席啦，熊英梅，王玉榮，侯強(qiáng)川，王婷，楊瑩，郭壯*

1(湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽，441053)2(湖北文理學(xué)院,乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽，441053)3(襄陽市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 襄陽，441001)

作為我國地方特色發(fā)酵食品，鲊廣椒主要以二荊條辣椒和大米粉或玉米粉為原料，經(jīng)剁碎和攪拌均勻后裝壇密封發(fā)酵而成[1]，因其特殊的發(fā)酵原料、酸辣的口感和特殊的香味受到廣大消費(fèi)者的歡迎[2]。在我國貴州等少數(shù)民族聚集區(qū)的居民食用的鲊廣椒常以玉米為原料進(jìn)行發(fā)酵[3-4]，而在湖北荊州等地區(qū)常使用大米作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行鲊廣椒的制作。本研究團(tuán)隊(duì)對鲊廣椒中微生物多樣性進(jìn)行了解析[5]，發(fā)現(xiàn)真菌含量過高不利于鲊廣椒滋味品質(zhì)的形成[6]，但乳酸菌對于鲊廣椒風(fēng)味和滋味品質(zhì)的塑造具有重要的作用[7]；崔夢君等[8]亦發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵工藝和辣椒會影響莽椒的品質(zhì)和發(fā)酵菌群。因此，不同的原料不僅可以賦予鲊廣椒不同的風(fēng)味，還可能對其微生物多樣性產(chǎn)生影響[4]，探究不同原料對鲊廣椒品質(zhì)和菌群的影響是十分必要的。

感官品鑒被廣泛地應(yīng)用于食品品質(zhì)的評價，但其太過于依賴品鑒人員的專業(yè)技能，且容易受到主觀因素的影響[9]。隨著仿生設(shè)備的發(fā)展，電子舌和電子鼻等仿生學(xué)設(shè)備被廣泛的應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品滋味和風(fēng)味的評價[10-11]，兩者對于食品的品質(zhì)具有整體選擇性，在食品品質(zhì)評價方面具有較大的優(yōu)勢[12-13]。研究人員對發(fā)酵食品中微生物進(jìn)行解析的目的之一是探討微生物對食品品質(zhì)的影響，進(jìn)而尋求提升發(fā)酵食品品質(zhì)的途徑。而隨著高通量技術(shù)的迅速發(fā)展，以Illumina為代表的第二代測序技術(shù)在解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品中扮演著重要的角色，這也為本研究探究鲊廣椒中微生物多樣性提供了有效的手段。

本研究分別以不同配比的大米和玉米為原料進(jìn)行了鲊廣椒制備，同時使用電子舌和電子鼻技術(shù)對不同鲊廣椒的品質(zhì)進(jìn)行了評價，并結(jié)合高通量測序技術(shù)對其蘊(yùn)含微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，以此探究添加玉米對鲊廣椒整體品質(zhì)的影響，以期對鲊廣椒制作工藝的改良提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米，湖北京和米業(yè)有限公司；玉米，贛州市九鯉湖食品有限公司；二荊條辣椒及各種調(diào)味料，市售；食鹽，滄州鹽業(yè)集團(tuán)銀山食鹽有限公司。

陽離子溶液、陰離子溶液、預(yù)處理溶液、參比溶液、內(nèi)部溶液，日本INSENT公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；10×PCR buffer、FastPfu Fly DNA聚合酶和dNTPs Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-70F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CR21 N高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；SA 402B電子舌，日本Insent公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop公司；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鲊廣椒的制備

設(shè)置5個試驗(yàn)組，其中A1組均為大米粉，A5組均為玉米粉，A2、A3和A4組大米粉和玉米粉的質(zhì)量比分別為3∶1、1∶1和1∶3，每組大米粉和玉米粉的總質(zhì)量均為800 g。稱取40 g食鹽、3.20 g白胡椒、3.20 g花椒和225 g剁碎后的二荊條辣椒各5份，分別添加至A1～A5中攪拌均勻后裝入壇中進(jìn)行密封發(fā)酵，并在壇口噴灑白酒進(jìn)行殺菌，封口后置于30 ℃恒溫發(fā)酵30 d。

1.3.2 鲊廣椒滋味品質(zhì)的測定

準(zhǔn)確稱取鲊廣椒50 g和量取150 mL蒸餾水，混合攪拌均勻后進(jìn)行抽濾，取上清液10 000 r/min離心8 min后裝入燒杯中置于4 ℃冰箱中靜置24 h，吸取上清液儲存于測試杯中備用。參照楊成聰?shù)萚14]關(guān)于蘇打水滋味指標(biāo)的測試參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，使用電子舌對鲊廣椒的酸、苦、澀、咸和鮮等5個基本味和后味A、后味B和豐度等3個基本味回味進(jìn)行數(shù)字化測定，每份鲊廣椒平行測定4次，取后3次作為本實(shí)驗(yàn)測試數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.3 鲊廣椒風(fēng)味品質(zhì)的測定

準(zhǔn)確稱取20 g鲊廣椒置于電子鼻專用樣品瓶中蓋上蓋帽進(jìn)行密封。將樣品瓶置于50 ℃水浴鍋中保溫30 min后于室溫靜置30 min，進(jìn)行鲊廣椒風(fēng)味品質(zhì)的數(shù)字化測定。參照張逸舒等[15]的方法進(jìn)行測試參數(shù)設(shè)置，對鲊廣椒的10個特征型風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，每個樣本平行測定3次，每次測試時間為90 s，所有樣本在50 s后均達(dá)到平臺期，本研究選取59、60、61 s時響應(yīng)值的平均值作為樣本的測試數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.3.4 鲊廣椒微生物宏基因組DNA提取及測序

稱取1.0 g左右的鲊廣椒，使用試劑盒進(jìn)行微生物宏基因組DNA的提取。參照崔夢君等[8]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增參數(shù)的設(shè)置，并對檢驗(yàn)合格的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的濃度和純度進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)合格的DNA產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

依照崔夢君等[8]參數(shù)進(jìn)行序列的質(zhì)量控制，并根據(jù)Barcode標(biāo)簽信息對下機(jī)序列進(jìn)行分配，將序列歸并到不同的樣本中。本研究以QIIME v1.70平臺為依托，并結(jié)合個性化分析流程對鲊廣椒中細(xì)菌構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析，具體分析流程參照YANG等[16]對奶酪中細(xì)菌多樣性的研究。

1.3.6 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究基于多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對鲊廣椒中風(fēng)味指標(biāo)的變異系數(shù)進(jìn)行計(jì)算；基于R軟件采用斯皮爾曼相關(guān)性分析對品質(zhì)指標(biāo)和優(yōu)勢菌屬與原料之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析；基于R軟件進(jìn)行了冗余分析。使用R和Origin 2017b進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子舌和電子鼻不同原料配比鲊廣椒品質(zhì)的分析

本研究首先使用電子舌和電子鼻對不同原料配比鲊廣椒的滋味和風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行數(shù)字化評價，并對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。不同原料配比鲊廣椒中各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度的變化趨勢如圖1所示。

a-酸、苦、咸、鮮味指標(biāo)；b-澀味、后味A、后味B、豐度指標(biāo)圖1 不同鲊廣椒中滋味指標(biāo)的相對強(qiáng)度Fig.1 The relative intensity of the taste indexes in different Zha-Chili注：A1、A2、A3、A4和A5分別代表大米、m(大米)∶m(玉米)=3∶1、 m(大米)∶m(玉米)=1∶1、m(大米)∶m(玉米)=1∶3和玉米制作 的鲊廣椒(下同)

由圖1可知，在鲊廣椒制作中添加不同比例的玉米作為原材料會對鲊廣椒的滋味品質(zhì)造成較大的影響，其中酸味、苦味和咸味等受到的影響較大(相對強(qiáng)度的極差值均>1)，且以酸味受到的影響最大(相對強(qiáng)度的極差值為3.25)。值得注意的是，隨著發(fā)酵基質(zhì)中玉米的比例的提高，鲊廣椒酸味的強(qiáng)度不斷增加，而苦味和咸味則沒有這樣的趨勢。相關(guān)報道顯示，當(dāng)滋味指標(biāo)的相對強(qiáng)度>1時，消費(fèi)者便可以通過感官予以識別。由此說明，在發(fā)酵基質(zhì)中添加一定比例的玉米時，會直接影響消費(fèi)者在食用鲊廣椒時的口感。進(jìn)一步對鲊廣椒的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，鲊廣椒風(fēng)味指標(biāo)的相對強(qiáng)度如表1所示。

表1 不同鲊廣椒中風(fēng)味指標(biāo)的相對強(qiáng)度表Table 1 The relative intensity table of different flavor indexes in Zha-Chili

由表1可知，在鲊廣椒的發(fā)酵基質(zhì)中添加一定比例的玉米亦會直接影響其風(fēng)味品質(zhì)，其中W1C、W5S、W1S和W2S等風(fēng)味指標(biāo)在組內(nèi)存在較大的差異(變異系數(shù)>20%)。且玉米的添加能明顯增加鲊廣椒中芳香類風(fēng)味物質(zhì)的含量，并降低鲊廣椒中氮氧化合物、甲烷和乙醇的含量。

2.2 鲊廣椒中序列豐富度和多樣性分析

在使用仿生設(shè)備對鲊廣椒的品質(zhì)進(jìn)行評價的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用高通量測序技術(shù)對鲊廣椒中微生物多樣性進(jìn)行了解析，從而探究添加玉米對鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)的影響。本研究以測序量為自變量，以發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)為因變量進(jìn)行稀疏曲線和香農(nóng)曲線的繪制，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著測序量的增加，發(fā)現(xiàn)物種數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢但并沒有達(dá)到平臺期，而香農(nóng)曲線已基本達(dá)到平衡狀態(tài)，說明隨著測序量的增加可能會有少量新的物種被發(fā)現(xiàn)，但在此測序量下，鲊廣椒中的微生物多樣性已得到充分的解析，說明本研究的測序水平能夠滿足后續(xù)分析分子生物學(xué)分析的要求。進(jìn)一步對添加玉米的比例和菌群多樣性的關(guān)系進(jìn)行了分析，α多樣性指數(shù)隨玉米添加量變化的曲線如圖3所示。

a-稀疏曲線；b-香農(nóng)曲線圖2 稀疏曲線和香農(nóng)曲線Fig.2 Sparse curve and Shannon curve

圖3 不同鲊廣椒中微生物的α多樣性指數(shù)Fig.3 Alpha diversity index of microbes in different Zha-Chili

由圖3可知，4種α多樣性指數(shù)隨著發(fā)酵基質(zhì)中玉米比例的增加均呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。超1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)隨著玉米添加量的增加而不斷增大，盡管在剛開始有略微的降低，但整體上呈現(xiàn)明顯的上升趨勢；而香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)則隨著玉米含量的增加而呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢。超1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)常用來估算樣本中微生物的豐度，而香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)常用來估算樣本中微生物的多樣性。由此可見，隨著發(fā)酵基質(zhì)中玉米比例的增加，鲊廣椒樣本中微生物的多樣性不斷降低，而微生物的豐度不斷上升。鲊廣椒中優(yōu)勢細(xì)菌門和屬相對含量的比較分析，如圖4所示。

圖4 鲊廣椒中優(yōu)勢細(xì)菌門和屬的比較分析Fig.4 Comparative analysis of dominant Phylum and genus in Zha-Chili

由圖4可知，鲊廣椒中優(yōu)勢細(xì)菌門(平均相對含量>0.10%)有4個，分別為Firmicutes(硬壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)和Cyanobacteria(藍(lán)菌門)，其平均相對含量分別為97.99%、1.18%、0.37%和0.36%；而優(yōu)勢菌屬(平均相對含量>0.10%)亦有4個，分別為Lactobacillus(乳桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Thermoleophilum(棲熱嗜獅菌屬)和Acinetobacter(不動桿菌屬)，平均相對含量分別為97.90%、0.47%、0.36%和0.16%。值得注意的是，高通量測序結(jié)果顯示在發(fā)酵基質(zhì)中添加玉米并沒有改變鲊廣椒中優(yōu)勢細(xì)菌屬的種類，且其優(yōu)勢菌屬與以往研究所報道的相一致[5]。

玉米作為世界上一種重要的糧食作物，其廣泛的分布于中國、美國和巴西等國家，與傳統(tǒng)水稻相比，玉米具有更高的淀粉、糖類和維生素含量，應(yīng)用前景廣闊[17]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，隨著玉米添加量的增加，乳桿菌屬的含量不斷下降，但其幅度很小，而其他優(yōu)勢菌屬呈現(xiàn)小幅度的線性上升。鲊廣椒中乳桿菌屬為鲊廣椒中的絕對優(yōu)勢菌屬，占比高達(dá)98%，說明乳桿菌屬可能對鲊廣椒的品質(zhì)有著較大的影響，其能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量的乳酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響著鲊廣椒的品質(zhì)。而相關(guān)報道顯示，玉米中富含豐富的淀粉、纖維素和維生素等營養(yǎng)成分[18]，這可能為鲊廣椒中低豐度的優(yōu)勢菌屬提供了充足的營養(yǎng)成分，最終導(dǎo)致其相對含量的小幅度增加。

2.3 鲊廣椒中菌群與品質(zhì)的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究玉米對鲊廣椒品質(zhì)指標(biāo)和菌群結(jié)構(gòu)的影響，本研究對鲊廣椒發(fā)酵基質(zhì)中玉米的比例與鲊廣椒品質(zhì)指標(biāo)和菌群之間的相關(guān)性進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如圖5所示。

圖5 玉米比例與品質(zhì)指標(biāo)和菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of maize proportion with quality index and microbes structure

由圖5可知，玉米含量與酸味、苦味、W1C、乳桿菌屬、假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬之間呈顯著相關(guān)性，其中玉米含量與酸味、假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬呈顯著正相關(guān)，而與苦味和乳桿菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)。值得注意的是，玉米含量與全部優(yōu)勢菌屬之間均存在顯著相關(guān)關(guān)系。本研究使用冗余分析，進(jìn)一步探討了菌群與品質(zhì)之間的聯(lián)系，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 冗余分析Fig.6 Redundancy analysis

由圖6可知，A3、A4和A5號樣品與酸味和W1C有著良好的賦值相關(guān)，而A1號樣品與苦味、咸味、W1S、W2S和W5S之間有著良好的賦值相關(guān)，因而上述指標(biāo)是導(dǎo)致不同鲊廣椒樣本品質(zhì)總體結(jié)構(gòu)的顯著差異的關(guān)鍵指標(biāo)。且乳桿菌屬與苦味和咸味具有較強(qiáng)的一致性，而假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬與酸味和W1C之間具有較強(qiáng)的一致性。

玉米因其自身的影響特性亦賦予了鲊廣椒不同滋味品質(zhì)，盡管隨著玉米含量的增加導(dǎo)致鲊廣椒中乳桿菌屬的相對含量出現(xiàn)了小幅度的下降，但其酸味和芳香味強(qiáng)度卻明顯加強(qiáng)，這可能是因?yàn)橛衩鬃陨淼奶呛枯^高[19]，更容易被微生物所利用，并在食鹽的催化下強(qiáng)化了其口感而起到提味的作用。相關(guān)報道表明，乳桿菌屬能代謝發(fā)酵基質(zhì)中糖的糖類物質(zhì)而改善發(fā)酵制品的風(fēng)味特性[20]，這也解釋了為什么鲊廣椒中乳桿菌屬的相對含量降低了，而酸味和芳香味反而進(jìn)一步提升。

3 結(jié)論

本研究分別以大米和玉米為原料制作了鲊廣椒，同時采用電子舌和電子鼻技術(shù)對鲊廣椒的品質(zhì)進(jìn)行了數(shù)字化評價，并結(jié)合高通量測序技術(shù)對鲊廣椒中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析。研究表明，在鲊廣椒的發(fā)酵基質(zhì)中添加玉米能明顯增加鲊廣椒樣品的酸味和芳香味，而降低苦味、咸味、氮氧化合物、甲烷和乙醇的強(qiáng)度；鲊廣椒中主要以乳桿菌屬、假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬為主，而鲊廣椒中玉米的添加比例與優(yōu)勢菌屬和微生物多樣性之間有著顯著的相關(guān)性。綜合分析表明，在鲊廣椒的發(fā)酵基質(zhì)中添加一定比例的玉米能夠使乳桿菌屬的相對含量下降，同時可以降低鲊廣椒的苦味和咸味，而增加其酸味和芳香味。