吳艷芳，仲長勝，陳玉林，寇啟芳，馬保華*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司，寧夏吳忠 751999）

灘羊是由蒙古羊適應(yīng)寧夏周邊地區(qū)的環(huán)境條件生存、繁殖衍化而來的地方裘皮綿羊品種，具有晚熟晚育、發(fā)情表現(xiàn)不明顯以及季節(jié)性發(fā)情等繁殖特性。灘羊裘皮潔白美觀，灘羊肉富有營養(yǎng)、味道鮮美、無膻味，灘羊產(chǎn)品受到廣大消費者的青睞。然而傳統(tǒng)灘羊存在大脂尾影響自然交配、繁殖性能低、生長發(fā)育緩慢等缺點，影響了灘羊養(yǎng)殖場（戶）的養(yǎng)殖經(jīng)濟效益和灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，建立灘羊高效繁殖技術(shù)體系，在灘羊繁殖、品種選育過程中利用外源激素來調(diào)控灘羊的同期發(fā)情、超數(shù)排卵、以便更加準(zhǔn)確的進行人工授精、胚胎移植、基因編輯等研究和應(yīng)用工作。但在實際操作過程中，即使采用相同的激素制劑和處理程序也不能取得很好的效果。本研究在1 個發(fā)情周期內(nèi)檢測灘羊血清促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、雌二醇（E）、孕酮（P）濃度，監(jiān)測灘羊發(fā)情周期外周血生殖激素動態(tài)變化，從而分析灘羊卵泡波動態(tài)發(fā)育情況，為改進灘羊繁殖控制方法、建立灘羊高效繁殖技術(shù)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2020 年10 月于寧夏吳忠市紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司灘羊養(yǎng)殖場，通過試情的方法選擇發(fā)情周期正常、年齡在1.5～6 歲的繁殖母羊14只，其中1.5 歲、3 歲、5 歲和6 歲的母羊分別為4、4、4 只和5 只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 耗材、試劑盒與儀器設(shè)備 一次性真空采血管，1.5 mL離心管，離心機（CT15RE，日立工機式會社）；FSH、LH、EELISA 試劑盒（批號202011）和PELISA 試劑盒（批號202012）為上海邦奕生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法 對選擇的14 只母羊，繼續(xù)用公羊試情1個發(fā)情周期，再次確認發(fā)情期正常，從第2 個發(fā)情周期發(fā)情當(dāng)天（記為周期的第0 天）開始到下次發(fā)情開始當(dāng)天、每天10:00 左右頸靜脈采血5 mL，3 000 r/min 離心15 min，將血清吸入1.5 mL 離心管中，做好標(biāo)記并保存于-20℃，干冰保存條件下寄往上海邦奕生物科技有限責(zé)任公司檢測。

1.4 統(tǒng)計分析 采用Excel、GraphPad Prism 6 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖，采用ANOVA 單因素方差分析作差異分析，數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 灘羊發(fā)情周期 在14 只試驗羊中，2 只母羊發(fā)情周期為16 d，5 只母羊發(fā)情周期為17 d，4 只母羊發(fā)情周期為18 d，2 只母羊發(fā)情周期為19 d，1 只母羊發(fā)情周期為21 d。發(fā)情母羊表現(xiàn)為接受公羊爬跨，眼觀母羊外陰稍腫大、顏色潮紅、觸感柔軟松弛，探查可見母羊陰黏膜充血伴隨透明粘液流出。

2.2 灘羊發(fā)情周期內(nèi)血清FSH、LH 濃度變化 在發(fā)情周期內(nèi)，灘羊血清樣本FSH 和LH 濃度呈波動性變化。FSH 濃度在發(fā)情前期逐漸升高，在發(fā)情當(dāng)天出現(xiàn)峰值，濃度為（12.85±0.51）IU/L，在發(fā)情后期呈下降趨勢。FSH 在發(fā)情周期內(nèi)出現(xiàn)2～4 個峰值，F(xiàn)SH 峰值的個數(shù)和出現(xiàn)的時間依發(fā)情周期天數(shù)而有所不同。

發(fā)情周期為16 d 的2 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，有2個FSH 峰值分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、7（8）天（圖1-A）。發(fā)情周期為17 d 的5 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，4只母羊有3 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、5（6、7）、12（13、14）天（圖2-A）；1 只母羊有4 個FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、4、7、11 天（圖2）。發(fā)情周期為18 d 的4 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，有4 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、5（6）、8（9）、13（14）天（圖3-A）。發(fā)情周期為19 d 的2 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，1 只母羊有3 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、8、14 天（圖4-A）；1 只母羊有4 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、7、11、15 天（圖4）。發(fā)情周期為21 d的灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，有5 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、6、11、13、17 天（圖5-A）。

圖2 發(fā)情周期為17 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

圖3 發(fā)情周期為18 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

圖4 發(fā)情周期為19 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

圖5 發(fā)情周期為21 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

在發(fā)情周期內(nèi)，LH 濃度隨著FSH 濃度變化而相應(yīng)出現(xiàn)2～4 個峰值（圖1～5 B），LH 濃度在發(fā)情前期逐漸升高，在發(fā)情當(dāng)天出現(xiàn)峰值，濃度為（21.48±0.68）IU/L，高于發(fā)情周期的其他時期（<0.05），在發(fā)情后期下降。

2.3 灘羊發(fā)情周期內(nèi)血清E、P濃度變化 由圖1-5可知，灘羊發(fā)情周期E、P也呈現(xiàn)波動式變化。E濃度隨著FSH 濃度變化出現(xiàn)2～4 個峰值，表現(xiàn)為在發(fā)情前1～3 d 迅速升高，在發(fā)情當(dāng)天出現(xiàn)峰值，濃度最大為（21.09 ±0.81）ng/L，高于發(fā)情周期其他時期（<0.05），在發(fā)情后逐漸降低。P濃度在發(fā)情期最低，為（916.29±33.20）pmol/L，發(fā)情后5 d 內(nèi)緩慢上升，在發(fā)情周期6～13 d 處于較高水平，隨后逐漸緩慢降低。

圖1 發(fā)情周期為16 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

3 討 論

灘羊發(fā)情周期通常為17～19 d，發(fā)情持續(xù)時間為24～48 h。由于灘羊發(fā)情時外部發(fā)情癥狀表現(xiàn)不明顯，需要利用試情公羊進行試情，試情時發(fā)情母羊愿意或主動接近公羊并接受公羊爬跨。本研究使用的14 只母羊中，發(fā)情周期為16 d 的母羊有2 只、17 d 有5 只、18 d有4 只、19 d 有2 只，21 d 的有1 只，基本能夠代表灘羊發(fā)情周期天數(shù)的總體分布情況。

大多數(shù)哺乳動物卵泡發(fā)育受系統(tǒng)的內(nèi)分泌調(diào)控而且以卵泡波的方式進行，在繁殖季節(jié)綿羊每個發(fā)情周期通常有3 個左右的卵泡波，每個卵泡波發(fā)生之前會伴隨著刺激生長卵泡波發(fā)生的FSH 濃度增加，因此每個FSH 分泌峰的出現(xiàn)都代表著1 個卵泡波出現(xiàn)。本研究中，大多數(shù)灘羊在1 個情期內(nèi)出現(xiàn)2～4 個FSH 和LH峰，這與綿羊卵泡波動態(tài)發(fā)育的研究一致。灘羊在發(fā)情期血清FSH 濃度和LH 濃度高于福清山羊、戴云山羊、陜北絨山羊和吐魯番黑羊，這可能是由于品種或測定方法不同導(dǎo)致測定結(jié)果的差異，但FSH、LH 在不同品種羊的發(fā)情周期內(nèi)分泌規(guī)律是類似的。FSH 可促進卵泡生長發(fā)育，LH 在卵泡優(yōu)勢化、成熟、恢復(fù)卵母細胞減數(shù)分裂和誘發(fā)排卵中發(fā)揮重要作用。本研究中的14 只母羊，在間情期存在1 個比發(fā)情當(dāng)天FSH 濃度更高的FSH 峰，然而母羊并沒有發(fā)情排卵，認為雖然此時期灘羊體內(nèi)FSH 水平較高，而相應(yīng)的LH和E水平遠低于發(fā)情期的峰值，說明FSH 水平較高而E和LH 水平較低時不會誘發(fā)灘羊卵泡成熟和排卵，這也表明誘發(fā)灘羊發(fā)情排卵需要適當(dāng)濃度比例FSH、E和LH 的協(xié)同作用。

灘羊血清E和P在發(fā)情周期內(nèi)呈波動式分泌，發(fā)情當(dāng)天E濃度達到峰值，P濃度最低，這與在哈薩克綿羊和多浪羊中的報道一致。E可以促進卵泡成熟、提高母畜性欲，少量P與E協(xié)同作用促進雌性動物發(fā)情。有研究認為卵泡波的出現(xiàn)也與雌激素的血清濃度瞬時升高的起始有關(guān)，并且最大卵泡生長階段的結(jié)束時間與血清雌激素峰值濃度出現(xiàn)時間一致，這與本研究中灘羊血清E在發(fā)情周期內(nèi)隨FSH 峰后出現(xiàn)分泌峰的結(jié)果一致。發(fā)情前期在優(yōu)勢卵泡的發(fā)育過程中，E濃度升高和P濃度下降，刺激FSH 和LH 在排卵前形成極大峰值，從而誘發(fā)排卵。發(fā)情排卵后顆粒細胞在LH作用下發(fā)生黃體化，因此P濃度由最低水平開始上升。P在發(fā)情周期的6～13 d 保持較高水平，說明間情期母羊黃體功能正常，高水平P通過負反饋作用抑制下丘腦合成與分泌促性腺激素釋放激素，進而抑制垂體FSH 和LH 的產(chǎn)生和釋放，最終抑制卵巢上卵泡發(fā)育和母畜發(fā)情；間情期結(jié)束后，黃體溶解，P濃度下降，解除了對FSH 和LH 產(chǎn)生與釋放的抑制作用，外周血FSH 水平隨之升高，促進有腔卵泡發(fā)育，又出現(xiàn)新的發(fā)情和排卵。這說明P濃度的高低也調(diào)控著灘羊的卵泡發(fā)育和發(fā)情。

母羊血清生殖激素檢測結(jié)果顯示，發(fā)情周期天數(shù)不同的灘羊在發(fā)情周期內(nèi)卵泡波的數(shù)量和出現(xiàn)的時間差異較大，這可能是同期發(fā)情處理時即使采用相同的激素制劑和程序而結(jié)果有較大差異的原因之一。通過研究結(jié)果可以分析出，發(fā)情周期16 d 的母羊（n=2）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)2 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的7～8 d，第2 個卵泡波（排卵卵泡波）出現(xiàn)于發(fā)情周期的14 d 左右；發(fā)情周期17 d 的母羊（n=5）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)3 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的5～7 d，第2 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的12～14 d，最后1 個卵泡波（排卵卵泡波）出現(xiàn)于發(fā)情周期的15 d左右；發(fā)情周期18 d 的母羊（n=4）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)4 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的5～6 d，第2 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的8～9 d，第3 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的13～14 d，最后1 個卵泡波（排卵卵泡波）開始出現(xiàn)于發(fā)情周期的15 d 左右；發(fā)情周期19 d的母羊（n=2）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)3～4 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的7（8）d，第2 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的11（14）d，第3 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的15 d 左右，最后1 個卵泡波（排卵卵泡波）開始出現(xiàn)于發(fā)情周期的16 d 左右。總體來看，灘羊在發(fā)情前3～4 d 均會出現(xiàn)排卵卵泡波，因此確定灘羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生的時間對灘羊同期發(fā)情或超數(shù)排卵程序的準(zhǔn)確制定尤為重要。

4 結(jié) 論

本研究表明，灘羊血清FSH、LH、E和P共同調(diào)控著灘羊的發(fā)情周期和卵泡波動態(tài)發(fā)育。大多數(shù)灘羊發(fā)情周期中出現(xiàn)3～4 個卵泡波，發(fā)情周期16 d 的母羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生于發(fā)情周期的14 d 左右；發(fā)情周期17、18 d 的母羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生于發(fā)情周期的15 d 左右；發(fā)情周期19 d 的母羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生于發(fā)情周期的16 d 左右，即大多數(shù)灘羊最后1 個卵泡波開始出現(xiàn)于發(fā)情周期的14～16 d。