楊亞文，高何璇，劉莉莉，包瑩瑩，何玉琴，楊志杰，陳衛(wèi)剛，葛聞博

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州銀行網(wǎng)絡(luò)金融部，甘肅 蘭州 730070；3.伊犁師范大學(xué) 生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 伊犁 835000；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730070)

甘加藏羊(Ovisarise)是甘南草地型藏羊的優(yōu)良地方類型之一，常年生活在2 800 m以上的高海拔地區(qū)，季節(jié)性發(fā)情(每年7—9月)，發(fā)情周期平均為(16 ± 2)d，每年產(chǎn)羔一次，一次一胎[1-2]。作為典型的季節(jié)性單次發(fā)情動物，較低水平的自然繁殖率與單次產(chǎn)羔是影響甘加藏羊群體數(shù)量的主要原因之一，嚴重影響了藏區(qū)畜牧業(yè)的良性發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，動物的季節(jié)性繁殖除了受到隨季節(jié)變化的光周期、氣溫、食物供應(yīng)等[3]原因的影響，繁殖相關(guān)基因的表達調(diào)控[4]也對發(fā)情起到重要作用。20世紀90年代，Lee等[5]在人黑色素瘤細胞株中首次發(fā)現(xiàn)了Kiss1基因，它能編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)移抑制素(Kisspeptin)。有研究表明，下丘腦中的Kisspeptin在與膜受體GPR54結(jié)合后，會刺激下游促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone， GnRH)的分泌[6-9]，從而間接調(diào)控動物的季節(jié)性繁殖。也有研究報道Kiss1/GPR54系統(tǒng)是動物青春期啟動和發(fā)展的關(guān)鍵[10]。在非繁殖季節(jié)給綿羊注射Kisspeptin可以使90%的綿羊反季節(jié)排卵，證實Kiss1/GPR54系統(tǒng)是啟動母羊季節(jié)性繁殖的關(guān)鍵因子[11]；Kiss1基因及其受體分布于多種組織器官，主要表達于下丘腦、垂體、胰腺、性腺、甲狀腺等組織當中。下丘腦-垂體-甲狀腺軸在調(diào)節(jié)生殖功能上起著重要作用，無論是甲狀腺功能異?；蚴亲陨砻庖咝约谞钕偌膊。鶗ι钞a(chǎn)生不利影響[12-14]。陳衛(wèi)剛[15]已對甘加藏羊發(fā)情周期下丘腦、垂體和卵巢組織中Kiss1/GPR54系統(tǒng)進行了詳細研究，但對于有調(diào)節(jié)動物季節(jié)性繁殖的視神經(jīng)、松果體和甲狀腺組織中、Kiss1/GPR54系統(tǒng)的表達及其生理調(diào)控等未見研究報道。

因此，本試驗以視神經(jīng)為切入點，從“松果體-下丘腦-垂體-甲狀腺軸”(Pineal-hypothalamus-pituitary-thyroid axis，PHPTA)著手，首次從基因和蛋白水平對甘加藏羊繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)視神經(jīng)、PHPTA組織中Kiss1、GPR54mRNA及其蛋白的表達分布以及血漿Kisspeptin含量的動態(tài)變化規(guī)律進行了研究，以期為進一步闡明Kiss1/GPR54系統(tǒng)對藏羊生殖活動的調(diào)控及其機理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 2019年7—9月(繁殖季節(jié))在甘肅省甘南州夏河縣甘加鄉(xiāng)羊場隨機選取24只2.5～3.5歲健康未孕的雌性甘加藏羊作試驗組，其中發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期各6只；5月(非繁殖季節(jié))隨機選取6只乏情期甘加藏羊作對照組。

1.1.2 頸靜脈采血 以公羊爬跨記為0 h，根據(jù)四期分法及母羊陰道涂片法跟蹤觀察2個發(fā)情周期，分別在發(fā)情期(第0～36小時)、發(fā)情后期(第39～72小時)、間情期(第4 ～13天)及發(fā)情前期(第14～16天)進行采樣。第一個周期采集血漿：頸靜脈采血，發(fā)情期每2 h采集1次，發(fā)情后期每3 h采集1次，其他時期7：00，19：00各采血1次，采血后迅速離心，吸取上清，置于-20 ℃保存。

1.1.3 組織采樣 第2個周期采集組織樣：將甘加藏羊頸動脈放血處死后，迅速打開顱腔及頸部取出完整的視神經(jīng)、松果體、下丘腦、垂體和甲狀腺，所得樣品平均分為2份，分別置于4%多聚甲醛溶液和液氮中，待返回實驗室后移至-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 血漿Kisspeptin檢測 根據(jù)綿羊吻素(Kisspeptin)ELISA 檢測試劑盒(北京，奇松)說明書并設(shè)置3次重復(fù)，測定血漿Kisspeptin的OD值。根據(jù)標準品的OD值以及相對應(yīng)的濃度繪制標準曲線，得到Kisspeptin的回歸方程y=0.001x+0.132 9(R2=0.996 8)，其中y表示OD值，x表示濃度。根據(jù)回歸方程計算得到不同時期Kisspeptin的濃度。用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計血漿中Kisspeptin不同時期的濃度，并分析顯著性。

1.2.2 視神經(jīng)、PHPT軸中Kiss1、GPR54mRNA檢測 NCBI 網(wǎng)站查找Kiss1、GPR54相對應(yīng)CDS序列，利用 Premier 5.0設(shè)計引物，由擎科生物合成(表1)。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primer of qRT-PCR

TransZol UP RNA 提取試劑盒(北京，全式金)提取視神經(jīng)、松果體、下丘腦、垂體、甲狀腺中的總RNA，迅速檢測RNA濃度，使用反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒(湖南，艾克瑞生物)在20 μL的體系中進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ苑崔D(zhuǎn)錄的cDNA為模板，設(shè)置溫度梯度測定退火溫度。然后進行qRT-PCR，總體系為 20 μL ，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)40次。所得相關(guān)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法進行計算，每個基因相對表達量均以內(nèi)參基因為基準進行校正。所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析。

1.2.3 視神經(jīng)、PHPT軸中Kisspeptin、GPR54 蛋白檢測 液氮中充分研磨組織，加RIPA裂解液(北京，索萊寶)和蛋白酶抑制劑(北京，索萊寶)，反復(fù)凍融使其充分裂解，振蕩離心，取上清，提取組織總蛋白。PCR儀(上海，普迪)進行蛋白變性(98 ℃，10 min)，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｖ苽?2%分離膠和5%濃縮膠后，以8 μL上樣量進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢對照Marker預(yù)染條帶，裁剪對應(yīng)條帶：Kisspeptin(16 ku)、GPR54(44 ku)、β-actin(42 ku)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至0.45 μm的PVDF膜(北京，索萊寶)上，PBST(PBS+Tween 20)(北京，索萊寶)洗膜10 min后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育一抗Kisspeptin、GPR54(1∶ 1 000)，β-actin(1∶4 500)，4 ℃過夜。PBST洗膜2 h，37 ℃二抗孵育(1∶4 500)1 h，PBST洗膜2 h，暗室曝光顯影。Image J圖像分析系統(tǒng)進行灰度值分析，SPSS 22.0軟件進行差異性分析。

1.2.4 視神經(jīng)、PHPT軸Kisspeptin、GPR54免疫組織化學(xué)染色 將提前用4%多聚甲醛固定好的組織進行石蠟包埋、切片、脫蠟處理后，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，用SP免疫組化檢測試劑盒(北京，博奧森)進行試驗。Kisspeptin和GPR54抗體(北京，博奧森)以1∶350稀釋，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 代替一抗作陰性對照，4 ℃ 孵育過夜，然后與二抗(北京，博奧森)37 ℃反應(yīng)15 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(北京，博奧森)顯色，脫水透明后中性樹膠封片。利用正置光學(xué)顯微鏡BX51-DP71(日本，麥克奧迪)觀察并拍照，Kisspeptin和 GPR54 陽性部位呈現(xiàn)棕色。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘加藏羊血漿Kisspeptin含量動態(tài)變化

由圖1可知，甘加藏羊血漿Kisspeptin在整個發(fā)情周期呈波動式和脈沖式交替分泌，乏情期整體激素水平低于發(fā)情周期；Kisspeptin在發(fā)情開始第12 小時達到第一個峰值(172.53±1.91)pg/mL，發(fā)情后期開始激素水平急劇上升，在第36，39小時達到第2和第3個峰值；發(fā)情周期內(nèi)，Kisspeptin在發(fā)情后期的平均激素水平最高(122.13±2.18)pg/mL，間情期最低(114.38±25.31)pg/mL；乏情期激素水平大幅下降，平均含量僅達到(92.71±16.10)pg/mL。

A.發(fā)情期(0～36 h)和發(fā)情后期(39～72 h)；B.間情期(4 dM～13 dN)、發(fā)情前期(14 dM～16 dN)和乏情期(F)；N.晚；M.早。A.Estrus(0—36 h)and metestrus(39—72 h)；B.Diestrus(4 dM—13 dN)，proestrus(14 dM—16 dN)and anestrus(F) ；N.Night ；M.Morning.

2.2 甘加藏羊視神經(jīng)、PHPT軸中Kiss1 、GPR54 mRNA的表達分析

由圖2可知，視神經(jīng)Kiss1mRNA的相對表達量整體呈下降趨勢，并在發(fā)情后期降到谷底。松果體Kiss1mRNA的相對表達量在發(fā)情后期最高，間情期最低，其余各時期基本無太大波動。下丘腦、甲狀腺中的Kiss1mRNA在發(fā)情周期內(nèi)逐步升高，均在發(fā)情后期達到頂峰，顯著高于其他時期(P<0.05)。垂體Kiss1mRNA相對表達量在發(fā)情期就達到峰值。

同一組織不同時期間進行顯著性分析，不同小寫字母表示不同時期間差異顯著(P<0.05)。圖4同。Significance analysis was conducted in different periods of the same organization, and different lowercase letters indicated significant differences in different periods(P<0.05).The same asFig.4.

視神經(jīng)GPR54mRNA相對表達量在發(fā)情前期最高，顯著高于其他時期(P<0.05)；垂體組織Kiss1、GPR54mRNA相對表達量在發(fā)情期顯著高于其他時期(P<0.05)；松果體、下丘腦和甲狀腺三者GPR54mRNA表達模式相同，均在發(fā)情后期達到峰值，顯著高于其余時期(P<0.05)。

2.3 甘加藏羊視神經(jīng)、PHPT軸中Kisspeptin、GPR54 蛋白含量分析

由圖3，4可知，視神經(jīng)組織Kisspeptin蛋白含量在發(fā)情后期達到峰值；在乏情期，松果體Kisspeptin高于發(fā)情周期各時期，其中間情期顯著高于發(fā)情期和發(fā)情后期(P<0.05)；下丘腦Kisspeptin蛋白含量在乏情期最高，發(fā)情前期表達量顯著高于其他3個時期(P<0.05)；垂體Kisspeptin蛋白含量在間情期達到峰值，顯著高于其他時期(P<0.05)；甲狀腺Kisspeptin蛋白含量在發(fā)情前期和發(fā)情期差異不顯著(P<0.05)，發(fā)情后期和間情期差異不顯著(P<0.05)，但均顯著高于乏情期(P<0.05)。

A.視神經(jīng)；B.松果體；C.下丘腦；D.垂體；E.甲狀腺。A.Optic nerve；B.Pineal body；C.Hypothalamus；D.Pituitary body；E.Thyroid gland.

圖4 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期視神經(jīng)、PHPT軸組織中Kisspeptin、GPR54蛋白相對表達量Fig.4 Optic nerve and PHPT axis tissues in estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep relative expression levels of Kisspeptin and GPR54 proteins

視神經(jīng)GPR54蛋白含量總體呈下降趨勢，在整個發(fā)情期內(nèi)變化不大，其中間情期降到谷底；松果體、下丘腦GPR54均在間情期蛋白含量最高，顯著高于其他時期(P<0.05)；垂體組織GPR54蛋白含量在發(fā)情前期最高，并隨發(fā)情周期逐漸減少；甲狀腺GPR54蛋白含量在發(fā)情前期最高，顯著高于其余時期(P<0.05)。

2.4 甘加藏羊視神經(jīng)、PHPT軸中Kisspeptin、GPR54免疫陽性產(chǎn)物分布表達

甘加藏羊發(fā)情周期視神經(jīng)、松果體、下丘腦、垂體、甲狀腺中均有Kisspeptin和GPR54蛋白表達。視神經(jīng)中，Kisspeptin陽性著色主要在神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞核中(圖5-A)，GPR54主要在神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中(圖5-B)；松果體中，Kisspeptin和GPR54主要表達在松果體細胞胞質(zhì)中(圖5-C、D)，呈棕黃色強陽性表達，胞核中也有少量表達；下丘腦組織中，Kisspeptin在促垂體區(qū)的神經(jīng)內(nèi)分泌小細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中呈強陽性表達(圖5-E)，GPR54主要在神經(jīng)內(nèi)分泌小細胞的胞質(zhì)中表達(圖5-F)；垂體組織中，Kisspeptin和GPR54主要表達在嗜堿性細胞的胞質(zhì)中(圖5-G、H)；甲狀腺組織中，Kisspeptin和GPR54主要表達在甲狀腺濾泡細胞胞質(zhì)中(圖5-I、J)。

1.神經(jīng)膠質(zhì)細胞；2.松果體細胞；3.神經(jīng)細胞；4.神經(jīng)細胞核；5.嗜酸性細胞；6.嗜堿性細胞；7.嫌色細胞；8.濾泡上皮細胞；9.濾泡膠質(zhì)；10.濾泡旁細胞。1.Glial cell；2.Pineal body cell；3.Neuron；4.Nerve nucleus；5.Eosinophilic cell；6.Basophilic cell ；7.Chromophobe；8.Follicular epithelial cell；9.Follicular glial cell；10.Parafollicular cell.

3 結(jié)論與討論

3.1 甘加藏羊血漿Kisspeptin動態(tài)變化和發(fā)情周期的關(guān)系

動物的季節(jié)性發(fā)情不僅受到光照、溫度和營養(yǎng)等因素的影響，基因調(diào)控也是非常重要的原因之一[4]。研究表明，Kiss1及其受體GPR54廣泛參與到動物的季節(jié)性發(fā)情調(diào)控中。作為Kiss1基因的水解產(chǎn)物之一，Kisspeptin會在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞末梢調(diào)控GnRH的分泌。有研究報道[11]，Kisspeptin在母羊非繁殖季節(jié)的含量遠低于繁殖季節(jié)，這與本研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果顯示，甘加藏羊發(fā)情周期各時期血漿Kisspeptin含量呈現(xiàn)脈沖式和波動式交替變化，出現(xiàn)多個波峰和波谷，且在發(fā)情周期內(nèi)血漿Kisspeptin含量遠高于乏情期含量，表明發(fā)情周期內(nèi)高濃度的Kisspeptin是參與甘加藏羊季節(jié)繁殖生殖活動調(diào)控的因子之一。

研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin與GnRH的分泌改變具有同步性，在與其神經(jīng)元表面的GPR54結(jié)合后，可對后者形成正向反饋作用[16]。葛聞博等[17]在研究甘加藏羊發(fā)情周期GnRH分泌規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，甘加藏羊血漿GnRH從發(fā)情前期開始升高，在發(fā)情后期達到峰值后開始下降，間情期最低。史軍紅等[18]認為，哺乳動物的發(fā)情周期內(nèi)每個卵泡波的出現(xiàn)都伴隨著1個促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體素(Luteinizing hormone，LH)分泌峰，而血漿GnRH會正向促進FSH和LH的分泌。Jayasena等[19]也證實了這一點。在本試驗結(jié)果中，Kisspeptin分泌量在間情期最低，從發(fā)情前期開始，呈上升趨勢，至發(fā)情后期達最高值，在第16 天達到一個明顯峰值，后在發(fā)情期(第12 小時)、發(fā)情后期(第36，39 小時)、間情期(第4，6，9 天)也出現(xiàn)明顯峰值。這與葛聞博等[17]關(guān)于GnRH的分泌趨勢研究結(jié)果相一致，但二者出現(xiàn)峰值的時間點不同，后者存在一定時間延遲，表明Kisspeptin可能通過促進GnRH的分泌參與到甘加藏羊的季節(jié)性繁殖中。

3.2 甘加藏羊視神經(jīng)、PHPT軸中Kiss1、GPR54 表達變化及其對繁殖的影響

Kiss1、GPR54作為繁殖相關(guān)調(diào)控基因在人、綿羊、大鼠、小鼠、母豬等[20-25]哺乳動物體內(nèi)廣泛表達，Tena-Sempere[26]在研究Kiss1/GPR54對人生殖系統(tǒng)的影響時發(fā)現(xiàn)，Kiss1、GPR54均會在人下丘腦中離散分布，且GPR54還在甲狀腺、腦垂體中特異表達，其中腦垂體含量最高。Um等[27]在研究魚類和哺乳動物Kiss1和GPR54基因的表達時發(fā)現(xiàn)，Kiss1主要分布在大鼠、小鼠、羊的下丘腦中，母豬的下丘腦、垂體、卵巢中也有Kiss1和GPR54mRNA的表達。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘加藏羊的視神經(jīng)、松果體、下丘腦、垂體、甲狀腺組織中均檢測到Kiss1、GPR54mRNA及其蛋白的表達，且不同組織在不同時期有顯著差異。陳衛(wèi)剛[15]通過免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)甘加藏羊Kisspeptin、GPR54的陽性產(chǎn)物主要存在于下丘腦的促垂體區(qū)和垂體中的嗜堿性細胞中，這與本研究結(jié)果一致。本試驗Kisspeptin主要表達在神經(jīng)膠質(zhì)細胞、松果體細胞胞質(zhì)、下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌小細胞、垂體嗜堿性細胞胞質(zhì)以及甲狀腺濾泡細胞胞質(zhì)中，GPR54主要表達在神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞質(zhì)、松果體細胞、下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌小細胞胞質(zhì)以及甲狀腺濾泡細胞胞質(zhì)中。發(fā)情周期Kiss1、GPR54在不同組織的分布及差異性表達表明，Kiss1/GPR54系統(tǒng)可能參與調(diào)控甘加藏羊的季節(jié)性發(fā)情。

哺乳動物視網(wǎng)膜在接收到不同季節(jié)的光信號后經(jīng)視神經(jīng)傳導(dǎo)，會刺激松果體發(fā)生節(jié)律性釋放褪黑素，直接或間接影響Kiss1的表達，繼而調(diào)控GnRH的表達[28]。本研究結(jié)果與之一致，當甘加藏羊處在發(fā)情周期內(nèi)時，視神經(jīng)Kiss1、GPR54mRNA相對表達量在發(fā)情前期就顯著高于其他時期，這可能是短日照致使藏羊褪黑素分泌增多，Kiss1形成的正反饋調(diào)節(jié)。進入繁殖季節(jié)或發(fā)情期后下丘腦會大幅合成GnRH，并釋放進入垂體門脈，被血液運送到腺垂體后使垂體細胞合成釋放FSH和LH，F(xiàn)SH和LH在到達卵巢后加快了卵泡的發(fā)育、排卵，同時刺激類固醇激素的合成釋放，進而引起動物發(fā)情癥狀逐漸明顯[29]。王軍等[30]在研究Kiss1、GPR54基因?qū)d羊的繁殖調(diào)控中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情狀態(tài)下綿羊下丘腦ARC中Kiss1基因表達量明顯上升；而在乏情期時，不管是正常綿羊還是切除了卵巢的綿羊，ARC內(nèi)Kiss1mRNA表達水平都顯著降低。結(jié)合本研究，甘加藏羊下丘腦Kiss1、GPR54mRNA相對表達量均在發(fā)情后期達到峰值，整個發(fā)情周期總體呈上升趨勢，這也與金慧慧等[31]的結(jié)果相似，進一步證實了Kiss1/GPR54系統(tǒng)會通過干涉靶基因GnRH從而參與調(diào)控藏羊的季節(jié)性繁殖。但郭若婷[32]卻指出，阿勒泰綿羊下丘腦Kiss1在發(fā)情期表達最高，與本研究結(jié)果不一致，這可能是品種、生長環(huán)境及氣候不同所導(dǎo)致的。

褪黑素參與的光周期與類固醇激素的季節(jié)性反饋作用會共同調(diào)節(jié)Kiss1基因在不同繁殖季節(jié)的表達[33]。松果體、下丘腦、甲狀腺組織中Kiss1、GPR54基因表達從發(fā)情前期開始呈現(xiàn)上升趨勢，在發(fā)情后期達到最高，顯著高于非繁殖季節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺中有合成褪黑素的2種關(guān)鍵酶[34]，提示甲狀腺可自主合成褪黑素。褪黑素會通過光周期的變化來介導(dǎo)甲狀腺中Kiss1的表達，甲狀腺中Kiss1/GPR54在不同時期內(nèi)的表達變化表明，其可能作為重要的調(diào)控因子參與到季節(jié)性調(diào)控中，這種調(diào)控作用而后又會集中表現(xiàn)在調(diào)控下游GnRH的表達來影響藏羊季節(jié)性發(fā)情中。垂體組織中Kiss1mRNA在發(fā)情期達到峰值，并顯著高于各個時期。Kisspeptin、GPR54蛋白含量與mRNA檢測結(jié)果略有差異，可能是基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平存在時空間隔造成的。Kiss1/GPR54系統(tǒng)廣泛參與到甘加藏羊的季節(jié)性繁殖調(diào)控中，但該系統(tǒng)影響藏羊繁殖的分子機制有待進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，甘加藏羊血漿Kisspeptin含量在發(fā)情周期內(nèi)呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律，且Kisspeptin水平明顯高于乏情期，表明Kisspeptin參與了藏羊的季節(jié)性發(fā)情調(diào)控。發(fā)情周期Kiss1、GPR54mRNA及其蛋白在視神經(jīng)和PHPT軸中均有表達及分布，且其相對表達量隨發(fā)情周期的變化存在一定的差異和動態(tài)變化規(guī)律，證實Kiss1/GPR54系統(tǒng)是調(diào)控藏羊季節(jié)性發(fā)情周期生理活動的主要調(diào)控因子。