楊海琦，陳季旺，3，4*，徐 言，田宏偉，廖 鄂，3，4，王海濱，3，4

（1 武漢輕工大學 食品科學與工程學院 武漢 430023 2 湖北周黑鴨食品工業(yè)園有限公司 武漢 430000 3 湖北省農產品加工與轉化重點實驗室 武漢 430023 4 國家小龍蝦加工技術研發(fā)分中心（潛江） 湖北潛江 433100）

小龍蝦的季節(jié)效應非常明顯，從秋季開始到第二年的春季是小龍蝦的“枯竭期”，蝦的資源緊缺且肉質較差。小龍蝦具有地域性，養(yǎng)殖和加工主要集中于我國湖北、湖南、安徽、江蘇等長江流域地區(qū)[1]。研究小龍蝦的保藏方法，延長其貯藏期，為小龍蝦的周年加工提供穩(wěn)定的原料非常迫切。

凍藏可以抑制微生物生長和內源酶活性，延長水產品的貯藏期。目前，國內外關于水產品凍藏保鮮的研究集中于凍藏條件的優(yōu)化。江艷華等[2]為分析冰衣量對凍南美白對蝦品質的影響，測定了不同冰衣處理的凍蝦肉的持水力、彈性、硬度、pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N 值）、丙二醛（MDA）含量。結果顯示：包冰衣能顯著抑制凍蝦肉TVB-N值的增加，對持水力、pH 值、MDA 含量和硬度無顯著影響。Tanaka 等[3]探究了凍藏溫度和凍藏時間對金槍魚肉品質特性的影響，他們根據(jù)pH 值將金槍魚肉分為兩組（pH 值＜6.2，pH 值＞6.8），凍藏溫度分別為-20，-35，-40，-45，-60 ℃，凍藏16 個月，測定金槍魚肉的高鐵肌紅蛋白含量（MetMb%）、汁液流失率、微觀結構并進行感官評價。結果顯示： 對于-40 ℃以上凍藏的金槍魚肉，pH 值越低，MetMb%越高；對于-45 ℃及-45 ℃以下凍藏的魚肉，MetMb%穩(wěn)定，與pH 值無相關性。有研究對水產品凍藏保鮮機制做了深入分析。Yang 等[4]為確定河豚凍藏過程中肉質軟化的主要因素，分別比較3 種處理（液氮凍結、碘乙酸浸漬、抗壞血酸協(xié)同茶多酚浸漬）的河豚的冰晶、內源蛋白酶活性、蛋白質和脂質氧化程度，結果顯示：冰晶形成與分布是導致凍藏河豚軟化的主要因素。

長期凍藏導致冰晶的形成、升華和重結晶，促進蛋白質變性和脂質氧化，使水產品質構、風味和感官品質劣變[5]。冷凍過程中冰晶形成和分布與凍藏溫度和凍結速度密切相關，而凍結速度與凍結溫度密切相關。說明凍結溫度和凍藏溫度對水產品品質有重要影響。目前，工業(yè)化生產中常采用液氮凍結或鼓風凍結小龍蝦原料及其制品，然而，凍結溫度的選定通常依靠經驗，有關凍結溫度對小龍蝦凍藏過程中品質的影響未見報道。Sun 等[6]通過測定3 種處理方式 （保水劑浸漬、60 W 超聲處理結合保水劑浸漬、80 W 超聲處理結合保水劑浸漬）的小龍蝦肉在-18 ℃凍藏42 d 的解凍損失、水分含量、水分活度、持水性、質構、TVB-N 值、肌原纖維蛋白含量和三磷酸腺苷酶（ATPase）活性，研究超聲波和納米保水劑對小龍蝦凍藏過程中的協(xié)同保護作用，結果顯示：結合保水劑的60 W 超聲波處理，可有效改善凍藏過程中小龍蝦的品質。

本文采用冰柜凍結鮮活小龍蝦原料 【采用3個凍結溫度（-20，-40 ℃和-55 ℃）和2 個凍藏溫度（-20 ℃和-40 ℃）】，測定凍藏過程中小龍蝦肉的汁液流失率、持水率、剪切力、pH 值、TVB-N值、水分狀態(tài)，肌肉組織顯微結構，分析凍結及凍藏溫度對其品質的影響，為小龍蝦原料周年供應提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦，湖北周黑鴨食品工業(yè)園有限公司提供；三氯乙酸（優(yōu)級純）、硼酸（優(yōu)級純）、甲基紅（優(yōu)級純）、溴甲酚綠（優(yōu)級純），購于國藥集團化學試劑有限公司；硫酸標準滴定溶液 （0.01 mol/L）、2.5%戊二醛溶液，上海源葉生物有限公司。

1.2 設備與儀器

DW-60W388 超低溫冰柜，青島海爾生物醫(yī)療有限公司；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；XHF-DY 高速分散器，寧波新芝生物科技有限公司；XH-C 型渦旋混合器，常州金壇宏華儀器廠；GL-20-Ⅱ高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；C-LM3B 數(shù)顯式肌肉嫩度儀，東北農業(yè)大學工學院；DELTA-320pH 計、AL204 精密天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；TM4000II掃描電子顯微鏡，日立高新技術有限公司；NMI20-040V-I 低場核磁共振儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凍藏小龍蝦的制備 選取大小均等，質量約為20～30 g 的鮮活小龍蝦。將挑選好的小龍蝦用自來水刷洗，用超聲波清洗20 min（水的添加量以覆蓋蝦體為準），放入沸水中熱燙1 min，裝盒（每盒1 kg 小龍蝦），盒中灌入清水（水的添加量以覆蓋蝦體為準），將盒抽成真空。盒裝小龍蝦分別置于-20，-40，-55 ℃冰柜中凍結至中心溫度達到-15 ℃。將裝盒的蝦隨機分為兩組，分別置于-20 和-40 ℃冰柜中凍藏，凍藏周期為24 周，每隔6 周取樣用于檢測。每次隨機取約1 kg 小龍蝦，使用流動水解凍。取蝦肉時去除頭、殼和腸線。通過預試驗發(fā)現(xiàn)，熱燙過程中，小龍蝦肉的中心溫度保持在85～94 ℃的時間超過35 s，熱燙后的小龍蝦肉ATPase 活性從2.80 降低至1.08 mg prot/mL，ATPase 活性較低，因此，本文不考慮ATPase對小龍蝦品質變化的影響。

1.3.2 汁液流失率 參考Xu 等[7]的方法。準確稱量每盒蝦凍藏前的初始質量，并做記錄。凍藏一定時間將蝦取出解凍后，瀝干汁液并用濾紙擦干蝦殼表面的水分，再次稱重。水分含量根據(jù)公式（1）計算：

式中：X——汁液流失率，%；M1——小龍蝦的初始質量，g；M2——小龍蝦解凍后的質量，g。

1.3.3 持水率 參照宋敏等[8]的方法。小龍蝦解凍后，去除頭、殼和腸線，取2 g 左右的蝦肉，攪碎，放入裝有定量濾紙5 mL 的離心試管中。稱好濾紙和離心管的質量并做好記錄，5 000 r/min 離心10 min，然后記錄濾紙的質量，持水率根據(jù)公式（2）計算：

式中：X——持水率，%；M1——小龍蝦肉質量，g；A——小龍蝦肉水分含量，%；M2——增重，g。

1.3.4 剪切力 參照NY/T 1180-2006 中剪切力的測定方法[9]。小龍蝦解凍后，去除頭、殼和腸線，用刀片沿著蝦殼內側取樣，取長×寬×高分別為1.2 cm×0.5 cm×0.5 cm 的整塊蝦肉。將蝦肉置于數(shù)顯式肌肉嫩度儀刀刃上，使切向與肌肉纖維走向垂直，測量剪切力（嫩度）[9]。

1.3.5 pH 值 參考GB 5009.237-2016 中pH 值的測定方法[10]。小龍蝦解凍后，去除頭、殼和腸線，取2 g 蝦肉，加入20 mL 蒸餾水，2 000 r/min 均質1 min，用pH 計測定pH 值。

1.3.6 TVB-N 值 參照GB 5009.228-2016 中的半微量定氮法[11]。稱取10 g 蝦肉，加入20 g/L 三氯乙酸溶液，搖勻，用濾紙過濾。向接收瓶內加入10 mL 硼酸溶液，5 滴混合指示液 （使用1 份甲基紅乙醇溶液與5 份溴甲酚綠乙醇溶液混合指示液）。蒸餾結束后，以鹽酸或硫酸標準滴定溶液（0.01 mol/L）滴定至終點，終點顏色為紫紅色，同時做試劑空白。

1.3.7 肌肉組織的顯微結構觀察 參考Li 等[12]的方法。將蝦腹部的肉橫切成1 mm×1 mm×1 mm 左右的正方形小塊，立即置于2.5%的戊二醛溶液中進行固定處理（4 ℃），固定后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，然后依次使用50%，70%，80%，90%，100%乙醇梯度脫水，真空冷凍干燥、噴金后使用掃描電子顯微鏡 （SEM） 觀察肌原纖維的橫切面微觀結構（100×）。

1.3.8 水分狀態(tài) 參考Wang 等[13]的方法。將小龍蝦肉切成2 cm×2 cm×2 cm 左右的正方體，用保鮮膜包裹后置于40 mm 圓形玻璃管底部的中間位置，將玻璃管放入已預熱好且溫度穩(wěn)定在32 ℃的低場核磁共振儀的探測口中。測定序列為CPMG。參數(shù)設定為：PRG=1，PFD=0.002，RG1=30，TW=3 000，NS=8，TE=0.1，NECH=7 000。測得曲線后，用SIRT 進行反演。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 每組數(shù)據(jù)重復測定3 次，持水率和剪切力重復測定6 次。結果用平均值±標準偏差（SD）表示。應用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用ANOVA 進行方差分析、Duncan 多重極差檢驗比較平均值在顯著性水平上的差異，P＞0.05判定為差異不顯著，P＜0.05 判定為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小龍蝦凍結過程中溫度的變化

在水產品凍結過程中，中心溫度從-1 ℃降到-5 ℃是生成最大冰晶的階段[14]。由圖1可以看出，凍結溫度為-20，-40，-55 ℃時，小龍蝦肉的中心溫度達到-5 ℃的時間分別為4，13，35 min。-20 ℃凍結速度明顯低于-40，-55 ℃。

圖1 小龍蝦凍結過程中心溫度的變化Fig.1 Change in central temperature of red swamp crawfish during frozen

2.2 小龍蝦凍藏過程中汁液流失率和持水率的變化

水分含量可以用來評價蝦肉的新鮮程度，衡量小龍蝦肉水分含量的指標有持水率、汁液流失率等[15]。由表1可以看出，小龍蝦肉的汁液流失率隨著時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢，可能是蝦肉中的自由水在凍結過程中形成冰晶，冰晶破壞了蝦肉的細胞結構，而且這種破壞是不可逆的，因此在解凍過程中，形成冰晶的這部分水流失[16]。此外，凍結過程中形成的冰晶使肌纖維被破壞，導致蝦肉蛋白質變性，與蛋白質緊密結合的一部分水轉化成自由水，在低溫環(huán)境下凍結成冰晶，解凍后流失（低場核磁共振儀觀察到的小龍蝦的水分分布確認了這種變化）。凍結溫度相同時，-40 ℃凍藏的小龍蝦汁液流失率顯著低于-20 ℃凍藏（P ＜0.05），可能是較低的凍藏溫度抑制了微生物的生長，降低了肌纖維被破壞程度（SEM 觀察到的小龍蝦微觀結構驗證了這種變化），減輕了蝦肉蛋白質的變性程度，延緩了結合水向自由水的轉化；凍藏溫度相同時，-20 ℃凍結的小龍蝦肉的汁液流失率較低。這可能是較低的凍結溫度使小龍蝦凍結更快，形成冰晶較小，減少了小龍蝦肉水分的流失。

表1 小龍蝦凍藏過程中汁液流失率的變化（%）Table 1 Change in juice leakage of red swamp crayfish during freezing storage （%）

由表2可以看出，小龍蝦肉的持水率隨著時間的延長均呈現(xiàn)先降低再增加的趨勢，與譚明堂等[17]和Zang 等[18]報道的結果類似。-20 ℃凍藏的小龍蝦肉的持水率在凍藏至第6 周顯著降低 （P＜0.05），-40 ℃凍藏的持水率在第6 周也明顯下降，但不顯著（P＞0.05）?？赡苁?20 ℃凍藏的小龍蝦發(fā)生更嚴重的重結晶，較大的冰晶使細胞產生機械損傷、蝦肉蛋白質變性，導致肌肉結合水的能力降低。持水率在凍藏第12 至第24 周顯著增加（P＜0.05），可能是采用了加水覆蓋凍藏方式，蝦肉中的自由水在結晶時，部分組織被一起凍結，使得蝦肉內部的冰晶和外面覆蓋的冰層存在濃度差。在凍藏過程中，外部冰層的水分向蝦肉轉移，導致蝦肉水分含量增加（數(shù)據(jù)未顯示），使持水率呈現(xiàn)升高的趨勢。

表2 小龍蝦凍藏過程中持水率的變化（%）Table 2 Change in WHC of red swamp crayfish during freezing storage （%）

凍藏溫度相同時，凍藏第6 周至18 周，-55 ℃凍結小龍蝦肉的持水率顯著高于-20 和-40 ℃凍結組（P＜0.05）。這可能是-55 ℃比-20 ℃和-40℃凍結的凍結速度更快，因此小龍蝦在凍結時形成的冰晶更小，肌纖維被破壞程度更低，使得-55℃凍結組小龍蝦肌肉結合水的能力更強，持水率更高。凍結溫度相同時，凍藏第12 周后，-40 ℃凍藏組蝦肉中的持水率顯著高于-20 ℃凍藏組 （P＜0.05）。持水率的變化趨勢跟汁液流失率類似。

2.3 小龍蝦凍藏過程中剪切力的變化

由表3可以看出，小龍蝦肉的剪切力隨著時間的延長均呈現(xiàn)先增大再減小然后穩(wěn)定的趨勢。對比小龍蝦肉的剪切力與持水率發(fā)現(xiàn)，二者的變化趨勢相反。這說明小龍蝦肉的剪切力可能與持水率有關：凍藏第12 周時，蝦肉的剪切力顯著增大（P＜0.05），可能是凍結時蝦肉內部的水分形成冰晶，冰晶破壞了蝦肉肌纖維，導致解凍時失水，損傷了蝦肉的收縮能力，使得剪切力增大。蝦肉的剪切力在第18 周開始顯著減?。≒＜0.05），可能是隨凍藏時間增大，冰晶增大，蝦肉的蛋白質發(fā)生變性，肌纖維遭到破壞，使得剪切力減小[19]。

表3 小龍蝦凍藏過程中剪切力的變化（N）Table 3 Change in shearing force of red swamp crayfish during freezing storage （N）

凍藏溫度相同時，-20 ℃較-40 ℃和-55 ℃凍結降低了小龍蝦肉的剪切力，可能是較低的凍結溫度使小龍蝦在凍結時形成的冰晶較小，肌纖維被破壞程度較低，因此剪切力保持較好（SEM 觀察到的肌肉顯微結構驗證了這種變化）。凍結溫度相同時，-40 ℃凍藏蝦肉剪切力的變化程度低于-20 ℃。這可能是較低的凍藏溫度抑制了凍藏過程中的重結晶，減少了大冰晶的形成，使得蝦肉細胞結構被破壞的程度降低，減輕了肌肉的損傷，導致了較低的剪切力的變化。

2.4 小龍蝦凍藏過程中pH 值的變化

由表4可以看出，小龍蝦肉的pH 值隨著時間的延長均呈現(xiàn)先減小再增大然后穩(wěn)定的趨勢。凍藏至第6 周，各組pH 值均顯著減小（P＜0.05），可能是游離脂肪酸質量分數(shù)增加所導致（數(shù)據(jù)未顯示）。第6 周至12 周，各組pH 值均顯著增大（P＜0.05），可能是蛋白質在微生物的作用下分解，產生的堿性物質堆積，使蝦肉的pH 值呈增大趨勢[20-22]。凍藏12 至24 周，各組pH 值仍呈增大趨勢，但不顯著（P＞0.05），可能是蝦肉蛋白質已被大量分解，同時，水分含量輕微增加（數(shù)據(jù)未顯示），使得堿性物質濃度較低。

表4 小龍蝦凍藏過程中pH 值的變化Table 4 Change in pH value of red swamp crayfish during freezing storage

凍藏溫度相同時，凍藏至第12 周，pH 值隨凍結溫度的降低而減小，凍結溫度-20 ℃與-55 ℃差異顯著（P＜0.05）。這與范碧琴等[23]的研究結果類似，可能是-55 ℃使小龍蝦的中心溫度更快達到-15 ℃，減少了微生物繁殖的時間。同時，較低的凍結溫度能滅活更多不耐低溫的微生物，降低了小龍蝦肉的初始微生物數(shù)量，微生物分解蛋白質產生的堿性胺類物質更少，因此較低凍結溫度組的pH 值更小。這種堿性胺類物可以通過TVBN 值的半微量定氮法檢測出，后面的TVB-N 值測定結果驗證了pH 值在凍藏中后期增大的現(xiàn)象；凍藏第12 至第24 周，凍結溫度為-55 ℃時，凍藏溫度-40 ℃相較-20 ℃，小龍蝦肉的pH 值顯著減?。≒＜0.05）。這可能是較低的凍藏溫度較好地抑制微生物的繁殖，使蛋白質降解速度減慢，導致pH 值變化減緩，pH 值較小。

2.5 小龍蝦凍藏過程中TVB-N 值的變化

我國標準規(guī)定了可食用淡水魚蝦的TVB-N值應不超過20 mg/100 g[23]。由表5可以看出，小龍蝦肉的TVB-N 值隨著時間的延長均呈現(xiàn)增大的趨勢。這可能是微生物數(shù)量隨時間的延長而增加，降解蛋白質產生的非蛋白氮更多[24]。

表5 小龍蝦凍藏過程中TVB-N 值的變化Table 5 Change in TVB-N value of red swamp crayfish during freezing storage

-20 ℃凍結的小龍蝦肉的TVB-N 值顯著低于-40 和-55 ℃（P＜0.05）。這可能是較低的凍結溫度使更多不耐低溫的微生物失活甚至死亡，也驗證了pH 值在凍藏中后期增大的現(xiàn)象[25]。

凍結溫度相同時，凍藏溫度-40 ℃相較-20 ℃，TVB-N 值增大速率降低（P＜0.05）。這可能是較低的凍藏溫度使得小龍蝦在凍藏期間增長的微生物數(shù)量較低，因此小龍蝦在凍藏期間腐敗變質的速度降低。-20 ℃凍結-20 ℃凍藏的小龍蝦在凍藏至第24 周時，TVB-N 值達到約22.32 mg/100 g，超過了國家標準（GB 2733-2015）規(guī)定值，已不適合食用。

2.6 小龍蝦凍藏過程中肌肉微觀結構的變化

由圖2可以看出，未經凍藏的小龍蝦肉肌纖維孔隙分布均勻、排列有序，一層薄的結締組織（肌內膜）包圍著肌纖維，肌束膜和肌內膜與肌纖維連接緊密，肌纖維之間的孔隙可能是沸水熱燙導致的肌纖維熱變性或制樣切割時造成的機械損傷。

圖2 小龍蝦凍藏過程中肌肉微觀組織結構的變化Fig.2 Change in myofibrillar microstucture of red swamp crawfish during freezing storage

凍藏溫度相同時，隨著凍藏時間的延長，小龍蝦肌肉結構（橫斷面）的孔隙均增大、肌纖維排列混亂。凍結溫度較低的小龍蝦，肌纖維之間孔隙更小更均勻，肌束膜、肌內膜和肌纖維之間更緊密。-55 ℃凍結的小龍蝦肉的肌纖維橫斷面在凍藏6周與新鮮時差別不大。這可能是較低的凍結溫度使小龍蝦的中心溫度更迅速降至-15 ℃，形成冰晶較小，因此較好地保持了小龍蝦凍結過程中肌肉的完整性。這也驗證了-55 ℃凍結的小龍蝦肉剪切力和持水率較高的現(xiàn)象[26]。

凍結溫度相同時，與-20 ℃比較，凍藏溫度-40 ℃的肌纖維孔隙更多、更小，且肌纖維斷裂程度較輕，膜和結締組織顆粒脫落更多，與Qian等[28]觀察到的現(xiàn)象類似。這可能是較高的凍藏溫度下，更多肌纖維和肌內膜、肌束膜等結締組織被降解，使得蛋白質變性更嚴重，因此SEM 能觀察到不平整的肌纖維橫切面，以及覆蓋在肌纖維表面破碎的顆粒狀的膜。這與Xie 等[29]觀察到凍藏蝦肉的微觀結構類似。-20 ℃凍藏組在凍藏第12 周時，肌纖維孔隙明顯增大，肌纖維發(fā)生斷裂，并可以看到膜和結締組織顆粒的脫落，這可能是失水和蛋白質降解導致肌纖維收縮[29-31]。-40 ℃凍藏組在凍藏第18 周時出現(xiàn)上述現(xiàn)象。凍藏第24 周時，所有試驗組的孔隙進一步增大，每束肌肉被擠壓，聚集更加緊密。

SEM 觀察到的小龍蝦肌肉橫斷面的變化跟汁液流失率、持水率、剪切力、水分狀態(tài)等類似，進一步說明了凍結溫度和凍藏溫度明顯影響了小龍蝦肉的肌纖維結構，較低的凍結和凍藏溫度使小龍蝦凍藏過程中的品質劣化程度輕，小龍蝦肉的品質更好。

2.7 小龍蝦凍藏過程中水分狀態(tài)的變化

如圖3所示，弛豫時間小于10 ms 的部分代表結合水，弛豫時間小于100 ms 大于10 ms 的部分代表不易流動水，弛豫時間大于100 ms 的部分代表自由水，峰面積占比P21、P22、P23分別代表結合水、不易流動水、自由水3 種水分狀態(tài)的占比[32]。

圖3 小龍蝦凍藏過程中水分狀態(tài)的變化Fig.3 Change in moisture state of red swamp crawfish during freezing storage

P21和P22隨凍藏時間的延長逐漸減小，P23則逐漸增大。這說明小龍蝦肉的水分逐漸由結合水和不易流動水轉化成自由水，自由水增多造成解凍后汁液流失率增大，與汁液流失率結果一致。這可能是凍藏過程中肌纖維被微生物降解，同時冰晶逐漸增大，破壞肌纖維的結構，使得肌纖維結合水的能力下降。

凍藏溫度相同時，凍結溫度對P21、P22、P23影響不顯著。凍結溫度相同時，凍藏溫度-20 ℃組的P22明顯小于-40 ℃組的，P23則大于-40 ℃組的。這可能是較低的凍藏溫度抑制了重結晶過程和微生物對肌纖維的降解，減少了向自由水轉化的不易流動水。

3 結論

凍結溫度和凍藏溫度顯著影響了小龍蝦凍藏過程中的品質變化。較低的凍結溫度通過加快凍結速度，使得形成的冰晶較小，降低了對肌纖維的破壞程度；較低的凍藏溫度抑制重結晶和微生物繁殖，保護了小龍蝦肌肉的組織結構和肌纖維的完整性，結合水和不易流動水的比例較高，使得小龍蝦肉的汁液流失率、剪切力、pH 值、TVB-N 值較低，持水率較高，從而使小龍蝦保持更好的品質。