薛 茂，朱本忠，吳培文，杜瑩琳，初易洋，張瑞家

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

果實的發(fā)育與成熟是高等植物生命周期中的一個特有階段，它包含細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞膨大、果實發(fā)育、果實成熟與衰老5 個階段[1]。而果實成熟是果實食用品質(zhì)形成的關(guān)鍵時期。在這個時期，大量成熟相關(guān)基因的時空特異性表達(dá)使得果實發(fā)生顏色、風(fēng)味、質(zhì)地等一系列生理、生化變化，從而形成果實獨特的成熟品質(zhì)[1]。果實成熟受諸多調(diào)控因子的共同調(diào)控，如乙烯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 的甲基化修飾等[2]。根據(jù)對果實成熟進(jìn)程的調(diào)控作用，將這些調(diào)控因子分為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子。過去關(guān)于果實成熟和品質(zhì)調(diào)控的研究主要集中于正調(diào)控因子的挖掘與功能解析，而近年來研究發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控因子在果實成熟及品質(zhì)形成中也扮演著十分重要的角色，這其中包括參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制子，參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的負(fù)調(diào)控因子，參與翻譯后水平調(diào)控的負(fù)調(diào)控因子以及其它負(fù)調(diào)控因子。本文綜述近年來發(fā)現(xiàn)的參與果實成熟及品質(zhì)形成的各類負(fù)調(diào)控因子及其作用機制，旨在為果實成熟及品質(zhì)形成的深入研究提供理論基礎(chǔ)與研究思路。

1 參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制因子

轉(zhuǎn)錄因子是一類具有特定功能的蛋白質(zhì)，它通過結(jié)合靶基因的啟動子區(qū)域來激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子一般含有DNA 結(jié)合區(qū)、寡聚化位點、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、核信號定位區(qū)4個功能區(qū)[3]。其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)決定了轉(zhuǎn)錄因子是激活還是抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，我們可以根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的功能將其分為轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子兩種類型。轉(zhuǎn)錄抑制子又可以分為被動抑制子和主動抑制子。被動抑制子主要通過與激活子競爭相同的DNA 結(jié)合位點或與激活子結(jié)合并形成一個沒有激活活性的復(fù)合物來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用[4]。主動抑制子含有一個抑制域，通常通過染色體結(jié)構(gòu)修飾（如組蛋白的去乙?；┗蛘吲c激活子相互作用而行使抑制功能[4-5]。主動抑制子的抑制域又可分為EAR 基序[5]，LxLxL 基序[6]、富脯氨酸抑制域[7]、DLN 盒[8]以及OVATE 抑制域5 個類型[9]。

1.1 AP2/ERFs 家族轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERFs 具有APETALA2 （AP2）/乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子（EREB）結(jié)構(gòu)域的特征，該結(jié)構(gòu)域含有40～70 個保守的與DNA 結(jié)合相關(guān)的氨基酸。AP2/ERFs 家族包含AP2、RAV、DREB 和ERF 4個主要的亞家族[10]。目前研究表明，AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育、果實成熟及防御反應(yīng)等多種代謝途徑[12-14]，其可以作為乙烯信號通路中的響應(yīng)元件，從而調(diào)控乙烯、生長素（indole-3-acetic acid，IAA）、細(xì)胞分裂素、赤霉素（Gibberellins，GAs）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）等植物激素的生物合成[11-13]。

在番茄果實中，SlAP2a 基因的表達(dá)水平與果實成熟進(jìn)程呈正相關(guān)，并在紅熟期維持較高的水平。在番茄植株中通過RNA 干擾（RNA interference，RNAi）沉默SlAP2a 基因后，轉(zhuǎn)基因番茄果實發(fā)育及成熟發(fā)生了顯著改變，包括果實體積變小，果實成熟提前及軟化提前等。同時，SlAP2a 基因沉默的番茄果實乙烯合成增加，番茄紅素的積累顯著降低，而β-胡蘿卜素及葉綠素含量顯著增加，成熟相關(guān)基因（ACS2、ACS4、ACO1、E4、E8、RIN 以及PG2a）的表達(dá)水平上升，這表明SlAP2a 可以通過抑制乙烯與類胡蘿卜素的生物合成負(fù)向調(diào)控果實成熟[14]。利用RNAi 沉默番茄中的SlERF6，轉(zhuǎn)基因番茄果實的類胡蘿卜素含量以及乙烯釋放量均升高，同時乙烯合成相關(guān)基因ACS2、ACO1 和ACO3 的表達(dá)量升高，表明SlERF6 能夠通過直接或間接的方式抑制番茄果實類胡蘿卜素的積累和乙烯的合成，是番茄果實成熟的抑制子[15]。

在枇杷果實中，轉(zhuǎn)錄因子EjAP2-1 可以通過負(fù)調(diào)控木質(zhì)素的生物合成從而影響枇杷果實成熟過程中的質(zhì)地和風(fēng)味。Zeng 等[16]從低溫貯藏的枇杷果實中分離了18 個AP2/ERF 家族基因，發(fā)現(xiàn)EjAP2-1 的表達(dá)水平與果實木質(zhì)化程度呈負(fù)相關(guān)，且序列分析表明其具有1 個EAR 抑制基序。同時，雙熒光素酶分析表明，EjAP2-1 可以抑制木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵基因Ej4CL1 啟動子的活性，但EjAP2-1 并未直接作用于Ej4CL1 的啟動子區(qū)域。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EjAP2-1 與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的EjMYB1 和EjMYB2 蛋白之間存在互作，其通過與EjMYB1 或EjMYB2 結(jié)合共同抑制Ej4CL1啟動子的活性。因此，EjAP2-1 是木質(zhì)素生物合成的間接轉(zhuǎn)錄抑制子，其抑制作用主要來源于EAR抑制區(qū)域，并通過與EjMYB 蛋白的互作來實現(xiàn)。

在獼猴桃果實中，Yin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)AdERF9基因也含有EAR 抑制域，其能夠與細(xì)胞壁降解相關(guān)基因AdXET5 的啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，從而在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控獼猴桃果實的成熟和軟化。

在蘋果果實中，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)瞬時沉默MdERF2 基因后，蘋果果實的乙烯釋放量顯著增加且果實成熟提前。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子MdERF2 通過和乙烯生物合成關(guān)鍵基因MdACS1的啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，同時，MdERF2 還可以通過抑制MdERF3 啟動子的活性，間接抑制MdACS1 的表達(dá)。因此，MdERF2 通過多種機制抑制MdACS1 的轉(zhuǎn)錄，從而負(fù)調(diào)控蘋果果實的乙烯生物合成及成熟進(jìn)程[18]。

在香蕉果實中，轉(zhuǎn)錄因子MaERF11 可以將MaHDA1 蛋白募集到乙烯合成關(guān)鍵基因MaACO1和果實軟化相關(guān)基因MaEXP2/7/8 的啟動子上并抑制其轉(zhuǎn)錄，同時通過組蛋白去乙?；瘉硪种七@些基因的表達(dá)，說明MaERF11 通過抑制乙烯合成和細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)來負(fù)調(diào)控香蕉果實成熟[19]。此外，在香蕉中與番茄SlAP2a 同源性較高的轉(zhuǎn)錄因子MaAP2a-1 也是一個轉(zhuǎn)錄抑制子，其通過與香蕉果實中15 個淀粉降解基因的啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制香蕉果實采后成熟過程中的淀粉降解[20]，負(fù)向調(diào)控香蕉果實的后熟過程。MaDEAR1 是香蕉中的DREB 亞家族基因，預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)具有與DRE 結(jié)合的APETALA2 （AP2） 域和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄抑制的EAR 基序，雙熒光素酶報告試驗也表明其具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。在香蕉果實成熟過程中，MaDEAR1 調(diào)控區(qū)域的組蛋白H3 和H4 乙?；浇档停瑫rMaDEAR1 可直接與細(xì)胞壁修飾基因 （包括Ma-EXP1/3，MaPG1，MaXTH10，MaPL3 和MaPME3）的啟動子上的DRE/CRT 基序結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而負(fù)調(diào)控香蕉果實的成熟軟化[21]。Kuang 等[22]通過ChIP-Seq 在香蕉基因組上確定了697 個MaDREB2 的潛在靶標(biāo)，其結(jié)合位點分布在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的啟動子區(qū)域。大多數(shù)MaDREB2 的靶標(biāo)均包含保守的（A/G）CC（G/C）AC 基序，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，MaDREB2 可能直接調(diào)控了許多與果實成熟相關(guān)基因的表達(dá)，且可同時作為轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子調(diào)控香蕉果實成熟。

1.2 MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子

MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列上都有一段保守的DNA 結(jié)合區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域的N 端是高度保守的，包含1～3 個串聯(lián)且不完全重復(fù)的結(jié)構(gòu)：R1/R2/R3。根據(jù)MYB 轉(zhuǎn)錄因子含有的R 結(jié)構(gòu)個數(shù)將其分為4 類：R1-MYB 蛋白、R2R3-MYB 蛋白、R1R2R3-MYB 蛋白以及含有4 個R 結(jié)構(gòu)的MYB轉(zhuǎn)錄因子[23]。具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的MYB 轉(zhuǎn)錄因子一般C 端具有1 個EAR 抑制基序或者TLLLFR抑制基序[24]。

在香蕉果實中，轉(zhuǎn)錄因子MaMYB3 可以與淀粉降解的關(guān)鍵酶基因MaGWD1 的啟動子區(qū)域結(jié)合并抑制其表達(dá)。同時，MaMYB3 還抑制了其它9個與淀粉降解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括MaSEX4、MaBAM7/8、MaAMY2B、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaMEX1 和MapGlcT2-1。同時，與淀粉降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活子MabHLH6 的啟動子活性也被MaMYB3 抑制。在番茄中異源過表達(dá)MaMYB3 會下調(diào)淀粉降解相關(guān)基因的表達(dá)水平，抑制淀粉降解并延遲果實成熟。因此，MaMYB3 可以通過直接結(jié)合并抑制淀粉降解相關(guān)基因的啟動子，同時抑制淀粉降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活子編碼基因MabHLH6 的轉(zhuǎn)錄來負(fù)調(diào)控香蕉果實的成熟[25]。

在番茄果實中，Cao 等[26]發(fā)現(xiàn)了一個依賴于EAR 基序的轉(zhuǎn)錄抑制子SlMYB70。SlMYB70 可以通過直接結(jié)合乙烯合成關(guān)鍵基因SlACS2 和SlACO3 的啟動子區(qū)域并抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致乙烯生物合成受到抑制，進(jìn)而負(fù)調(diào)控番茄果實的成熟進(jìn)程。

在茄子果實中，利用VIGS 技術(shù)沉默Sm-MYB19 后，茄子果實中的花青素含量顯著增加，并且花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因CHI、F3GT、PAL、DFR、ANS、5GT、UFGT 的表達(dá)模式發(fā)生明顯改變，這說明轉(zhuǎn)錄因子SmMYB19 可抑制茄子果實花青素的積累，從而調(diào)控茄子果實的成熟過程中的品質(zhì)形成[27-28]。

在柑桔果實中，R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子CrMYB68 可以直接結(jié)合CrBCH2 和CrNCED5 的啟動子并抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化以及ABA 的生物合成受到抑制，從而負(fù)調(diào)控柑桔果實的成熟和營養(yǎng)品質(zhì)的形成[29]。CsMYB77 結(jié)構(gòu)上也屬于R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)CsMYB77 基因的柑桔果實破色時間延長3 d，說明其可能負(fù)調(diào)控柑桔果實的成熟進(jìn)程[30]。

在鴨梨果實中，轉(zhuǎn)錄因子PbMYB120 被認(rèn)為是一種潛在的花青素生物合成調(diào)節(jié)因子。Pb-MYB120 的瞬時過表達(dá)抑制了花青素的積累和花色苷生物合成關(guān)鍵基因PbUFGT1 的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明PbMYB120 可與PbUFGT1 的啟動子結(jié)合并抑制其啟動子的活性，進(jìn)而負(fù)調(diào)控花色苷的生物合成。此外，PbMYB120 可能與花色苷轉(zhuǎn)錄激活因子協(xié)同作用，平衡鴨梨果實成熟進(jìn)程中的花色苷積累[31]。

1.3 MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子

MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，其在植物中行使多種重要的生物學(xué)功能，特別是在花器官發(fā)育，果實發(fā)育與成熟過程中[32]。MADS-box 結(jié)構(gòu)域通常位于MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子的N 末端，是MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合單元，負(fù)責(zé)識別和結(jié)合靶基因的啟動子。MADSbox 蛋白間通常存在相互作用，可結(jié)合成同源二聚體，有時也能與其它蛋白或輔助因子結(jié)合形成異源二聚體[32]。與果實成熟及品質(zhì)形成相關(guān)的MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄抑制子在番茄中發(fā)現(xiàn)較多，下面主要介紹在番茄中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制子。

轉(zhuǎn)錄因子SlMADS1 屬于SEPALLATA（SEP）亞家族。研究表明，SlMADS1 主要在番茄果實中表達(dá)，并且表達(dá)水平隨著果實的發(fā)育和成熟而逐漸降低。通過RNAi 技術(shù)沉默SlMADS1 后，轉(zhuǎn)基因番茄果實成熟時間提前3～6 d，類胡蘿卜素水平顯著提高，果實的乙烯生成量提高了約2～4 倍。果實成熟相關(guān)基因ACS2、ACO1、ACO3、E4 以及E8 基因表達(dá)量上升，兩個參與脅迫應(yīng)答的基因ERF1 和Pti4 表達(dá)水平下降，表明SlMADS1 在番茄果實成熟過程中起著負(fù)調(diào)控作用[33]。

轉(zhuǎn)錄因子SlFYFL 被證實是番茄果實成熟的負(fù)調(diào)控因子。在番茄中過表達(dá)SlFYFL 后，轉(zhuǎn)基因番茄果實成熟延遲，類胡蘿卜素積累減少，乙烯生物合成水平和乙烯響應(yīng)基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。同時，轉(zhuǎn)基因果實離層不能正常形成，并且離層發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)量下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)YFL 可以分別與RIN，MADS1 和JOINTLESS 相互作用，表明FYFL 可以通過與果實成熟和離層發(fā)育相關(guān)的MADS-box 蛋白相互作用來調(diào)控果實成熟進(jìn)程和離層的發(fā)育[34]。

MADS 家族轉(zhuǎn)錄因子SlMBP8 也以負(fù)調(diào)控因子的形式參與番茄果實成熟的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與野生型番茄果實相比，SlMBP8 沉默的轉(zhuǎn)基因番茄果實的成熟時間縮短了2～4 d。轉(zhuǎn)基因番茄果實的乙烯生成量和類胡蘿卜素水平上升，乙烯合成途徑相關(guān)基因ACO1、ACO3、ACS2、ERF1、E4 和E8 和類胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵基因PSY1、PDS和ZDS 的表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因如PG，EXP，HEX，TBG4，XTH5 和XYL 的表達(dá)水平也同樣上調(diào)。這些結(jié)果表明SlMBP8 在果實成熟和軟化中起重要的負(fù)調(diào)控作用[35]。

轉(zhuǎn)錄因子SlSL4 也被認(rèn)為參與番茄果實成熟的負(fù)調(diào)控。在番茄果實中過表達(dá)SlSL4，轉(zhuǎn)基因番茄果實成熟時間推遲，且轉(zhuǎn)基因番茄果實中乙烯生物合成相關(guān)基因（ACO1、ACO3、ACS2）和成熟相關(guān)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因RIN 的表達(dá)水平在果實成熟階段被顯著下調(diào)，乙烯響應(yīng)基因（E4、E8、ERF1）的表達(dá)水平同樣下調(diào)，類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因PSY1 的表達(dá)水平在成熟前期顯著低于野生型果實，說明SlSL4 基因可能通過抑制乙烯合成和類胡蘿卜素合成途徑，從而負(fù)調(diào)控番茄果實的成熟[36]。

此外，在枇杷果實中，MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子EjMADS1 被發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合參與木質(zhì)化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活子EjMYB8 的啟動子，并顯著抑制其活性。結(jié)合其表達(dá)模式與序列結(jié)構(gòu)信息，推測Ej-MADS1 是枇杷果實木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄抑制子[37]。

1.4 鋅指蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子

鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)域是由鋅原子作為核心、半胱氨酸和組氨酸包圍鋅原子形成的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)[38]。根據(jù)與鋅離子結(jié)合的半胱氨酸和組氨酸殘基數(shù)目，可分為C2H2、C2C2、C2HC、C2HC5、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6、C8 這10 種不同類型。鋅指蛋白主要通過與DNA、RNA 結(jié)合以及與其它蛋白互作來激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長發(fā)育、抗逆等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用[39]。

在番茄果實中，鋅指蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子SlCOL4 可作為果實成熟過程中ABA 和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個互作位點，且對果實成熟進(jìn)程起負(fù)調(diào)控作用。通過VIGS 沉默SlCOL4 可以促進(jìn)番茄果實成熟。與野生型果實相比，SlCOL4 沉默果實中乙烯合成通路上關(guān)鍵基因ACO1、ACS2 和ACS4的表達(dá)水平顯著上升，說明轉(zhuǎn)錄因子SlCOL4 在果實中通過負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成對果實成熟過程起負(fù)調(diào)控作用[40]。

在香蕉果實中，MaDof23 也是一個轉(zhuǎn)錄抑制子，其可以與促進(jìn)香蕉果實成熟的轉(zhuǎn)錄激活子MaERF9 互作。同時，這兩個蛋白之間存在拮抗作用，競爭MaEXP1/2/3/5、MaXET7、MaPG1、MaPME3等果實成熟相關(guān)基因的啟動子位點，進(jìn)而調(diào)控果實成熟過程中的細(xì)胞壁降解和香氣合成[41]。

2 轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)調(diào)控因子

2.1 MicroRNAs（miRNAs）類負(fù)調(diào)控因子

miRNAs 是一類擁有20～24 個核苷酸（或堿基對），可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控真核生物基因表達(dá)的特殊小分子非編碼RNA。在植物中，miRNAs 通過對含有高度互補序列的靶mRNA 進(jìn)行切割或翻譯抑制，進(jìn)而負(fù)調(diào)控靶mRNA 的進(jìn)一步表達(dá)[42]。成熟的miRNAs 來源于單鏈RNA 轉(zhuǎn)錄本，具有不完善的莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)[43]。這些二級結(jié)構(gòu)被DCL1 加工成細(xì)胞核中的miRNA 雙鏈，并被運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[44-45]，隨后miRNAs 被整合到RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 （RNA-induced silencing complex，RISC）中，RISC 利用miRNAs 作為向?qū)碜R別互補的靶mRNA，并通過降解或抑制其翻譯來負(fù)調(diào)控它們的表達(dá)[46-47]。植物miRNAs 參與多種重要的生物學(xué)過程，如葉片形態(tài)建成、花器官識別、逆境應(yīng)答以及果實成熟等[42]。

在柿子果實中，原花青素（Proanthocyanidin，PA）的生物合成受相關(guān)結(jié)構(gòu)基因控制，而這些結(jié)構(gòu)基因又受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，例如PA 生物合成途徑中的轉(zhuǎn)錄激活子DkMYB19 和DkMYB20。miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在果實中瞬時過表達(dá)miR858b會抑制DkMYB19、DkMYB20 以及PA 生物合成通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控柿子果實成熟進(jìn)程中PA 的積累[48]。

在獼猴桃果實中，miR858 在花色苷生物合成和積累中起負(fù)調(diào)控作用。過表達(dá)miR858 使得獼猴桃果實的著色程度很低，且花青素的積累幾乎被完全阻斷。在煙草中進(jìn)行瞬時共轉(zhuǎn)化試驗證實miR858 可以靶向MYB-R2R3 型花色苷生物合成轉(zhuǎn)錄激活子AaMYBC1 的編碼基因，且miR858 過表達(dá)比AaMYBC1 沉默對獼猴桃果實著色的抑制作用更強。類似的，在番茄果實中，miR858 通過抑制兩個MYB-R2R3 型轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來負(fù)調(diào)控番茄果實中的花色苷生物合成[49]。

在番茄果實中，過表達(dá)Sly-miR157 前體和成熟體基因均能顯著延緩Ailsa Craig 番茄果實的成熟進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Sly-miR157 在體內(nèi)高豐度表達(dá)時，可直接對LeSPL-CNR mRNA 進(jìn)行切割，抑制LeSPL-CNR 基因表達(dá)和后續(xù)的蛋白翻譯。但當(dāng)Sly-miR157 表達(dá)量降低時，其僅在翻譯水平上抑制LeSPL-CNR 而不影響LeSPL-CNR mRNA 表達(dá)[50]。

2.2 長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）類負(fù)調(diào)控因子

LncRNA 是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA。LncRNA 可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而在染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)在已有的研究表明lncRNA 在應(yīng)對非生物和生物脅迫[51]、開花[52]以及果實成熟[53]等過程中起重要作用。

在沙棘果實中，通過VIGS 沉默LNC1 會導(dǎo)致果實花青素含量增加和花青素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因F3’H、DFR 和LDOX 的表達(dá)水平上升。同時，LNC1 的沉默也會導(dǎo)致miR156a 表達(dá)水平上升以及花青素合成負(fù)調(diào)控因子SPL9 表達(dá)水平下調(diào)。現(xiàn)有的研究表明，miR156a 能抑制花青素生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄抑制子SPL9 的豐度從而正調(diào)控花青素的合成過程[54]。因此，LNC1 可能通過抑制miR156a 的表達(dá)來增加轉(zhuǎn)錄因子SPL9 的豐度，從而負(fù)向調(diào)控花青素的合成和累積[55]。

在荔枝果實中，lncNAC13 能夠負(fù)調(diào)控花青素生物合成相關(guān)基因LcCHS1/2、LcCHI、LcF3H、LcF3’H、LcDFR 和LcMYB1 的表達(dá)，從而抑制荔枝果實成熟進(jìn)程中花青素的積累[56]。

3 翻譯后水平的負(fù)調(diào)控因子

在植物的生長發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)的泛素化修飾發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，包括參與調(diào)控細(xì)胞生命周期，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和機體的損傷修復(fù)等幾乎一切生命活動。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可以介導(dǎo)泛素化的靶蛋白選擇性降解，其中泛素通過3 種酶：泛素激活酶E1，泛素結(jié)合酶E2 和泛素連接酶E3 的作用與靶蛋白共價連接，泛素首先被E1 激活，活化的泛素被轉(zhuǎn)移至E2、E3 募集靶蛋白和泛素分子并將泛素轉(zhuǎn)移至靶蛋白，隨后泛素化的靶蛋白可被蛋白酶體降解，進(jìn)而形成多種生物學(xué)效應(yīng)[57]。

在香蕉果實中，通過蛋白互作驗證試驗和泛素降解試驗發(fā)現(xiàn)，RING 類E3 泛素連接酶MaXB3可與轉(zhuǎn)錄因子MaNAC2、乙烯生物合成途徑關(guān)鍵酶MaACS1 和MaACO1 互作，并通過26S 蛋白酶體途徑泛素化降解MaNAC2、MaACS1 和MaACO1，削弱MaNAC2 對成熟負(fù)調(diào)控因子MaERF11編碼基因的轉(zhuǎn)錄抑制能力和乙烯生物合成，進(jìn)而負(fù)調(diào)控香蕉果實的成熟進(jìn)程[58]。MaLUL2 基因編碼香蕉中的一個環(huán)狀E3 泛素連接酶，其在體外具有E3 泛素連接酶活性。在香蕉果皮中瞬時過表達(dá)MaLUL2 提高了果實的泛素化水平，并導(dǎo)致了持綠表型，同時葉綠素降解代謝基因的表達(dá)下調(diào)。這表明MaLUL2 可能作為一個負(fù)調(diào)控因子調(diào)控香蕉果實成熟和葉綠素降解[59]。

在番茄果實中，F(xiàn)-box 蛋白SlAMR1 可能通過其保守結(jié)構(gòu)域F-box 構(gòu)成SCF E3 泛素連接酶（Skp1-Cul1-F-box 蛋白），進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。在番茄中過表達(dá)SlAMR1 后，對轉(zhuǎn)基因果實做泛素表達(dá)水平檢測，發(fā)現(xiàn)其泛素表達(dá)水平上調(diào)，抗壞血酸的積累減少，而沉默SlAMR1 的轉(zhuǎn)基因番茄果實中抗壞血酸積累增多。這表明SlAMR1 可能通過泛素-蛋白酶體途徑負(fù)調(diào)控番茄果實成熟過程中抗壞血酸的生物合成[60]。

在蘋果果實中，RING 型E3 泛素連接酶Md-MIEL1 可與蘋果花色苷生物合成和果實著色的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)因子MdMYB1 的互作，并促進(jìn)MdMYB1泛素化降解，從而負(fù)調(diào)控蘋果果實花青素的積累[61]。同時，蘋果泛素E3 連接酶MdCOP1 也可以與MdMYB1 互作，并通過泛素化降解MdMYB1 蛋白來負(fù)調(diào)控蘋果果實成熟進(jìn)程中的果皮著色[62]。此外，SmCOP1 也可以在番茄果實成熟、類胡蘿卜素積累以及乙烯生成等方面發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[63]。BTB 蛋白是CUL3-RING E3 連接酶和底物蛋白之間的橋梁，是蛋白泛素化降解途徑中的必要元件。MdMYB9 是蘋果果實花青素和原花青素生物合成途徑中的正調(diào)控因子，MdWRKY40 是創(chuàng)傷誘導(dǎo)的花色苷生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。MdBT2 可以與MdMYB9 和MdWRKY40 相互作用，并通過26S 蛋白酶體系統(tǒng)負(fù)調(diào)控MdMYB9 和Md-WRKY40 蛋白的豐度，進(jìn)而降低花色苷和原花色素相關(guān)基因的表達(dá)水平，減少蘋果果實成熟進(jìn)程中花色苷和原花色素的積累[64]。

在葡萄果實中，E3 連接酶VlPUB38 是葡萄果實成熟的一個負(fù)調(diào)控因子。在草莓中異源過表達(dá)VlPUB38 會導(dǎo)致草莓果實表現(xiàn)出顯著的成熟抑制表型，但外源ABA 處理可以使其恢復(fù)為正常的成熟表型。進(jìn)一步研究表明，VlPUB38 的U-box 保守結(jié)構(gòu)域具有泛素連接酶活性，其通過與ABA 生物合成途徑中的關(guān)鍵因子脫落醛氧化酶（VlAAO）相互作用，并通過26S 蛋白酶體系統(tǒng)靶向降解VlAAO，從而抑制ABA 的生物合成，進(jìn)而負(fù)調(diào)控葡萄果實的成熟過程[65]。

4 其它負(fù)調(diào)控因子

除轉(zhuǎn)錄因子和泛素化途徑相關(guān)蛋白外，部分其它蛋白也可以通過不同途徑參與果實成熟及品質(zhì)形成的負(fù)調(diào)控。乙烯受體蛋白ETR 是果實成熟的負(fù)調(diào)控因子，其通過激活下游的蛋白激酶CTR抑制乙烯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而負(fù)調(diào)控果實成熟。沉默SlETR4 或SlETR6，可導(dǎo)致番茄果實提早成熟。位于ETR 下游的蛋白激酶CTR 也是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，其通過使乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件EIN2 發(fā)生磷酸化抑制乙烯信號傳遞至細(xì)胞核，從而負(fù)調(diào)控果實成熟[66]。利用VIGS 技術(shù)沉默番茄果實中的CTR1 基因，發(fā)現(xiàn)番茄果實CTR1 基因沉默部位提前成熟，證實了SlCTR1 對番茄果實成熟具有負(fù)調(diào)控作用[67]。此外，Polycomb-group（PcG）蛋白是一類可以通過甲基化和泛素化等染色質(zhì)修飾來調(diào)控靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子。在番茄中，PcG 蛋白SlMSI1 通過負(fù)調(diào)控成熟相關(guān)基因（RIN，CNR、TDR4、ACS2、ACS4、PG、MAN4） 的表達(dá)來抑制果實成熟[68]。Han 等[69]發(fā)現(xiàn)高溫可以顯著加速草莓果實成熟的啟動，且高溫條件下一系列果實成熟相關(guān)基因的表達(dá)水平會迅速上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)草莓蛋白激酶基因FaSnRK2.6 可以抑制高溫誘導(dǎo)的成熟相關(guān)基因的表達(dá)，且成熟相關(guān)基因的表達(dá)水平始終與FaSnRK2.6 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這表明FaSnRK2.6 可能負(fù)調(diào)控高溫誘導(dǎo)的草莓果實成熟。

DNA 甲基化修飾的相關(guān)因子可參與果實成熟及品質(zhì)形成的調(diào)控。DNA 甲基化修飾是DNA序列上的特定堿基在DNA 甲基化酶的作用下從S-腺苷甲硫氨酸獲得1 個甲基并與之共價結(jié)合的過程，該過程主要通過調(diào)控色素、芳香族化合物和植物激素生物合成以及細(xì)胞壁降解途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平來調(diào)控番茄、草莓、甜橙等各類果實的成熟進(jìn)程[70-72]。利用VIGS 技術(shù)將甜椒中編碼甲基化酶的CaMET1-like1 基因沉默可以使辣椒果實成熟提前4～8 d，且可促進(jìn)六氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、葉黃素等在辣椒果實中的積累，說明甲基化酶CaMET1-like1 是辣椒果實成熟的一個負(fù)調(diào)控因子[73]。

植物激素在果實成熟和品質(zhì)形成的過程中起到重要的調(diào)控作用。例如GAs 通常被認(rèn)為可以抑制果實成熟[74]，而IAA 通常被認(rèn)為是非呼吸躍變型果實成熟的抑制因子，其通過拮抗ABA 的作用而對果實成熟起到負(fù)調(diào)控作用[75]。水楊酸可通過抑制乙烯生物合成關(guān)鍵酶ACO 的活性負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成，進(jìn)而抑制果實成熟進(jìn)程[76]。此外，褪黑素作為一種重要的植物內(nèi)源激素，近年也被認(rèn)為是一種果實成熟的負(fù)調(diào)控因子，并廣泛應(yīng)用于延緩果實采后衰老，例如外源褪黑素處理可通過誘導(dǎo)提高荔枝果實的內(nèi)源褪黑素水平和抗氧化能力以延緩荔枝果實在常溫貯藏期間的衰老進(jìn)程，通過抑制芒果果實乙烯和脫落酸的生物合成延緩采后芒果果實的成熟進(jìn)程[77]。

植物體內(nèi)的生物活性分子NO 也是果實成熟過程中重要的負(fù)調(diào)控因子。在果實成熟過程中，NO 含量逐漸降低，同時伴隨著蛋白質(zhì)硝化和亞硝化水平的上升。而大量研究表明，外源NO 處理可有效延緩果實成熟，抑制果實冷害的發(fā)生，提高果實的抗病能力和營養(yǎng)品質(zhì)[78]。此外，NO 供體硝酸鹽也是柑桔果實成熟的負(fù)調(diào)控因子，其可以通過促進(jìn)葉綠素的生物合成并抑制類胡蘿卜素的積累，進(jìn)而延遲柑桔果實破色[79]。

5 結(jié)語

植物果實具有復(fù)雜的調(diào)控機制來精確調(diào)控果實成熟及品質(zhì)形成，以適應(yīng)各種發(fā)育和環(huán)境信號。對果實成熟及品質(zhì)形成調(diào)控的大量研究發(fā)現(xiàn)了一系列相關(guān)正調(diào)控因子，但研究也表明，果實的成熟及品質(zhì)形成過程中也受到諸多負(fù)調(diào)控因子的調(diào)控，這可能是植物為了平衡在相同代謝路徑中產(chǎn)生潛在的有毒物質(zhì)，降低對細(xì)胞產(chǎn)生的不良影響，或是降低果實成熟過程中物質(zhì)和能量的消耗，從而更好地適應(yīng)多變的環(huán)境。盡管目前關(guān)于負(fù)調(diào)控因子的研究取得了較大進(jìn)展，但仍然有很多科學(xué)問題亟待解決，例如還有許多果實成熟與品質(zhì)形成的負(fù)調(diào)控因子尚未被發(fā)現(xiàn)、負(fù)調(diào)控因子與正調(diào)控因子協(xié)同作用的具體機制、負(fù)調(diào)控因子與正調(diào)控因子在特殊條件下的相對性等。因此，繼續(xù)挖掘相關(guān)負(fù)調(diào)控因子并深入研究其對果實成熟及品質(zhì)形成的調(diào)控機制具有重要的生物學(xué)意義，這有助于完善植物果實成熟及品質(zhì)形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時為深刻認(rèn)識植物的發(fā)育與適應(yīng)性進(jìn)化提供重要的參考。