王 碩，趙港伊，史天樂，吳思凡，閆倩穎，韓勝芳，王冬梅

(華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北農業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001)

小麥(TriticumaestivumL.)為禾本科小麥屬，是我國重要的糧食作物，其易發(fā)生多種病害，從而影響產量。其中，葉銹病作為禾谷類銹病中常見的一類病害，是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina，Pt)侵染小麥引起的真菌性病害，葉銹病分布范圍廣、發(fā)生普遍，可導致小麥大幅減產，嚴重時甚至可達40%[1]。

當病原菌入侵植物時，寄主會通過產生過敏性反應 (Hypersensitive response，HR)來抑制病原菌在體內的生長。在不親和組合中，小麥利用HR抵抗葉銹菌侵染，通過與葉銹菌吸器母細胞(Haustorium mother cell，HMC)接觸的寄主細胞快速死亡，限制葉銹菌的繁殖和擴展[2]。這個過程與寄主體內一系列生理生化指標的變化有關，其中，活性氧(ROS)爆發(fā)作為HR的特征性反應，參與了植物抵抗病原菌侵染的早期防衛(wèi)反應[3]。由于ROS過度積累會對植物細胞造成損害，抑制植物生長，所以植物需要清除過多的活性氧以維持活性氧代謝平衡。

褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)自1995年在植物中被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)被證實在植物中發(fā)揮多種生理作用，包括可以促進植物的生長發(fā)育，在植物中發(fā)揮抗氧化作用，提高植物的抗病能力等[4-5]。其中，褪黑素作為一種保護劑抵抗各種生物和非生物脅迫被人們大量研究[6]。褪黑素的防御機制主要歸因于其維持細胞H2O2濃度保持平衡以及調節(jié)抗氧化酶活性的能力。抗氧化酶作為清除ROS的重要成員，在調節(jié)植物體內ROS濃度方面發(fā)揮關鍵作用[7]。植物通過抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS提高細胞的抗氧化能力，從而提高植物耐脅迫能力，其變化在寄主抗病性表達中發(fā)揮著重要作用[8]。褪黑素還可以通過褪黑素受體及其下游信號轉導途徑發(fā)揮信號分子的作用[9]。

目前，褪黑素是否在小麥與葉銹菌互作中參與活性氧的清除尚未見報道。本研究通過對小麥葉片外源注射褪黑素后，利用DAB染色觀察H2O2積累，利用Rohringer染色檢測HR面積大小，通過對小麥過氧化物酶和過氧化氫酶活性的測定來探究外源注射褪黑素對小麥抗氧化能力的影響，旨在明確褪黑素在小麥與葉銹菌互作中的作用，為進一步闡明其作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

小麥品種洛夫林10(簡稱L10)，小麥葉銹菌生理小種260，均由河北省植物生理與分子病理學重點實驗室長期繁育保存。小麥葉銹菌生理小種260與L10組成不親和組合。L10幼苗在鏑燈照射，光照強度為400 W/m2，光照周期14 h/d，晝夜溫度24 ℃/20 ℃的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗第一片真葉完全展開時，以第一片葉作為試驗材料，用于藥物注射及接種處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 褪黑素最佳處理濃度確定 通過預備試驗確定褪黑素(Melatonin，MT)最佳濃度。將試驗分為對照組和試驗組。當L10的第一片真葉完全展開時，將50 μmol/L甲基紫精(Methylviologen，MV)溶液注射到L10葉片上，同時將濃度分別為0，10，20，100 μmol/L的褪黑素溶液注射到L10葉片上，以單獨注射甲基紫精的葉片作對照。分別于注射后8，16，24，48 h取樣進行DAB染色處理，觀察H2O2的含量變化，從而確定MT的最佳試驗濃度，以該濃度進行后續(xù)試驗。

1.2.2 H2O2的DAB染色 DAB與細胞內的H2O2在過氧化物酶作用下可生成黃褐色或者紅褐色的顯色物質，通過顏色深淺判斷H2O2的含量多少。

本試驗用最佳濃度的褪黑素注射L10葉片褪黑素處理組(Melatonin treatment group，MT組)，并接種葉銹菌生理小種260。對照組(Control group，CK組)只接種葉銹菌生理小種260。每組試驗設置3個重復。對各種不同處理的試驗材料在接種后不同時間點12，24，48 h進行取樣，參考Hans等[10]的染色方法對細胞DAB染色進行觀察。

1.2.3 小麥葉片Rohringer熒光染色 將L10葉片接種葉銹菌生理小種260，取接種后24，48，72 h的葉片剪成1.5 cm長的片段，放于小瓶中，采用Rohringer[11]描述的熒光染色方法對細胞HR反應進行熒光觀察和分析。

1.2.4 過氧化物酶和過氧化氫酶活性的測定 過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[12]。以每分鐘反應體系在470 nm波長處吸光度增加1為一個酶活單位(U)。

過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性的測定采用紫外吸收法[12]。在240 nm波長處的吸光值每分鐘減少0.01為一個酶活單位(U)。

2 結果與分析

2.1 褪黑素最佳處理濃度

將50 μmol/L的MV以及10，20，100 μmol/L等不同濃度梯度的褪黑素先后分別注射小麥葉片，其中，只注射MV的葉片為對照組，其余為試驗組，并于注射后8，16，24，48 h對上述各組取樣，進行DAB染色，制片后分別在顯微鏡下觀察，DAB染色結果如圖1所示。

圖1 不同濃度褪黑素對甲基紫精誘發(fā)產生H2O2的清除作用Fig.1 Scavenging effect of melatonin with different concentrations on H2O2 induced by methyl viologen

甲基紫精作為一種氧化劑誘發(fā)產生超氧陰離子，可以有效增加活性氧的含量，本實驗室前期工作表明，50 μmol/L是最佳的甲基紫精注射濃度。注射甲基紫精后，小麥葉片的H2O2含量在16 h出現(xiàn)明顯上升，24 h L10葉片內的H2O2含量最多，48 h H2O2的含量逐漸下降。同時發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過不同濃度的褪黑素注射處理后，小麥葉片中的H2O2含量減少，表明褪黑素可以起到清除H2O2的作用。其中，10，20，100 μmol/L對H2O2的清除效果相差不大，為避免藥品濃度過大傷害到植物本身及節(jié)約藥品的原則，選取10 μmol/L作為后續(xù)試驗的最佳作用濃度。

2.2 外源褪黑素對小麥與葉銹菌互作過程中H2O2的影響

小麥葉片先注射10 μmol/L褪黑素，后接種葉銹菌生理小種260，以此作為試驗組。對照組不注射褪黑素，二者同時接種葉銹菌生理小種260，并于接種后12，24，48 h對2組葉片取樣，進行DAB染色，觀察H2O2的變化及分布特征。

DAB染色結果顯示(圖2)，與對照組相比，同一時間點試驗組的L10小麥葉片中的H2O2含量更少，說明外源性的褪黑素能夠有效清除L10與葉銹菌生理小種260互作中產生的H2O2。

圖2 外源注射褪黑素小麥葉片的DAB染色觀察Fig.2 DAB staining observation of wheat leaves injected with melatonin

2.3 注射褪黑素后小麥HR細胞染色分析

HR是植物抗病性的一種典型表現(xiàn)，在植物對真菌、細菌、病毒等多種病原物的抗病反應中都可以觀察到寄主細胞發(fā)生HR的現(xiàn)象。經(jīng)10 μmol/L褪黑素注射處理及接種葉銹菌生理小種260后，于24，48，72 h取樣，并采用Rohringer 染色，通過觀察HR的產生面積以明確褪黑素是否參與小麥的抗病機制。

L10接種葉銹菌生理小種260后不同時間觀察細胞發(fā)生HR的情況，發(fā)現(xiàn)HR細胞經(jīng)染色后呈現(xiàn)亮黃色(圖3)。Rohringer 染色結果表明，試驗組與對照組的L10葉片在接菌后24 h開始出現(xiàn)HR，

圖3 外源注射褪黑素的小麥HR細胞染色觀察Fig.3 Observation on HR cell staining of wheat injected with melatonin

其中試驗組葉片的HR面積明顯小于對照組。在L10與葉銹菌生理小種260互作后期，HR面積大量增加，在10 μmol/L褪黑素的作用下，試驗組L10的HR面積小于對照組(圖4)，從而進一步證明外源性的褪黑素能夠減小HR面積，增強小麥對葉銹菌的抗性。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).The same asFig.5.

2.4 外源褪黑素對小麥抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶是植物活性氧代謝中重要的清除酶之一。接種葉銹菌后POD活性呈先上升后下降趨勢(圖5-A)，在接種24 h達到最高峰，其中，與對照組相比，試驗組POD活性顯著提高，說明外源注射褪黑素處理可促進POD活性的上升，并延緩其活性的下降。圖5-B顯示，小麥接種葉銹菌后的8～24 h，試驗組的CAT活性顯著高于對照組，說明褪黑素處理促進了早期CAT活性的上升(圖5-B)。通過對以上2種抗氧化酶活性的測定結果進行分析，用褪黑素處理后的酶活性會大幅提高，表明褪黑素可通過提高植物的抗氧化能力增強植物的抗逆性。

圖5 注射褪黑素對小麥葉片POD(A)、CAT(B)活性的影響Fig.5 Effects of melatonin injection on POD(A)and CAT(B)activities in wheat leaves

3 結論與討論

20世紀50年代，褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)被首次發(fā)現(xiàn)在牛松果體中具有調節(jié)動物晝夜節(jié)律和季節(jié)性繁殖[13]等功能，在這之后又在其他動物、細菌、以及植物[14]中被發(fā)現(xiàn)。作為最近二十幾年在植物中發(fā)現(xiàn)的一種吲哚類激素物質，褪黑素一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到了許多研究學者的關注。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在植物抗非生物脅迫上發(fā)揮重要作用，可以提高植物抗重金屬、紫外輻射、低溫、干旱、鹽脅迫的能力[15]。

隨著研究的深入，不斷有研究表明，褪黑素不僅參與植物抵抗非生物脅迫的過程，還參與植物抵抗生物脅迫，通過多種防御機制誘導植物產生防御反應。在植物-真菌相互作用體系中，外源施用0.05～0.50 mmol/L褪黑素可調節(jié)抗氧化酶[16]和植物防御相關酶的活性[17]，提高植物對蘋果褐斑病(一種真菌性病害)的抗性。褪黑素可以通過調節(jié)H2O2的生成和茉莉酸信號機制，在番茄果實對灰葡萄孢菌的抗性中發(fā)揮積極作用[18]。在對西瓜的白粉病研究中發(fā)現(xiàn)，通過改變與ETI和PAMP介導的防御相關基因的表達，褪黑素積累的增加可增強植物對葉片病原體的抗性[19]。褪黑素還可以通過清除受侵染水果中與防御相關的ROS來降低指狀青霉引起的柑橘果實綠霉病的抵抗力[20]。在外源褪黑素對番茄果實采后灰霉病的研究中發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素提高了硒對番茄采后灰霉病防治的效果。試驗證明，外源褪黑素和硒復合誘導果實能顯著抑制灰霉病的病斑擴展[21]。同樣地，通過褪黑素對小豆抗銹性的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度(11.61 mg/L)褪黑素可使得小豆對銹病的抗性顯著提升。在病菌入侵小豆的時期，經(jīng)過褪黑素處理后的小豆，其NPR1基因表達量有明顯增加。另外，在病菌擴展階段PR基因也被發(fā)現(xiàn)有顯著的高表達[22]。

本試驗小麥與葉銹菌互作的體系中，發(fā)現(xiàn)在小麥抵抗葉銹菌的侵染過程中，植物體內產生的大量活性氧，可使細胞膜遭受破壞和代謝紊亂，嚴重時導致細胞死亡。外源注射褪黑素能夠有效清除L10與葉銹菌生理小種260互作中產生的H2O2。此外，L10接種葉銹菌生理小種260后植株出現(xiàn)HR反應，注射褪黑素減小了HR面積，一定程度上說明褪黑素能夠增強小麥對逆境脅迫時的抗性。同時，褪黑素可提高POD、CAT的活性，表明褪黑素可通過增強抗氧化酶活性發(fā)揮抗氧化作用，從而維持細胞ROS平衡，對各種脅迫進行最佳防御反應。

本試驗證明了褪黑素對小麥與葉銹菌互作中產生的H2O2具有清除作用，參與小麥與葉銹菌的互作過程，對于小麥抵抗葉銹菌的脅迫研究具有積極意義。

盡管已經(jīng)有不少對于褪黑激素相關防御信號網(wǎng)絡的研究，但仍有必要對該通路中的某些上游組件進行研究。當AtPMTR1作為植物褪黑素的第一個受體在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)后，這一方向研究空白開始被填補[7，23]。在葉銹菌和小麥互作的體系中，褪黑素介導的信號通路還值得進一步深入研究。