鄭玉斯，王 培，郭 穎，白麗蓉，喻達輝，趙 森

(北部灣大學 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西 欽州 535011)

海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是北部灣海域的特色經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)之一，合浦珠母貝(Pinctadafucata)作為培育海水珍珠的主要貝種，近年來由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化和病害增多等因素，使得合浦珠母貝在人工養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，造成珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，這一情況嚴重制約了合浦珠母貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。養(yǎng)殖環(huán)境的惡化會造成貝類免疫力降低，同時解決病害問題也需要激活合浦珠母貝自身的免疫功能來發(fā)揮作用，所以對合浦珠母貝機體的免疫機制研究就顯得特別重要。貝類屬于無脊椎動物中的軟體動物門，與脊椎動物不同，由于其缺乏適應(yīng)性免疫，主要依靠先天免疫來防御各種病原體[2]。其中，識別抗原分子是機體先天免疫發(fā)生起始的關(guān)鍵，之后才能將識別后的信號傳遞到下游通路從而激活免疫應(yīng)答[3]。這種識別是由一種或多種病原譜模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)來完成，它們可以識別并結(jié)合那些微生物表面保守而在宿主中不存在的特定的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)[4]，例如細菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂蛋白、鞭毛蛋白和核酸結(jié)構(gòu)等，即PRRs與PAMPs結(jié)合后能夠檢測非自身分子并觸發(fā)機體免疫防御[5]。到目前為止，已經(jīng)有不少學者對PRRs家族進行了鑒別和研究。其中，C型凝集素是PRRs家族中的研究熱點，它在軟體動物先天免疫反應(yīng)中參與非自身分子識別過程[6-9]。

C型凝集素是一種鈣離子依賴的糖結(jié)合蛋白，參與多種免疫相關(guān)和其他生理功能。它通過與靶細胞中的糖基化分子表面的多糖進行糖特異性結(jié)合，在病原體識別和細胞間的相互作用中發(fā)揮重要作用[10]。C型凝集素有一個典型的結(jié)構(gòu)域，命名為C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)或碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(Carbonhydrate-recognition domain，CRD)，它與微生物中存在的碳水化合物有很強的親和力[11]。通過這種特異性結(jié)合，C型凝集素能夠介導多種重要的細胞過程，包括白細胞黏附和快速刺激防御機制對抗有害微生物等[12]。到目前為止，已經(jīng)在軟體動物中鑒定了多種C型凝集素基因[13-15]。這些基因參與各種生物免疫過程，包括非自我識別、微生物凝集、吞噬作用和包裹作用的誘導以及抗菌特性[13]。例如長牡蠣(Crassostreagigas)的CgCLec-2在免疫識別中作為模式識別受體發(fā)揮作用，在病原消除后作為調(diào)節(jié)因子，并在補體系統(tǒng)的激活中發(fā)揮潛在作用[15]。此外，在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中鑒別了5個C型凝集素基因(CfLec-1～CfLec-5)，在海灣扇貝(Argopectenirradians)上發(fā)現(xiàn)了7個C型凝集素基因(AiCTL-1～AiCTL-7)，其中大部分凝集素只對某些特定的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌起作用[16]。最近，在菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)中也鑒定出2種C型凝集素(Vpclec-3和Vpclec-4)，它們作為模式識別受體具有明顯的識別譜，并可能參與菲律賓蛤仔對弧菌的天然免疫應(yīng)答[17]。以上研究結(jié)果顯示，雙殼類動物體內(nèi)的C型凝集素與病原體表面的碳水化合物有較強的親和力，在各種微生物感染的早期階段發(fā)揮著重要作用[18-19]。目前，在合浦珠母貝中已報道了PoLEC1[20]、PoLEC2[21]和PmLec-8[22]等C型凝集素的相關(guān)研究。雖然對C型凝集素基因家族中的部分成員進行了相關(guān)研究，由于海洋環(huán)境的復雜性，海洋生物在面對不同的病原微生物時的識別機制可能有所不同。因此，有必要進一步鑒定C型凝集素基因家族中其他成員并研究它們在抵抗病原微生物侵害方面所發(fā)揮的功能，旨在為更深入理解無脊椎動物的免疫機制奠定基礎(chǔ)，同時為我國水產(chǎn)貝類的綠色養(yǎng)殖提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用合浦珠母貝購自廣西北海市某珍珠養(yǎng)殖場，其殼長(47±5)mm、殼寬(15±3)mm、殼高(52±4)mm、體質(zhì)量(20±4)g。選取健康有活力的合浦珠母貝個體，分別采集鰓、外套膜、閉殼肌、足和肝胰腺等組織于液氮中冷凍后放至-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

使用的試劑TRIzol、TransScript?Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR、TransStart?Green qPCR SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、Trans5α Chemically Competent Cell購自北京全式金公司，SMARTer RACE 5′/3′Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和第一鏈cDNA合成 采用 TRIzol 法提取各組織RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用Little Lunatic高通量微流控全光譜分光光度計(美國Unchained Labs)檢測RNA濃度。 按照 TransScript?Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成 cDNA，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 全長cDNA克隆 從合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出C型凝集素基因的同源序列，利用Oligo軟件設(shè)計引物PfCLEC17A-F和PfCLEC17A-R(表1)，以合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達量最高的肝胰腺cDNA作為模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s 72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；反應(yīng)結(jié)束后所得PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并進行回收純化PCR產(chǎn)物。將回收后的目的DNA片段與pMD18-T質(zhì)粒連接后導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)菌落PCR確認的陽性克隆菌落送至廣州生工測序部進行測序驗證，測序結(jié)果使用軟件DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft，美國)進行拼接和序列比對。針對拼接正確的序列設(shè)計特異性引物，用SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa)進行RACE 擴增。首先，按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit試劑盒說明書合成3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA，以此cDNA為模板進行巢式PCR擴增，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認后，進行第2輪PCR，對目的條帶進行膠回收純化、連接轉(zhuǎn)化、挑選陽性菌并測序。

表1 PfCLEC17A擴增及表達所用引物Tab.1 Primers used in amplification and expression of PfCLEC17A

1.2.3 生物信息學分析 測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件分析后，在DNAMAN 8.0軟件上進行序列拼接，獲得合浦珠母貝PfCLEC17A基因的全長序列。利用NCBI ORF Finder在線工具查找開放閱讀框和預(yù)測編碼蛋白序列。采用ProtParam tool在線工具預(yù)測編碼蛋白的理化特性；使用 SignalP 3.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0)預(yù)測蛋白信號肽序列；采用 NetNGIys 1.0 預(yù)測糖基化位點；采用NetPhos 3.1預(yù)測蛋白磷酸化位點；采用 SMART 4.0 進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；使用SWISS-MODEL在線軟件進行同源建模，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；利用Expasy在線預(yù)測蛋白的親水性/疏水性；利用MegAlign分析序列同源性，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索不同物種的同源序列，使用Clustal 2.1和GENEDOC軟件進行多重序列比對；挑選出最具代表性物種的C型凝集素序列，使用MEGA 7.0 軟件的 Neighbor-joining法構(gòu)建進化樹。

1.2.4PfCLEC17A基因的熒光定量PCR分析 選取6只健康的合浦珠母貝并對其進行解剖，取鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、血液、足和肝胰腺等7個組織用于分析PfCLEC17A基因在不同組織中的表達情況。以麻醉后注射閉殼肌的方式對合浦珠母貝進行溶藻弧菌攻毒感染，在感染后的第0，1，3，6，12，24，48，72，96小時隨機采集6個合浦珠母貝的肝胰腺組織來分析PfCLEC17A基因的表達量變化，以注射0.1 mL PBS的個體作為空白對照組。所有樣品取下后立刻放于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。所有樣品的RNA提取和cDNA合成步驟如前所述。cDNA按照 1∶8稀釋后作為試驗?zāi)０澹瑓⒄杖浇鸸镜腡ransScript?Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進行熒光定量PCR分析，全程操作在冰上進行。每次試驗3個樣品，每個樣品進行3次重復。

1.2.5 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 熒光定量PCR結(jié)果使用 2-ΔΔCt法進行計算，分析PfCLEC17A基因在合浦珠母貝各組織以及溶藻弧菌刺激后各時間段內(nèi)的相對表達情況。計算結(jié)果使用 IBM SPSS Statistics 22 軟件中的LSD(最小顯著性差異)法進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PfCLEC17A基因的克隆與序列分析

通過分析合浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計PfCLEC17A-F和PfCLEC17A-R引物，擴增獲得Ctypelectin17A基因的中間片段，經(jīng)過測序驗證，該片段長度為534 bp(圖1-A)。采用5′-RACE技術(shù)進行巢式PCR得到RACE產(chǎn)物長度為150 bp(圖1-B)，經(jīng)測序驗證，除去和ORF重疊的堿基后得到5′ 非編碼區(qū)(Untranslation region，UTR) 為117 bp。用同樣的方法進行巢式PCR，得到3′-RACE產(chǎn)物長311 bp(圖1-C)，測序驗證后3′-UTR為48 bp。將所有測序序列進行拼接，得到PfCLEC17A基因全長為699 bp(圖2)。

DNA Marker為DL2000。The DNA Marker is DL2000.

雙下劃線.CLECT結(jié)構(gòu)域；陰影部分.信號肽區(qū)域；黃色陰影部分.二硫鍵；藍色陰影部分.糖基化位點。

2.2 PfCLEC17A的分子特征鑒定

生物信息學分析顯示，PfCLEC17A蛋白理論分子質(zhì)量為20.326 ku，理論等電點pI為6.11，預(yù)測前24個氨基酸為信號肽(圖2、圖3-A)，PfCLEC17A蛋白含有一個經(jīng)典的CLECT結(jié)構(gòu)域(圖3-B)，含有17個磷酸化位點，其中2個為Tyr、7個為Ser、8個為Thr位點，還有4個糖基化位點，分別位于N20、N85、N140和N142(圖2)。同時還預(yù)測到2對保守的二硫鍵(C16-C119和C93-C111)(圖2)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(準確度高于70%)顯示，PfCLEC17A蛋白由2個α-螺旋和10個β-折疊組成。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的3D模型如圖3-C所示。蛋白質(zhì)親水/疏水性分析結(jié)果顯示(圖3-D)，大部分氨基酸殘基的分值為負值(正值代表疏水性，負值代表親水性)，所以PfCLEC17A蛋白為親水性蛋白。

A.蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測；B.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測；C.蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；D.蛋白質(zhì)親水性/疏水性預(yù)測。A.Protein signal peptide prediction；B.Protein domain prediction；C.Protein tertiary structure prediction；D.Protein hydrophilicity/hydrophobicity prediction.

2.3 合浦珠母貝PfCLEC17A氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

氨基酸序列比對結(jié)果顯示，PfCLEC17A與其他物種的C型凝集素氨基酸序列的同源性在14.7%～87.9%。其中，與櫛孔扇貝的相似性最高，為87.9%，與紫貽貝的相似性次之，為61.3%，與高原鼠兔的相似性最低，為14.7%。利用ClustalW 2.1和GENEDOC軟件將PfCLEC17A蛋白與其他幾種貝類蛋白序列進行比對，結(jié)果顯示(圖4)，PfCLEC17A的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列具有部分相似的結(jié)構(gòu)，都含有形成二硫鍵的4個保守的半胱氨酸，糖結(jié)合位點幾乎都具有獨特的“EPN”結(jié)構(gòu)，但是在“WND”位點表現(xiàn)不一致，合浦珠母貝和櫛孔扇貝此位點為“WSD”基序，紫貽貝的則為“WDD”基序。

圖4 PfCLEC17A氨基酸序列比對Fig.4 PfCLEC17A amino acid sequence alignment

在MEGA 7.0中，以PfCLEC17A蛋白和其他物種的凝集素序列通過鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖5)，白頭海雕等幾種鳥類聚在一起，智人和高原鼠兔2種哺乳動物聚為一支，合浦珠母貝先與櫛孔扇貝聚在同一分支上，然后與其他軟體動物聚在一起。以上聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的分類方法相一致，也體現(xiàn)了PfCLEC17A在進化上的保守性。

圖5 CLEC17A氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis of CLEC17A

2.4 合浦珠母貝PfCLEC17A組織特異性表達分析

采用RT-qPCR方法檢測PfCLEC17A基因在合浦珠母貝鰓、外套膜、閉殼肌、肝胰腺、性腺、血細胞和足等不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示(圖6)，PfCLEC17A在所檢測的各組織中均有表達，但相對表達量存在顯著差異。在不同組織中的相對表達量大小表現(xiàn)為肝胰腺>鰓>閉殼肌>足>性腺>外套膜>血細胞(P<0.05)。

M.外套膜；B.血細胞；GO.性腺；F.足；A.閉殼??；GI.鰓；HE.肝胰腺。不同字母表示在不同組織中的相對表達量差異性顯著(P<0.05)。

2.5 溶藻弧菌感染后合浦珠母貝PfCLEC17A的表達量變化

熒光定量PCR分析結(jié)果顯示(圖7)，溶藻弧菌感染1 h后，PfCLEC17A表達水平較對照組顯著升高并達到最大值(圖7)，隨后表達量出現(xiàn)回落。除了1 h顯著上升(P<0.05)和第12，72小時外，在其他時間，溶藻弧菌感染后PfCLEC17A的相對表達量均低于注射PBS的對照組。由此可見，合浦珠母貝在受到病原微生物侵害初期，肝胰腺中PfCLEC17A基因會被迅速激活，但感染后期，其表達會受到一定程度的抑制。這可能與C型凝集素蛋白家族成員參與免疫激活的早期階段有關(guān)。

不同字母表示溶藻弧菌不同感染時間下的相對表達量有差異性顯著(P<0.05)。Different letters indicate significant differences in relative expression at different time after challenged with V.alginolyticus(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

C型凝集素是一類含有鈣離子依賴糖識別域的蛋白超家族，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可以分為17個亞家族，每個成員都有其特有的結(jié)構(gòu)和功能[23-25]，除了一些C型凝集素(NK細胞受體家族)沒有經(jīng)典的CRD結(jié)構(gòu)域以外，大多數(shù)的C型凝集素受體都是聚糖結(jié)合受體，都含有一個或多個CRD識別域[26-27]。本研究獲得C型凝集素第17個亞家族成員A的序列，其開放閱讀框長534 bp，編碼178個氨基酸殘基，含有一個經(jīng)典CRD碳水化合物識別域，有17個磷酸化位點，其中2個Tyr、7個Ser和8個Thr位點。C型凝集素根據(jù)參與聚糖識別和鈣離子配位的氨基酸基序不同可分為甘露糖基序(EPN，Glu-Pro-Asn)和半乳糖基序(QPN，Glu-Pro-Asp)兩類[27]。CLEC17A蛋白中存在EPN和WND 2個糖結(jié)合基序，其對甘露糖和Ca2+具有高度特異性[28]。本研究從合浦珠母貝中獲得的PfCLEC17A氨基酸序列中含有EPN和在WSD這2種基序。因為EPN基序僅存在于膠原凝集素和選擇凝素中[29-30]，推測PfCLEC17A可能是一種膠原凝集素或選擇凝集素。據(jù)報道，第2個基序在脊椎動物中一直是Trp-Asn-Asp(WND)，WND也在部分無脊椎動物C型凝集素中存在。第2個基序在軟體動物中表示出多樣性，目前已有10多個基序被報道，例如WND、Trp-Ile-Asp(WID)、Trp-Ser-Asp(WSD)、Trp-His-Asp(WHD)、Phe-Ser-Asp(FSD)和Leu-Ser-Asp(LSD)等[31-32]。其中EPN基序被認為是與碳水化合物特異性結(jié)合的關(guān)鍵開關(guān)，第2個基序(WSD)會增加這種結(jié)合的親和力和特異性[31-32]。此外，用軟件分析得到序列中含有4個糖基化位點，分別是N20、N85、N140和N142，N-連接糖基化位點可能在CLEC17A向細胞表面的運輸和定位中發(fā)揮生理作用[20]。

將合浦珠母PfCLEC17A氨基酸序列與其他物種進行同源比對分析并構(gòu)建進化樹，比對結(jié)果顯示，合浦珠母PfCLEC17A序列與櫛孔扇貝的序列相似性最高,為87.9%，與其他貝類相似性大部分在50%～60%，與其他物種序列同源性在10%～30%，與鼠兔的相似性最低僅為14.7%。進化樹分析結(jié)果顯示，合浦珠母PfCLEC17A與其他軟體動物親緣關(guān)系較近，與魚類鳥類的關(guān)系較遠。將合浦珠母與其他物種的CTL所編碼的氨基酸序列進行同源性和相似性比對，發(fā)現(xiàn)它們的同源性與相似性不高，僅凝集素特有的基序及功能位點基本保持一致。在其他貝類C型凝集素同源比較研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)論[33-35]，由此可見，C型凝集素是一類進化較快但功能位點保守的蛋白質(zhì)。

本研究檢測了PfCLEC17A基因在不同組織中的表達情況，在所檢測組織中均有表達，其中在肝胰腺中表達最高。目前，關(guān)于貝類CLEC17A基因的研究較少，但是關(guān)于貝類C型凝集素家族其他成員的研究已有相關(guān)報道，如馬氏珠母貝PmLec-8基因在各組織中均有表達，在肝胰腺中表達量最高，其次是鰓[22]；在海灣扇貝中，C型凝集素在肝胰腺中表達量最高，血淋巴表達量最低，在其他組織中均有所表達[36]；在關(guān)于菲律賓蛤仔[37]的研究中，6個C型凝集素基因分別在鰓和肝胰腺中顯著高表達。最近在菲律賓蛤蜊中鑒定了VpClec-3和VpClec-4共2種C型凝集素基因，它們在肝胰腺和鰓組織中均高水平表達[17]。以上研究顯示，C型凝集素在多種組織中表達，說明它在多種病原免疫反應(yīng)中扮演重要角色。但在不同物種的不同組織中表達量不盡相同，可能是由不同物種C型凝集素的分布及功能不同造成的。肝胰腺不僅是軟體動物的主要免疫器官，也是消化代謝最旺盛的器官，大多數(shù)免疫相關(guān)基因在肝胰腺中都有表達[37-38]。其次，鰓是軟體動物免疫防御的第一道防線，與外界廣泛接觸，對環(huán)境中的有害物質(zhì)起到一定過濾和抵御作用[39]，PfCLEC17A在合浦珠母貝的肝胰腺和腮中的相對表達量都很高，可能在機體抵御外界病原微生物入侵過程中發(fā)揮重要作用。

在溶藻弧菌刺激下，合浦珠母貝PfCLEC17A基因在肝胰腺中的表達量迅速升高，這與魁蚶Sb-Lec1基因[40]和文蛤Mm-CTL基因[41]的表達模式相同，說明C型凝集素基因的表達受微生物的誘導，合浦珠母貝PfCLEC17A基因參與機體的前期免疫應(yīng)答。但是，PfCLEC17A基因在接收病原菌刺激后如何將信號傳遞給下游分子并改變基因表達，這方面的工作還需進一步研究。本研究初步對PfCLEC17A基因功能進行了探索，為后續(xù)深入了解凝集素在合浦珠母貝免疫防御系統(tǒng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

本研究通過RACE技術(shù)獲得了PfCLEC17A基因的全長序列，并對其進行生物信息學分析，通過RT-qPCR技術(shù)檢測該基因在不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示，該基因在肝胰腺中表達量較高。進一步檢測溶藻弧菌刺激后合浦珠母貝肝胰腺中PfCLEC17A基因在不同時間段的變化情況，發(fā)現(xiàn)其在弧菌感染后表達量迅速上升并達顯著水平，以上結(jié)果表明，該基因分布廣泛，并在宿主和病原體相互作用的前期發(fā)揮重要作用。