1 190.48 μmol/L，留取接近線性范圍的高值（1 091.67 μmol/L）、低值（144.05 μmol/L）臨床混合血清樣本，按照1L、0.8L∶0.2H、0.6L∶0.4H、0.4L∶0.6H、0.2L∶0.8H、1H的方式配置6個濃度梯度，計算各濃度梯度的理論濃度。

1.3.6 方法學(xué)比對 采用優(yōu)化后的參考方法和臨床常規(guī)測量系統(tǒng)[c16000全自動生化分析儀及配套尿酸檢測試劑（16043UN20）、校準(zhǔn)品]同時測量40份單人份臨床剩余血清樣本。比較2種方法檢測結(jié)果。（1）參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP9-A3文件[4]，將參考方法作為參比方法，計算常規(guī)方法與參考方法的偏差，以參考方法測定結(jié)果為X軸，以2種方法的偏差為Y軸，繪制偏差圖，觀察2種方法偏差趨勢。（2）根據(jù)CLSI EP9-A3文件，采用廣義極端學(xué)生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法進(jìn)行離群值檢驗。（3）根據(jù)偏差圖建立回歸分析模型，計算斜率、截距、相關(guān)系數(shù)、95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），預(yù)估醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移，觀察其是否在臨床可接受范圍內(nèi)。

1.3.7 互換性評價 根據(jù)CLSI EP14-A3文件要求[5]，采用參考方法和臨床常規(guī)測量系統(tǒng)同時測量40份單人份臨床剩余血清樣本，常規(guī)方法使用的校準(zhǔn)品穿插其中，繪制偏差圖，若2種方法測定結(jié)果的偏差恒定，則進(jìn)行Deming回歸；若偏差隨濃度增加，則對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。以參考方法為參比系統(tǒng)，95%預(yù)測區(qū)間為判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，對常規(guī)方法使用的校準(zhǔn)品進(jìn)行互換性分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用MedCalc軟件進(jìn)行離群值檢測和passing-bablok回歸分析，采用Excel 2019軟件進(jìn)行Deming回歸分析和配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 正確度驗證結(jié)果

尿酸參考方法優(yōu)化前后測定SRM 909C、RELA20B、RELA21A的結(jié)果均在國際臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）等效限范圍內(nèi)（±3.25%），且SRM909C優(yōu)化前后的測量結(jié)果均在證書范圍內(nèi)[（278.57±5.95）μmol/L]。見表1。

表1 正確度評價結(jié)果

2.2 精密度驗證結(jié)果

優(yōu)化后的尿酸參考方法的重復(fù)性和實驗室內(nèi)精密度均有所提高，優(yōu)化前的重復(fù)性[變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為0.19%～1.46%，優(yōu)化前低值樣本實驗室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性精密度＞2%。優(yōu)化后的重復(fù)性（CV）明顯提高（0.05%～0.31%）。實驗室內(nèi)精密度雖然改善不明顯，但其低值精密度有很大改善，達(dá)到了實驗室對精密度的要求（CV＜2%）。見表2、表3。

表2 優(yōu)化前后重復(fù)性（CV）結(jié)果 %

表3 實驗室內(nèi)精密度驗證結(jié)果

2.3 線性評估結(jié)果

優(yōu)化前后的測量結(jié)果無明顯差異（P=0.76）。優(yōu)化前的線性相關(guān)方程為Y=1.01X-0.08（R2=0.999 6），優(yōu)化后的線性相關(guān)方程為Y=1.00X+0.01（R2=0.999 9），優(yōu)化后的線性相關(guān)性更好，斜率更接近1，截距更接近0。

2.4 方法學(xué)比對結(jié)果

2.4.1 常規(guī)方法與參考方法的偏差 常規(guī)方法與參考方法之間差異的變化與濃度成比例，即2種方法間的差異為恒定CV，需對常規(guī)方法和參考方法進(jìn)行passing-bablok回歸分析。2種方法偏差圖見圖1。

圖1 常規(guī)方法與參考方法的偏差圖

2.4.2 離群值檢測結(jié)果 采用MedCalc軟件對2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行離群值檢驗，結(jié)果顯示無離群值，且服從正態(tài)分布。見圖2。

圖2 常規(guī)方法和參考方法百分比差值正態(tài)分布圖

2.4.3 回歸分析結(jié)果 常規(guī)方法和參考方法passing-bablok回歸分析結(jié)果顯示，常規(guī)方法在醫(yī)學(xué)決定水平110、480、640 μmol/L處的預(yù)期偏移分別是-15.86%、-2.03%、-1.01%，其中110 μmol/L處的偏移超過臨床可接受范圍（4.50%）[7]，且隨樣本濃度的增大而減小。見圖3。

圖3 常規(guī)方法與參考方法的Passing- bablok回歸分析

2.5 互換性評價結(jié)果

根據(jù)CLSI EP14-A3文件要求，通過40份單人份臨床剩余血清樣本對常規(guī)測量系統(tǒng)中使用的校準(zhǔn)品進(jìn)行互換性分析，結(jié)果顯示，2種方法測定結(jié)果的偏差為恒定CV，即差異隨濃度而變化，需對結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行互換性分析。校準(zhǔn)品1和2均超出95%可信區(qū)間，其在參考方法和常規(guī)方法中沒有互換性。見圖4。

圖4 常規(guī)方法校準(zhǔn)品互換性分析

3 討論

隨著全自動化生化分析儀和相關(guān)檢測試劑的多樣化發(fā)展，臨床實驗室相關(guān)項目的檢測效率和精密度都有所提高。但是由于系統(tǒng)的多樣性、系統(tǒng)組合的隨意性，以及部分臨床實驗室沒有注意校準(zhǔn)的溯源性，導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異越來越大。檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化是實現(xiàn)不同實驗室相同項目檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可比的最有效的措施，量值溯源是實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的重要方法之一。國際組織一般通過建立參考方法、研制參考物質(zhì)和一致性方案來解決量值溯源的問題[8]。本研究通過優(yōu)化血清尿酸參考方法，并與常規(guī)測量系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)比對，為尿酸常規(guī)測量系統(tǒng)的建立和溯源提供參考。

本研究分析了國際一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM909C和國際比對樣本RELA20B、RELA21A的尿酸測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的尿酸參考方法不會導(dǎo)致測量結(jié)果不正確，且優(yōu)化后的重復(fù)性有明顯提高，實驗室內(nèi)精密度也有所改善，其中低值樣本的精密度達(dá)到了實驗室的要求（CV＜2%）；優(yōu)化后的線性相關(guān)性更好；提示優(yōu)化后的尿酸參考方法對正確度無影響，且有更好的精密度和線性相關(guān)性。

CLSI推出的新版EP9-A3文件是臨床實驗室進(jìn)行方法學(xué)比對和偏移評估的重要指南。本研究參考CLSI EP9-A3文件對優(yōu)化后的參考方法與常規(guī)測量系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)比對，結(jié)果顯示，在110 μmol/L處的預(yù)期偏移為-15.86%，明顯超過尿酸的臨床可接受范圍（4.5%），原因可能是參考方法的線性范圍為119～1 190 μmol/L，無法與常規(guī)方法線性范圍（55.92～1 970.24 μmol/L）重疊，即沒有覆蓋醫(yī)學(xué)決定水平低值（110 μmol/L），無法對常規(guī)測量系統(tǒng)低值樣本進(jìn)行比較。另外，本研究參考EP14-A3文件對常規(guī)方法使用的校準(zhǔn)品進(jìn)行了互換性分析，發(fā)現(xiàn)2個濃度水平的校準(zhǔn)品在2種方法之間沒有互換性，這可能也是醫(yī)學(xué)決定水平低值樣本的預(yù)期偏移較大的原因；還有可能是2種方法的檢測原理略有不同，參考方法的原理是尿酸酶可特異性地將尿酸水解，生成尿囊素，尿酸在293 nm處有特征吸收峰，而尿囊素沒有，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度的變化可定量樣本中尿酸的含量；而常規(guī)方法的原理是尿酸經(jīng)尿酸酶氧化生成尿囊素，同時生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下與4-氨基安替比林和N-（3-磺丙基）-3-甲氧基-5-甲基苯胺反應(yīng)生成一種醌亞胺染料，604 nm處吸光度的改變與樣本中尿酸的濃度成正比。

綜上所述，優(yōu)化后的血清尿酸參考方法精密度和線性更好，可以為臨床常規(guī)方法的建立和溯源提供一定的參考。臨床實驗室在建立尿酸常規(guī)方法時需重視測量方法的原理和校準(zhǔn)品的溯源。