包海林， 花鴻燕， 孫恒亮， 劉 華， 吉順年， 秦陳浩， 杜 鴻

（1.海安市中醫(yī)院檢驗科，江蘇 海安 226600；2.蘇州大學附屬第二醫(yī)院微生物科，江蘇 蘇州 215004）

Carba NP試驗和改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）是美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）先后推薦的用于檢測和鑒別腸桿菌科細菌、非發(fā)酵菌碳青霉烯酶的確證試驗，CLSI推薦聯(lián)合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶滅活試驗（ethylenediaminetetraacetic acid-carbapenem inactivation method，eCIM）用于產(chǎn)酶腸桿菌科細菌的檢測和酶型分析[1]。Carba NP試驗檢測低水解活性的碳青霉烯酶OXA-48時敏感性較低，僅為55.7%～70.9%[2]，且操作相對復雜，影響因素偏多。mCIM/eCIM需孵育2次，且美羅培南紙片在待測菌懸液中浸泡4 h，易因紙片總藥物含量降低而致假陽性，不能達到快速檢測的目的[3]。本研究通過改良Carba NP試驗，分別采用他唑巴坦和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）作為A和B類酶抑制劑，以區(qū)分A、B、D類酶，將mCIM/eCIM的2次孵育時間分別縮短至2和9 h，探討2種改良方法在檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2019年12月—2020年9月海安市中醫(yī)院臨床分離的非重復腸桿菌科細菌136株，其中耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE）86株[亞胺培南或美羅培南最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL]，碳青霉烯類敏感菌株50株（亞胺培南、美羅培南均敏感）。標準菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705）和肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）均購自我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 主要儀器與試劑

VITECK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀及配套鑒定藥敏卡板（法國生物梅里埃公司），ALL SHENG Auto-Pure 96磁珠法核酸提取儀（杭州奧盛公司），C1000 Thermal cycler PCR擴增儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀（美國伯樂公司），CP-31DN電泳儀（北京六一公司），血平板、MH瓊脂平板和亞胺培南西司他?。绹硸|制藥有限公司），胰酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基[（tryptic soy broth，TSB），杭州百思生物技術有限公司]，10 μg美羅培南藥敏紙片（溫州康泰生物技術有限公司），DNA mark D2000，2×Taq master mix[生工生物工程（上海）有限公司]，MagMax-96DNA Multi-Sample Kit（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 改良Carba NP試驗 在37 ℃培養(yǎng)24 h的MH平板上用1 μL接種環(huán)挑取1滿環(huán)受試菌株，加入裝有100 μL細菌總蛋白抽提液（Tris-HCl，20 mmol/L）的eppendorf管中，劇烈振蕩30 s，分裝于5個管，分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，每管底物成分見表1；將pH值調至7.8±0.1，37 ℃孵育2 h。如菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，會水解亞胺培南西司他丁，并釋放H+，使pH值降低，酚紅指示劑變色（紅變黃）；反之指示劑不變色。他唑巴坦管（Ⅲ）不變色為A類酶， EDTA管（Ⅳ)不變色為B類酶，2個管均變色 （Ⅴ）為D類酶。陽性對照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705），陰性對照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）。

表1 改良Carba NP試驗底物成分

1.3.2 mCIM/eCIM試驗 制備2管TSB肉湯（2 mL），其中1管含EDTA（終濃度為5 mmol/L）。用1 μL接種環(huán)刮取1滿環(huán)于血平板培養(yǎng)24 h的待測菌，分別加入含2 mL TSB肉湯的eppendorf管中，振蕩混勻。將美羅培南藥敏紙片（10 μg）浸入菌液中，35 ℃溫育2 h，制備成0.5麥氏濁度的大腸埃希菌（ATCC 25922）懸液，均勻涂布在MH瓊脂平板上，反扣平板干燥5 min。用10 μL接種環(huán)將美羅培南紙片貼于試管內(nèi)壁，去除多余菌液后取出，再貼到同一MH瓊脂平板上。35 ℃溫箱孵育9 h，測量抑菌圈直徑。結果判斷：（1）美羅培南藥敏紙片的抑菌圈直徑為6～15 mm，或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，判定為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株；抑菌圈直徑≥19 mm為陰性；（2）mCIM陽性和eCIM抑菌圈直徑的差值≥5 mm，判定為產(chǎn)金屬酶；若差值≤4 mm，判定為產(chǎn)絲氨酸酶。mCIM陰性時，eCIM無需再判斷；eCIM抑菌圈內(nèi)散在的針尖樣菌落可以忽略不計。陽性對照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705），陰性對照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）。

1.3.3 碳青霉烯酶基因擴增與檢測 采用磁珠法提取待測菌基因組DNA，按試劑盒說明書要求操作。參照文獻[4-5]設計碳青霉烯酶基因bla、bla、bla、bla和bla[2]引kpc-2NDM-1IMP-4VIM-1OXA-48物（表2）。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq master mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s；56 ℃退火60 s；72 ℃ 5 min，32個循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產(chǎn)物后，用凝膠成像儀拍照。

表2 PCR引物序列及目的片段長度

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用例或率表示，比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 耐藥基因檢測結果

86株CRE菌株中，有81株檢出碳青霉烯酶基因，其中43株攜帶blakpc-2，32株攜帶blaNDM-1，4株攜帶blaIMP-4，2株共同攜帶blakpc-2和blaNDM-1基因；5株未檢出耐藥基因。有53株肺炎克雷伯菌檢出耐藥基因，其中39株攜帶blakpc-2基因，9株攜帶blaNDM-1，3株攜帶blaIMP-4，2株同時攜帶blakpc-2和blaNDM-1。有20株大腸埃希菌耐藥基因陽性，其中18株攜帶blaNDM-1，2株攜帶blakpc-2。50株碳青霉烯敏感腸桿菌科細菌均未檢出耐藥基因。見圖1、圖2、圖3。

圖1 blakpc-2基因電泳結果

圖2 blaNDM-1基因電泳結果

圖3 blaIMP-4基因電泳結果

2.2 2種方法碳青霉烯酶表型篩查結果

86株CRE中，改良Carba NP試驗陽性82株，陰性4株；mCIM陽性78株，陰性8株。改良Carba NP試驗與mCIM陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.65，P＞0.05）。eCIM陽性36株，陰性42株（有8株mCIM陰性，eCIM無需解釋結果）。50株碳青霉烯類敏感菌株中，改良Carba NP試驗、mCIM/eCIM均陰性。43株A類碳青霉烯酶基因陽性菌株中，改良Carba NP試驗陽性42株，陰性1株；mCIM陽性41株，陰性2株；eCIM陽性3株，陰性38株，無效2株。36株B類碳青霉烯酶基因陽性菌株中，改良Carba NP試驗、mCIM均為陽性，3株eCIM陰性。2株同時攜帶blakpc-2和blaNDM-1的菌株改良Carba NP試驗、mCIM/eCIM均為陰性。部分CRE菌株改良Carba NP試驗結果見圖4。部分菌株mCIM/eCIM結果見圖5?；驒z測和表型篩查結果見表3。

圖4 部分CRE改良Carba NP試驗結果

圖5 部分菌株mCIM/eCIM碳青霉烯酶表型篩查結果

表3 2種方法基因檢測和表型篩查結果

2.3 改良Carba NP試驗和mCIM檢測CRE的效能

改良Carba NP試驗和mCIM檢測CRE的敏感性分別為96.3%和91.4%，特異性均為92.7%，與PCR檢測結果的一致性均較高。見表4。

表4 改良Carba NP試驗和mCIM表型檢測結果比較

2.4 改良Carba NP試驗碳青霉烯酶分型檢測效能

82株改良Carba NP試驗陽性菌株中，42株（97.7%）檢出A類碳青霉烯酶，36株（43.9%）檢出B類碳青霉烯酶菌株。見表5。

表5 改良Carba NP試驗與PCR分型結果比較

2.5 eCIM檢測金屬碳青霉烯酶的效能

eCIM檢測金屬碳青霉烯酶的敏感性和特異性分別為91.2%和90.4%，檢測絲氨酸碳青霉烯酶的敏感性和特異性分別為93.0%和94.3%。與PCR結果一致性較好（kappa值＞0.75）。見表6。

表6 eCIM與PCR檢測結果比較

3 討論

隨著碳青霉烯類抗菌藥物在治療腸桿菌科細菌感染性疾病中的應用，CRE的檢出率逐年上升[6]。碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌感染導致的死亡患者例數(shù)增加得最多[7]。有研究結果顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為26.6%和27.2%[6]。目前，臨床判斷細菌是否對碳青霉烯耐藥主要依靠體外藥物敏感性試驗結果，但一些CRE的MIC可能低于美國臨床實驗室標準化協(xié)會或歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會確定的耐藥折點，主要原因是一些產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的水解能力較弱，導致體外試驗結果為敏感的菌株實際臨床表現(xiàn)為耐藥；同時，抗菌藥物對不同產(chǎn)酶類型菌株的治療效果有很大區(qū)別[8]。因此，鑒別菌株產(chǎn)酶類型非常重要。

目前，碳青霉烯酶的檢測方法通常為表型檢測、實時熒光定量PCR或多重PCR、二代測序等。表型檢測簡便、快捷，其中Carba NP試驗和mCIM是有望在臨床微生物學實驗室推廣使用的2種方法，但存在某些碳青霉烯酶表型檢測敏感性差、耗時長、不利于臨床常規(guī)開展等缺點。本研究在Carba NP試驗的基礎上，分別增加了他唑巴坦和EDTA作為A類和B類碳青霉烯酶抑制劑，以此來區(qū)分A、B、D類酶。若含亞胺培南西司他丁管變色即為陽性；含他唑巴坦管不變色即為產(chǎn)A類酶菌株，含EDTA管不變色即為產(chǎn)B類酶菌株，含他唑巴坦和EDTA管都變色即為產(chǎn)D類酶菌株。值得注意的是，Carba NP試驗的原理是利用細菌產(chǎn)碳青霉烯酶水解亞胺培南產(chǎn)生H+，使pH值下降，指示劑變色，所以pH值必須調節(jié)在7.8±0.1才能靈敏地發(fā)生顏色變化。

本研究結果顯示，改良Carba NP試驗檢測CRE的敏感性為96.3%、特異性為92.7%，與PCR結果一致性較好。有研究發(fā)現(xiàn)，黏液性菌株可致Carba NP試驗假陰性[9]。本研究中，有3株肺炎克雷伯菌改良Carba NP試驗假陰性，這3株肺炎克雷伯菌均為黏液性菌株。本研究結果顯示，改良Carba NP試驗對于單獨攜帶blakpc-2基因或blaIMP-4基因的菌株比較敏感，而對于同時攜帶這2種基因的菌株敏感性較差?？傮w來看，改良Carba NP試驗可以快速地為臨床提供產(chǎn)酶菌株的分型結果。

本研究將mCIM孵育時間由4 h縮短至2 h，將美羅培南紙片轉種至MH平板孵育時間縮短至9 h，結果顯示，mCIM檢測碳青霉烯酶的敏感性為92.6%，特異性為94.5%，與PCR結果一致性較高。本研究結果顯示，基因檢測為陽性的菌株中有2株大腸埃希菌和2株弗勞地枸櫞酸桿菌mCIM結果為陰性，可能與美羅培南紙片孵育時間或MH平板孵育時間過短、碳青霉烯酶陽性菌株酶釋放過少，或藥物敏感性試驗中菌株培養(yǎng)時間過短導致的假陰性有關，后續(xù)將調整孵育時間，改進試驗方法；有2株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌基因檢測和mCIM均陰性，可能與其耐藥機制[10]有關；改良Carba NP試驗假陰性的3株肺炎克雷伯菌mCIM陽性，mCIM假陰性的2株大腸埃希菌和2株弗勞地枸櫞酸桿菌改良Carba NP試驗陽性，原因可能為eCIM利用EDTA抑制金屬酶來區(qū)分產(chǎn)金屬酶和絲氨酸酶的耐藥菌株，而本研究eCIM篩選金屬碳青霉烯酶的敏感性為91.2%，特異性為90.4%，低于相關研究[11-13]結果，可能與菌株數(shù)過少或孵育時間過短有關。有研究發(fā)現(xiàn)，eCIM檢測結果亦與EDTA的濃度有關，EDTA濃度為30 mmol/L時，檢測陽性率最高[14]。對于同時攜帶blakpc-2基因和blaIMP-4基因的菌株，mCIM無法鑒別。

有研究結果顯示，第三代頭孢菌素與新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合劑，如頭孢他啶-阿維巴坦，對產(chǎn)KPC酶和OXA-48酶CRE具有高度的抑制作用，但對產(chǎn)NDM類金屬酶CRE則無效[15]。對于產(chǎn)金屬酶的致病菌株，可采用氨曲南-阿維巴坦或頭孢地爾治療[16]。有研究結果顯示，泛耐藥腸桿菌科細菌僅對替加環(huán)素、多黏菌素和頭孢他啶-阿維巴坦敏感[17]，因此應盡早開展耐碳青霉烯類細菌的表型檢測和藥物敏感性試驗，為臨床提供有效的治療依據(jù)。

綜上所述，改良Carba NP試驗通過觀察顏色變化判斷結果，直觀且可靠，可快速鑒定碳青霉烯酶表型；mCIM/eCIM也可在1 d內(nèi)完成分型報告。2種改良方法可優(yōu)勢互補，提高分型準確率和效率，及時為臨床用藥提供參考。