田志鵬，杜曦*，王亮，蘭舫，張燦（.河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，石家莊 050800；2.河北省多糖類藥物工程技術研究中心，石家莊 050800）

肝素鈉，作為一種抗凝血、抗血栓的藥物已存在百年之久，其中低分子肝素作為抗凝血劑，是最常用于血栓栓塞的預防和治療藥物。2020年世界衛(wèi)生組織在“疑似新型冠狀病毒感染時針對嚴重急性呼吸道感染的臨床處理臨時指導”中曾建議，可通過給予肝素以預防新型冠狀病毒肺炎患者的靜脈血栓栓塞。2022年最新的研究表明使用高于預防劑量的依諾肝素治療新型冠狀病毒肺炎患者，可將其住院時間縮短20%以上，緩解超過65%病例的癥狀。

肝素的粗品通常來源于豬腸黏膜（牛源和羊源肝素與豬源肝素同樣有著類似的理化性質和結構）。肝素粗品經過鹽解，熱變性，提純，氧化得到肝素鈉精品。肝素平均分子量約16 000道爾頓（Da），并且有相似的抗Ⅹa與抗Ⅱa因子活性。低分子量肝素（LMWH）重均分子量通常在8000以下，小于8000的級分不少于60%，且抗Ⅹa因子大于抗Ⅱa因子活性。兩者皆通過結合ATⅢ抑制凝血酶的活性，達到抗凝血、抗血栓的作用。

目前對于肝素類原料產品的保存方式僅限于固體干燥粉末，且需要密封置于陰涼，干燥處存放。而將肝素鈉、達肝素鈉、依諾肝素鈉以溶液狀態(tài)存放，存在染菌風險，隨著時間的延長，產品會有一個自然分解過程，重均分子量逐漸變低，低分子組分逐漸增多。本文用到的肝素鈉及兩種代表性低分子量肝素產品（達肝素鈉、依諾肝素鈉）均為我公司自制。達肝素鈉為亞硝酸降解法制備，依諾肝素鈉為

β

-消除降解法制備。通過將多糖類肝素產品從其溶液中分離，加乙醇進行液封保存，并將此法長期保存的樣品與干燥粉末的分子量、效價、雙糖進行對比，考察肝素產品的質量變化，以提供一種新的保存方式和可存放的時限，解決企業(yè)生產過程中遇到的產品因滯留和凍干設備故障中間產品無法保存的問題。

1 材料

1.1 試藥

肝素鈉、達肝素鈉、依諾肝素鈉（原料藥，河北常山生化藥業(yè)股份有限公司）；依諾肝素鈉對照品（批號：6.0，歐洲藥品質量管理局EDQM）；氯化鈉（河北華晨藥業(yè)）；乙醇（梅河口市阜康酒精有限公司）；醋酸銨、亞硝酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、硫酸、氫氧化鉀（分析純，天津永大化學試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉、硫酸鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈣（分析純）、牛血清白蛋白（含量≥98%，Vetec Sigma-Aldrich）；硝酸鋰（分析純，Aladdin試劑）；抗凝血酶ATⅢ、FⅩa因子、發(fā)色底物S-2765，發(fā)色底物S-2238（意大利Chromogenix）；乙腈（色譜純，美國Merck）；肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（含量＞99%，北京艾德豪克）。

1.2 儀器

OS20-S數(shù)顯頂置電子攪拌器（大龍興創(chuàng)實驗儀器）；FE28型pH計、PL602-L電子天平（Mettler Toledo）；DZF-6210真空干燥箱（上海一恒）；U3000高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific）；2414示差折光檢測器（美國Waters）；384 DMS酶標儀（美國美谷分子儀器）；S2型96孔通道紫外檢測器（上海美杏高德生物）；色譜柱（Waters Xbridge Beh 200A Sec，Waters Spherisorb Sax）；UV-8000紫外可見分光光度計（上海元析儀器）。

2 方法

2.1 試驗步驟

分別取一定量肝素鈉、達肝素鈉、依諾肝素鈉樣品，加入純化水攪拌溶解（1∶10以內），并補加溶液體積1%的氯化鈉，以模擬生產過程中產品溶液狀態(tài)。加入4倍以上95%乙醇進行攪拌沉淀，邊加入邊快速攪拌。加入完畢繼續(xù)攪拌15 min，隨后靜置8 h以上，分離底部沉淀并將上清溶液除盡。沉淀使用少量乙醇進行液封保證完全隔離空氣，置于15～25℃保存。分別于第10日、20日、30日、3個月、6個月、9個月、12個月取樣，檢測分子量、效價、雙糖。

2.2 檢測方法

2.2.1 分子量及效價 肝素鈉分子量、效價檢測方法參照《中國藥典》2020年版；達肝素鈉及依諾肝素鈉分子量、效價檢測方法參照歐洲藥典EP10.5并進行優(yōu)化。

2.2.2 雙糖 依諾肝素鈉雙糖檢測方法參考歐洲藥典EP 10.5：

① 色譜條件：流動相A為磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉0.280 g，加水950 mL使溶解，用磷酸調節(jié)pH值至3.0，加水稀釋至1000 mL），流動相B為高氯酸鈉磷酸二氫鈉溶液（取高氯酸鈉140 g，加流動相A 950 mL使溶解，用磷酸調節(jié)pH值至3.0，用流動相A稀釋至1000 mL）；柱溫：50℃；流速：0.8 mL·min；進樣量：10 μL；檢測器：紫外檢測器，檢測波長：234 nm。

② 溶液配制

肝素酶溶液：取肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ適量，分別加pH 7.0磷酸鉀緩沖液制成0.4 IU·mL的溶液。將其按1∶1∶1的體積比混合，得到混合肝素酶溶液。

供試品溶液（酶解）：取供試品適量，加水制成20 mg·mL的溶液，取20 μL，加入pH 7.0醋酸鈣溶液70 μL和肝素酶混合液100 μL混勻，置25℃恒溫環(huán)境中放置48 h以上。

對照品溶液（酶解）：取對照品適量，加水制成20 mg·mL的溶液，取20 μL，加入pH 7.0醋酸鈣溶液70 μL和肝素酶混合液100 μL混勻，置25℃恒溫環(huán)境中放置48 h以上。

空白溶液：取水20 μL，與供試品溶液同時同法進行酶解，作為空白溶液。

取空白溶液、供試品溶液（酶解）、對照品溶液（酶解）各10 μL，注入液相色譜儀，進行測定。

肝素鈉、達肝素鈉雙糖檢測方法參考依諾肝素鈉雙糖檢測方法。

3 結果與討論

3.1 肝素鈉檢測結果

3.1.1 肝素鈉分子量結果 肝素鈉分子量檢測結果見表1，根據(jù)《中國藥典》2020版肝素鈉分子量與分布檢測描述，重均分子量應在標示值±500范圍內，肝素鈉長期的檢測結果

RSD

為0.50%，可認為分子量未發(fā)生較大波動，測量結果有較高準確度。肝素鈉以本文方式存放，分子量12個月內不會發(fā)生變化。

表1 肝素鈉分子量及分布檢測結果
Tab 1 Molecular weight and distribution of heparin sodium

肝素鈉 重均分子量 ＞24 000/%干品 17 133 14.6保存10日 17 112 14.2保存20日 17 187 14.5保存30日 17 109 14.0保存3個月 17 123 15.0保存6個月 17 128 14.3保存9個月 17 148 14.3保存12個月 16 919 14.1平均值 17 104 14.3 RSD/% 0.50 2.3

3.1.2 肝素鈉效價結果 肝素鈉效價檢測結果見表2，肝素鈉的效價檢測屬于生化藥品的檢測范圍，存在較大的波動，根據(jù)《中國藥典》2020版肝素鈉生物測定法描述，我們把效價的

RSD

值＜5.0%認為樣品穩(wěn)定未發(fā)生較大變化。肝素鈉長期存放后的效價檢測結果

RSD

值為1.6%，可認為肝素鈉以本文方式保存12個月，效價不會發(fā)生變化。

表2 肝素鈉效價檢測結果
Tab 2 Heparin sodium potency

肝素鈉 抗Ⅱa因子效價/（IU·mg－1）干品 218.4保存10日 225.7保存20日 219.2保存30日 219.8保存3個月 227.2保存6個月 225.0保存9個月 227.5保存12個月 221.0平均值 223.6 RSD/% 1.6

3.1.3 肝素鈉雙糖結果 肝素鈉雙糖檢測結果見表3。肝素鈉的雙糖重復單元由己糖醛酸（HexA）和葡萄糖胺（GlcN）組成。己糖醛酸（HexA）包括

β

-

D

-葡萄糖醛酸（GlcA）和

α

-

L

-艾杜糖醛酸（IdoA），可以發(fā)生2-

O

-硫酸基（2S）取代。葡萄糖胺（GlcN）可發(fā)生

N

-乙酰化（GlcNAc）、

N

-硫酸化（GlcNS），3-

O

-硫酸化（3S）和6-

O

-硫酸化（6S）修飾。生化藥品由于其本身的特殊性、雙糖檢測的復雜性，以及受肝素酶的裂解程度差異等因素的影響較大，易存在較大的分析方法檢測誤差。通過肝素酶Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 的聯(lián)合酶解可將肝素鈉完全降解為二糖基本組成單元，其中糖醛酸變?yōu)椴伙柡吞侨┧幔?UA）。我們把含量較少的糖醛酸2-

O

脫硫酸翻轉產物△ⅣSgal、△ⅡSgal（含量不足1%）認為存在即可。

RSD

值不大于10%，認為樣品雙糖結構未發(fā)生較大變化。由表3肝素鈉雙糖檢測結果可知，8種基礎二糖組成單元△ⅣA（?UA-GlcNA）、△ⅣS（?UA-GlcNS）、△ⅡA（?UA-GlcNAc6S）、 △ⅢA（?UA2S-GlcNAc）、△ⅡS（?UA-GlcNS6S）、△ⅢS（?UA2S-GlcNS）、△ⅠA（?UA2S-GlcNAc6S）、△ⅠS（?UA2SGlcNS6S），絲氨酸氧化1形態(tài)△Glyserox1，其檢測結果

RSD

值均＜10%，可認為其結構組成均未發(fā)生明顯變化。即肝素鈉以本文方式保存12個月，雙糖結構不會發(fā)生變化。

表3 肝素鈉雙糖檢測結果
Tab 3 Heparin sodium disaccharide

肝素鈉 △ⅣA △Glyserox1 △ⅣSgal △ⅣS △ⅡA △ⅢA △ⅡSgal △ⅡS △ⅢS △ⅠA △ⅠS干品 3.77 1.64 0.07 3.05 3.40 1.74 0.52 10.71 7.12 1.51 61.86保存10日 3.68 1.61 0.10 3.19 3.44 1.81 0.54 10.79 7.09 1.51 62.04保存20日 3.70 1.62 0.07 3.12 3.45 1.76 0.53 10.87 7.10 1.51 62.15保存30日 3.37 1.56 0.11 2.79 3.03 1.63 0.61 10.04 6.87 1.49 63.31保存3個月 3.40 1.51 0.09 2.82 3.12 1.62 0.54 10.06 7.30 1.52 62.87保存6個月 3.24 1.45 0.07 2.79 3.12 1.56 0.46 10.68 7.33 1.49 63.65保存9個月 3.66 1.51 0.08 3.10 3.63 1.80 0.69 10.91 7.11 1.56 62.87保存12個月 3.84 1.54 0.07 3.10 3.60 1.79 0.66 10.91 7.11 1.54 62.96平均值 3.56 1.54 － 2.99 3.34 1.71 － 10.61 7.13 1.52 62.84 RSD/% 6.1 3.9 －6.07.46.0－ 3.72.11.7 0.92

3.2 達肝素鈉檢測結果

3.2.1 達肝素鈉分子量結果 達肝素鈉分子量檢測結果見表4，我國對達肝素，依諾肝素這兩種低分子肝素品種暫未收錄，低分子量肝素的分子量測定誤差較大，對其分子量及分布的檢測測定值應在標示值±3.3%，達肝素鈉重均分子量應在標示值±200。達肝素鈉長期的檢測結果

RSD

為1.0%，可認為分子量未發(fā)生較大波動，測量結果有較高準確度。達肝素鈉以本文方式存放12個月，分子量不會發(fā)生變化。

表4 達肝素鈉分子量及分布檢測結果
Tab 4 Molecular weight and distribution of dalteparin sodium

達肝素鈉 重均分子量 ＜3000/% ＞8000/%干品 6189 11.0 22.0保存10日 6064 10.9 21.7保存20日 6131 10.8 22.5保存30日 6210 10.3 22.7保存3個月 6239 10.1 23.3保存6個月 6126 10.5 23.0保存9個月 6156 10.2 22.3保存12個月 6189 10.0 22.7平均值 6159 10.4 22.6 RSD/% 1.0 3.3 2.3

3.2.2 達肝素鈉效價結果 達肝素鈉效價檢測結果見表5，達肝素鈉的效價檢測屬于生化藥品的檢測范圍，存在較大的波動，所以我們定義效價的

RSD

值＜5.0%認為樣品是穩(wěn)定未發(fā)生較大變化的。根據(jù)達肝素鈉長期的效價檢測結果，其抗Ⅹa因子效價，抗Ⅱa因子效價，抗Ⅹa∶抗Ⅱa因子

RSD

值分別為2.0%、2.9%、2.6%。認為達肝素鈉長期以本文方式保存，效價12個月內不會發(fā)生變化。

表5 達肝素鈉效價檢測結果
Tab 5 Dalteparin sodium potency

達肝素鈉 抗Ⅹa因子/（IU·mg－1）抗Ⅱa因子/（IU·mg－1） 抗Ⅹa∶抗Ⅱa干品 135.1 62.2 2.2保存10日 134.2 61.1 2.2保存20日 133.4 62.1 2.1保存30日 134.1 61.3 2.2保存3個月 133.1 61.0 2.2保存6個月 131.2 60.4 2.2保存9個月 127.4 59.1 2.2保存12個月 129.1 57.0 2.3平均值 131.8 60.3 2.2 RSD/% 2.0 2.9 2.6

3.2.3 達肝素鈉雙糖結果 達肝素鈉雙糖檢測結果見表6。達肝素鈉非還原端（NRE）的主要結構為2-

O

-硫酸-

α

-

L

-艾杜糖醛酸，還原端主要結構為6-

O

-硫酸-2，5-內醚-

D

-甘露糖醇。使用肝素酶Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 的聯(lián)合降解可將達肝素完全酶解為二糖基本組成單元。我們把含量較少的來源于肝素和蛋白質連接域的寡糖結構△Glyserox1，糖醛酸2-

O

脫硫酸翻轉產物△ⅣSgal（含量不足1%）認為存在即可。其他組分

RSD

值不大于10%，我們認為樣品雙糖結構未發(fā)生較大變化。由表6達肝素鈉長期的雙糖檢測結果，主峰糖結構△ⅡA-ⅣSglu＋ⅠS；8種基礎二糖組成單元△ⅣA、△ⅣS、△ⅡA、△ⅢA、△ⅡS、△ⅢS、△ⅠA、△ⅠS，特征雙糖△ⅡM、△ⅠM，特征四糖△ⅠS-ⅠM；糖醛酸2-O脫硫酸翻轉產物△ⅡSgal檢測結果

RSD

值均＜10%，可認為其結構組成均未發(fā)生變化。所以達肝素鈉以本文方式保存12個月，雙糖結構不會發(fā)生變化。

表6 達肝素鈉雙糖檢測結果
Tab 6 Dalteparin sodium disaccharide

達肝素鈉 △ⅣA△Glyserox1 △ⅣSgal△ⅣS△ⅡM△ⅡA△ⅢA△ⅡSgal△ⅡS△ⅢS△ⅠM△ⅠA△ⅡA-ⅣSglu＋ⅠS△ⅡA-ⅡSglu△ⅠS-ⅠM干品 2.01 0.56 0.20 1.65 1.99 3.38 1.24 2.64 8.05 4.48 1.01 1.47 57.41 3.11 6.48保存10日 1.70 0.47 0.21 1.36 2.06 3.19 1.17 2.62 8.10 4.25 0.92 1.41 57.35 3.35 6.74保存20日 1.87 0.54 0.24 1.51 2.13 3.50 1.24 2.60 8.38 4.39 0.96 1.47 56.31 3.41 6.56保存30日 2.13 0.58 0.20 1.64 1.95 3.21 1.21 2.43 7.57 4.32 1.11 1.59 58.88 3.24 6.09保存3個月 1.94 0.49 0.21 1.68 1.96 3.35 1.33 2.65 7.88 4.11 1.10 1.54 57.74 3.43 5.81保存6個月 1.96 0.58 0.22 1.48 1.93 3.05 1.18 2.94 7.99 3.93 1.13 1.52 57.57 3.72 5.99保存9個月 2.27 0.76 0.10 1.60 1.69 3.45 1.49 2.96 7.74 4.54 1.07 1.55 56.88 3.01 5.59保存12個月 2.02 0.51 0.23 1.58 1.74 3.35 1.3 2.38 8.09 4.31 1.07 1.53 55.81 3.28 5.58平均值 1.98 － － 1.55 1.92 3.30 1.27 2.65 7.96 4.26 1.05 1.52 57.22 3.35 6.05 RSD/% 9.2－ －7.08.34.88.88.53.34.67.63.91.86.57.5

3.3 依諾肝素鈉檢測結果

3.3.1 依諾肝素鈉分子量結果 依諾肝素鈉分子量檢測結果見表7，依諾肝素鈉重均分子量應在標示值±150范圍內，而依諾肝素鈉長期的分子量及分布檢測結果

RSD

＜1.2%，我們認為分子量未發(fā)生較大波動，測量結果有較高準確度。依諾肝素鈉以本文方式存放12個月，分子量不會發(fā)生變化。

表7 依諾肝素鈉分子量及分布檢測結果
Tab 7 Molecular weight and distribution of enoxaparin sodium

依諾肝素鈉 重均分子量 ＜2000/%2000～8000/%＞8000/%干品 4410 16.4 72.8 10.8保存10日 4440 16.4 72.5 11.1保存20日 4411 16.6 72.5 10.8保存30日 4428 16.4 72.7 10.9保存3個月 4436 16.5 72.5 11.0保存6個月 4464 16.2 72.6 11.2保存9個月 4437 16.3 72.7 11.0保存12個月 4451 16.3 72.6 11.1平均值 4438 16.4 72.6 11.0 RSD/% 0.40 0.80 0.10 1.2

3.3.2 依諾肝素鈉效價結果 依諾肝素鈉效價檢測結果見表8，依諾肝素鈉的效價檢測屬于生化藥品的檢測范圍，存在較大的波動，所以我們定義效價的

RSD

值＜5.0%認為樣品是穩(wěn)定的。根據(jù)依諾肝素鈉長期的效價檢測結果，其抗Ⅹa因子效價，抗Ⅱa因子效價，抗Ⅹa∶抗Ⅱa因子

RSD

值分別為1.0%、1.3%、0.0%。我們認為依諾肝素鈉以本文方式保存12個月，效價不會發(fā)生變化。

表8 依諾肝素鈉效價檢測結果
Tab 8 Enoxaparin sodium potency

3.3.3 依諾肝素鈉雙糖結果 依諾肝素鈉雙糖檢測結果見表9。肝素酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ聯(lián)合酶切依諾肝素鈉的1，4-糖苷鍵，并在二糖和寡糖的NRE處留下不飽和的Δ4，5-糖醛酸殘基（△UA）。但是其中一些特殊結構，如GlcN殘基上的3-

O

-磺基和1，6-脫水衍生物，可能會阻礙肝素酶的活性使其生成不飽和四糖而不是二糖。除依諾肝素鈉的原始NRE和RE以外，其大多數(shù)結構特征均可從酶解產物中推導出。我們把含量較少的糖醛酸2-

O

脫硫酸翻轉產物△ⅣSgal，絲氨酸氧化1形態(tài)△Glyserox1，四糖△ⅡA-ⅣSglu（含量不足1%）認為存在即可，其余組分

RSD

值不大于10%，認為樣品雙糖結構未發(fā)生較大變化。由表9依諾肝素鈉長期的雙糖檢測結果可知，8種基礎二糖組成單元△ⅣA、△ⅣS、△ⅡA、△ⅢA、△ⅡS、△ⅢS、△ⅠA、△ⅠS，含1.6結構組分△ⅠS（1，6），△ⅠS-ⅠSid（1，6），三糖結構△ⅠS-ⅠdoA2S，四糖結構△ⅡA-ⅡSglu，糖醛酸2-

O-

脫硫酸翻轉產物△ⅡSgal檢測結果

RSD

值均＜10%，認為結構組成均未發(fā)生變化。所以依諾肝素鈉以本文方式常溫保存12個月，雙糖結構不會發(fā)生變化。

表9 依諾肝素鈉雙糖檢測結果
Tab 9 Enoxaparin sodium disaccharide

依諾肝素鈉△ⅣA△Glyserox1△ⅣSgal△ⅣS△ⅡA△ⅢA △ⅡSgal △ⅡS△ⅢS△ⅠS（1，6）△ⅠA△ⅡA-ⅣSglu△ⅠS△ⅡA-ⅡSglu△ⅠS-ⅠdoA2S△ⅠS-Ⅰsid（1.6）干品 2.27 0.45 0.36 3.05 3.81 1.88 1.35 10.61 6.72 1.36 1.53 0.42 59.45 2.22 1.05 1.18保存10日 2.43 0.39 0.29 2.76 3.58 1.57 1.29 9.80 6.82 1.24 1.56 0.46 62.38 2.49 1.01 1.20保存20日 2.26 0.41 0.34 2.81 3.79 1.82 1.23 10.18 6.30 1.32 1.56 0.45 62.23 2.48 1.02 1.06保存30日 2.42 0.41 0.33 2.65 3.76 1.64 1.49 10.60 6.89 1.37 1.56 0.53 60.83 2.42 1.12 1.29保存3個月 2.33 0.42 0.34 2.72 3.76 1.69 1.37 9.90 6.50 1.37 1.57 0.50 61.23 2.46 1.18 1.41保存6個月 2.24 0.40 0.34 2.70 3.42 1.81 1.26 10.02 6.83 1.32 1.63 0.51 62.18 2.48 1.08 1.28保存9個月 2.19 0.42 0.22 2.70 3.81 1.61 1.29 10.04 6.49 1.31 1.72 0.46 62.94 2.45 0.99 1.30保存12個月 2.13 0.10 0.28 2.60 3.35 1.59 1.45 10.78 6.94 1.39 1.58 0.52 61.98 2.49 1.24 1.11平均值 2.29 － － 2.71 3.64 1.68 1.34 10.19 6.68 1.33 1.60 － 61.97 2.47 1.09 1.24 RSD/% 5.0－－2.55.26.17.4 3.63.73.83.7－1.21.08.6 9.8

4 結論

本文提供了一種新的多糖類藥物保存方式，并研究了產品在此狀態(tài)下允許的保存時限問題，解決了企業(yè)生產肝素鈉及低分子肝素過程中產品因突發(fā)事件或設備故障導致滯留而又無法以干燥固體粉末狀態(tài)進行儲存和轉運的問題。取12個月內樣品，檢測其分子量、效價及結構雙糖方面，并與相應干燥粉末狀態(tài)檢測數(shù)據(jù)進行對比，我們確認將多糖類肝素產品使用有機溶劑（甲醇、乙醇、丙酮）從其溶液中分離，除盡上清并使用乙醇進行液封，隔離空氣，15～25℃環(huán)境下進行保存，12個月內其分子量、效價及雙糖結構不會發(fā)生變化。但是在考察過程中發(fā)現(xiàn)，6個月后，肝素鈉、達肝素鈉和依諾肝素鈉有輕微程度的顏色加深現(xiàn)象，如果后續(xù)工藝沒有氧化步驟，建議將保存時間控制在6個月內。本文考察的保存溫度在15～25℃，接近車間真實生產環(huán)境溫度，增加了此保存方式的適用性。不同肝素制劑的保存通常建議在30℃以下或陰涼處，較低的溫度能增加產品的穩(wěn)定性。如果條件允許，將肝素濕品沉淀貯藏于2～8℃環(huán)境低溫冷藏庫，將更有益于產品的長時間保存。