張梅， 王金娟， 高美美， 王瑩，羅添鳴， 馮鄰， 羅小英， 李德謀

西南大學(xué) 生物技術(shù)中心， 重慶 400715

柑橘生產(chǎn)主要是采用嫁接苗木， 而砧木對(duì)植物的耐鹽性起關(guān)鍵性作用[1]． 在傳統(tǒng)以枳為砧木的柑橘果園中， 土壤高pH值(7.55～8.50)使得果樹普遍發(fā)生缺鐵黃化， 嚴(yán)重影響柑橘生長和產(chǎn)量[2]． 柑橘砧木對(duì)接穗生長發(fā)育具有重要的基礎(chǔ)作用， 了解柑橘砧木缺鐵的生理特性及其分子機(jī)制具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義．

鐵螯合還原酶基因(FRO)是雙子葉植物從土壤中吸收鐵的關(guān)鍵基因， 在其鐵營養(yǎng)吸收過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用． 研究表明， 擬南芥基因組存在8個(gè)編碼鐵螯合還原酶的基因[3-4](AtFRO1-8)， 其中，AtFRO2在擬南芥根系中高水平表達(dá)， 負(fù)責(zé)將土壤中氧化鐵還原為二價(jià)鐵， 供植物利用[3-4]．AtFRO3在根和地上部分均表達(dá)， 缺鐵能提高其表達(dá)水平， 同時(shí)受到銅的誘導(dǎo)[5]．AtFRO4在子葉和角果中有表達(dá)，AtFRO5主要在莖和花中表達(dá)[5-6]， 這兩個(gè)基因具有冗余功能， 參與銅響應(yīng)和吸收過程[7]．AtFRO6和AtFRO7在植物綠色組織器官中高水平表達(dá)， 并受光調(diào)控[5， 8]． 煙草中組成型表達(dá)AtFRO6基因能增加葉片中鐵螯合還原酶活性和亞鐵含量， 但其根中鐵螯合還原酶活性和亞鐵含量均未提高， 表明AtFRO6在葉細(xì)胞中可發(fā)揮螯合還原三價(jià)鐵的作用[9]．AtFRO7參與缺鐵條件下幼苗光合作用過程中葉綠體中鐵的獲取過程[10]．AtFRO8主要在地上部分表達(dá)[5]， 在衰老葉片維管組織中也有表達(dá)[6]． 而AtFRO1在各植物組織器官中表達(dá)水平極低[5-6]． 這些結(jié)果顯示植物基因組存在多個(gè)FRO同源基因， 且各FRO同源基因在植物鐵營養(yǎng)吸收過程中發(fā)揮著不同的作用．

Sudahono等[11]分析了18種柑橘砧木在缺鐵性土壤中的表現(xiàn)， 其結(jié)果表明非枳類型的柑橘砧木對(duì)缺鐵表現(xiàn)出耐性或中等耐性， 而大部分的枳類型則表現(xiàn)出中等敏感或非常敏感． 朱世平等[12-13]對(duì)15種柑橘砧木品種耐鹽性的研究表明， 不同砧木品種在耐鹽耐堿方面存在非常大的差異， 如印度酸橘、 扁平橘、 紅皮酸橘、 資陽香橙和枸頭橙適應(yīng)鹽堿能力強(qiáng)， 而枳、 莽山野柑對(duì)鹽比較敏感， 柑橘砧木可以通過調(diào)控相關(guān)離子吸收和提高抗氧化物質(zhì)活性從而增強(qiáng)耐鹽性． 這些研究結(jié)果表明不同柑橘砧木品種在耐缺鐵、 耐鹽堿方面存在較大差異， 但具體機(jī)制還不是很清楚．

為研究缺鐵對(duì)不同柑橘砧木材料的影響， 了解柑橘基因組中FRO基因的遺傳背景， 本研究選取了目前常用以及新發(fā)現(xiàn)的具有砧木價(jià)值的17個(gè)柑橘砧木品種， 進(jìn)行缺鐵脅迫處理， 分析其耐缺鐵特性和柑橘基因組中編碼鐵螯合還原酶的同源基因的缺鐵誘導(dǎo)特性， 克隆了明顯受缺鐵誘導(dǎo)的同源基因上游調(diào)控區(qū)， 分析其序列特征及其單體類型， 進(jìn)而分析了主要柑橘砧木的耐缺鐵特性和其單體型的相關(guān)性， 并通過轉(zhuǎn)基因擬南芥分析了不同單體類型上游調(diào)控區(qū)的缺鐵誘導(dǎo)特性． 這將有助于進(jìn)一步了解不同柑橘砧木種質(zhì)資源在耐缺鐵特性方面存在差異的原因， 為篩選優(yōu)良的柑橘砧木提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

柑橘砧木品種種子購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所種質(zhì)資源研究室(表1)． 柑橘種子經(jīng)3%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min， 去離子水漂洗3次以上， 剝?nèi)ネ夥N皮置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2周至種子萌發(fā)； 將萌發(fā)的種子放入PNS營養(yǎng)液中進(jìn)行水培． 光照條件為20 000 Lx， 16 h光照/8 h黑暗． 水培4周， 每7 d更換1次營養(yǎng)液， 水培過程中進(jìn)行通氣處理． 鐵缺乏實(shí)驗(yàn)組EDTA-Fe2+濃度為2 μmol/L， 鐵充足對(duì)照組EDTA-Fe2+濃度為20 μmol/L．

表1 本研究所用柑橘砧木品種

1.2 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)和鐵螯合還原酶活性的測(cè)定方法

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參考張志良等[14]的方法．

總鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用原子吸收分光光度計(jì)(TAS-900)法．

柑橘砧木根尖FCR酶活性測(cè)定參考Waters等[15]的方法．

1.3 基因的克隆測(cè)序與信息學(xué)分析

對(duì)克里曼丁橘(Citrusclementina)和甜橙(Citrussinesis)基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索， 獲得FRO同源基因序列， 然后用Clontech Advantage 高保真酶擴(kuò)增FRO同源基因及其啟動(dòng)子序列， 進(jìn)行亞克隆后送華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證．

序列聚類分析結(jié)果經(jīng)MEGA6軟件UPGMA算法產(chǎn)生， motif結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)MEME(Suite 5.0.5， http： //meme-suite.org/)和PlantRegMap(http： //plantregmap.cbi.pku.edu.cn/binding_site_prediction.php)獲得[16]， 聚類分析與motif結(jié)合位點(diǎn)的整合經(jīng)TBtools(v.0.6669)軟件生成[17]．

1.4 基因表達(dá)分析

實(shí)驗(yàn)操作步驟參照天根生化科技有限公司的植物RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書． 按照表2設(shè)計(jì)不同基因的RT-qPCR引物對(duì)， 并使用Bio-Rad公司96 FX型定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)水平分析， 循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 3 min； 95 ℃ 15 s， 58 ℃ 15 s， 72 ℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)； 最后反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析(60～95 ℃)， 鑒定產(chǎn)物特異性， 根據(jù)Ct值計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平．

表2 定量PCR分析所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 缺鐵脅迫對(duì)17種柑橘砧木品種生理特性的影響

2.1.1 缺鐵脅迫對(duì)17種柑橘砧木品種葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

缺鐵癥狀主要表現(xiàn)在柑橘葉片中， 其中枳橙(CC)、 莽山野柑(MY)、 酸橘(SH)、 扁平橘(SW)、 枸頭橙(AL)、 枳(TO)和興義大紅袍(XD)等幾個(gè)柑橘砧木的黃化現(xiàn)象最為明顯； 汕頭酸橘(SS)、 紅橘(BL)、 朱橘(EH)、 蘭卜萊檬(RL)、 土橘(CH)、 枳雀(ZQ)的黃化現(xiàn)象較明顯； 而枳柚(ZY)、 資陽香橙(ZX)、 皺皮橘(VH)和黃木黎檬(HL)等的缺鐵黃化現(xiàn)象最輕． 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， 多數(shù)砧木品種在缺鐵處理后其葉綠素a、 葉綠素b和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯下降(圖1a，1b，1c)． 以葉綠素a為例， 下降幅度最為明顯的有莽山野柑(MY)、 枳橙(CC)、 黃木黎檬(HL)、 枳(TO)、 汕頭酸橘(SS)等． 另外， 對(duì)主根長度和側(cè)根數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， 發(fā)現(xiàn)各品種主根長度和側(cè)根數(shù)量在缺鐵處理組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以在一定程度上衡量植物吸收鐵的能力． 與對(duì)照組相比， 柑橘砧木在缺鐵脅迫條件下， 地上部分及地下部分的總鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低(圖1d，1e)； 由于鐵元素的主要吸收部位在根部， 所以其地下部分的總鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于地上部分， 并且缺鐵處理后總鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低程度也是地下部分高于地上部分．

CC為枳橙， MY為莽山野柑， SS為汕頭酸橘， BL為紅橘， EH為朱橘， SH為酸橘， RL為蘭卜萊檬， SW為扁平橘， AL為枸頭橙， CH為土橘， TO為枳， ZY為枳柚， ZX為資陽香橙， XD為興義大紅袍， VH為皺皮橘， ZQ為枳雀， HL為黃木黎檬； 鐵充足表示鐵營養(yǎng)充足(20 μmol/L EDTA-Fe2+)， 鐵缺乏表示鐵營養(yǎng)欠缺(2 μmol/L EDTA-Fe2+)； *表示p<0.05， **表示p<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2.1.2 缺鐵脅迫對(duì)17種柑橘砧木品種根系FCR酶活性的影響

鐵螯合還原酶(FCR)是雙子葉和非禾本科單子葉植物從土壤中吸收鐵的關(guān)鍵酶， 比較了17種砧木品種根系在鐵營養(yǎng)充足與缺乏條件下FCR酶活性． 與鐵充足條件相比， 17種柑橘砧木品種在鐵缺乏條件下， 大部分砧木品種根系FCR酶活性均被誘導(dǎo)升高， 其中資陽香橙(ZX)、 枸頭橙(AL)、 枳柚(ZY)、 枳雀(ZQ)、 枳橙(CC)、 蘭卜萊檬(RL)、 興義大紅袍(XD)、 汕頭酸橘(SS)和黃木黎檬(HL)FCR酶活性均極顯著升高， 分別升高了850%，133%，95%，61%，57%，53%，53%，34%，26%； 而莽山野柑(MY)、 紅橘(BL)、 朱橘(EH)、 酸橘(SH)、 扁平橘(SW)、 土橘(CH)、 枳(TO)和皺皮橘(VH)FCR酶活性在鐵營養(yǎng)欠缺條件下與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)．

CC為枳橙， MY為莽山野柑， SS為汕頭酸橘， BL為紅橘， EH為朱橘， SH為酸橘， RL為蘭卜萊檬， SW為扁平橘， AL為枸頭橙， CH為土橘， TO為枳， ZY為枳柚， ZX為資陽香橙， XD為興義大紅袍， VH為皺皮橘， ZQ為枳雀， HL為黃木黎檬； 鐵充足表示鐵營養(yǎng)充足(20 μmol/L EDTA-Fe2+)， 鐵缺乏表示鐵營養(yǎng)欠缺(2 μmol/L EDTA-Fe2+)； *表示p<0.05， **表示p<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

根據(jù)這17種柑橘砧木品種在鐵缺乏條件下其根系FCR酶活性是否被顯著誘導(dǎo)升高， 并結(jié)合其葉片黃化程度、 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化等生理指標(biāo)， 將砧木分為3種類型： 枳柚(ZY)、 資陽香橙(ZX)和枳雀(ZQ)屬于缺鐵耐受型； 莽山野柑(MY)、 紅橘(BL)、 朱橘(EH)、 酸橘(SH)、 扁平橘(SW)、 土橘(CH)、 枳(TO)、 興義大紅袍(XO)和皺皮橘(VH)屬于缺鐵敏感型； 枳橙(CC)、 汕頭酸橘(SS)、 蘭卜萊檬(RL)、 枸頭橙(AL)和黃木黎檬(HL)屬于中間型．

2.2 柑橘中鐵螯合還原酶同源基因CcFROs對(duì)缺鐵脅迫的響應(yīng)

為了解柑橘中FRO基因家族成員的缺鐵脅迫響應(yīng)特性以及在各砧木品種根中受缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)特性， 通過定量PCR檢測(cè)了克里曼丁橘基因組中5個(gè)同源基因在鐵充足和缺乏條件下不同砧木根中的表達(dá)水平． 結(jié)果顯示： 與鐵充足相比， 缺鐵脅迫后CcFRO1，CcFRO2和CcFRO3基因在17種柑橘砧木品種根中的表達(dá)量都上調(diào)(圖3a，3b，3c)， 而CcFRO4和CcFRO5基因表達(dá)量僅在少數(shù)砧木品種中上調(diào)(圖3d，3e)． 在17個(gè)柑橘砧木品種中， 資陽香橙(ZX)、 紅橘(BL)和土橘(CH)根中的CcFRO1，CcFRO2和CcFRO3基因的表達(dá)量上調(diào)幅度最大， 而枳(TO)、 枳橙(CC)和興義大紅袍(XD)根中的CcFRO1，CcFRO2和CcFRO3基因的表達(dá)量都比較低． 以上結(jié)果表明不同柑橘砧木品種根中的CcFRO基因?qū)θ辫F誘導(dǎo)存在差異， 其中CcFRO1，CcFRO2和CcFRO3表達(dá)明顯受缺鐵誘導(dǎo)．

分析鐵充足與缺乏條件下CcFROs基因表達(dá)水平變化與砧木根中FCR酶活性間的相關(guān)性， 結(jié)果顯示CcFRO1和CcFRO3表達(dá)水平變化與砧木根中FCR酶活性變化存在正相關(guān)關(guān)系， 其余CcFROs基因表達(dá)水平變化與FCR酶活性變化均無正相關(guān)關(guān)系(圖3f)． 推測(cè)CcFRO1和CcFRO3表達(dá)水平增加可能是導(dǎo)致其根系鐵螯合還原酶活性上升的主要原因．

CC為枳橙， MY為莽山野柑， SS為汕頭酸橘， BL為紅橘， EH為朱橘， SH為酸橘， RL為蘭卜萊檬， SW為扁平橘， AL為枸頭橙， CH為土橘， TO為枳， ZY為枳柚， ZX為資陽香橙， XD為興義大紅袍， VH為皺皮橘， ZQ為枳雀， HL為黃木黎檬； 鐵充足表示鐵營養(yǎng)充足(20 μmol/L EDTA-Fe2+)， 鐵缺乏表示鐵營養(yǎng)欠缺(2 μmol/L EDTA-Fe2+)； ΔFCR活性為缺鐵條件下FCR酶活性/鐵充足條件下FCR酶活， ΔCcFRO為缺鐵條件下CcFRO基因表達(dá)水平/鐵充足條件下CcFRO基因表達(dá)水平， 線性(ΔCcFRO)為ΔCcFRO表達(dá)水平與ΔFCR活性的線性關(guān)系趨勢(shì)．

2.3 CcFRO1和CcFRO3基因上游調(diào)控區(qū)序列特征及其轉(zhuǎn)基因分析

2.3.1CcFRO1和CcFRO3基因上游調(diào)控區(qū)序列聚類、 motif和序列差異分析

從柑橘砧木品種中克隆了CcFRO1和CcFRO3兩個(gè)基因長約3 000 bp上游調(diào)控區(qū)， 序列進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)： 柑橘砧木品種中CcFRO1上游調(diào)控序列可分為5類(黃木黎檬在各網(wǎng)站上均無其基因組序列， 且設(shè)計(jì)引物多次擴(kuò)增未能成功， 因此去除)： 資陽香橙(ZX)、 枳柚(ZY)與其他品種序列差異最大， 各自單獨(dú)成為一類； 枳雀(ZQ)、 枳橙(CC)和枳(TO)為一類； 酸橘(SH)和蘭卜萊檬(RL)為一類； 其余砧木品種為一類(圖4a)．CcFRO3上游調(diào)控序列可分為4類： 紅橘(BL)、 興義大紅袍(XD)、 扁平橘(SW)、 酸橘(SH)和莽山野柑(MY)為一類； 汕頭酸橘(SS)、 蘭卜萊檬(RL)和資陽香橙(ZX)為一類； 枳橙(CC)、 土橘(CH)、 朱橘(EH)、 枳(TO)和皺皮橘(VH)為一類； 枸頭橙(AL)、 枳柚(ZY)和枳雀(ZQ)為一類(圖4b)．

砧木品種CcFRO1和CcFRO3啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果顯示：CcFRO1基因啟動(dòng)子序列在克里曼丁橘和甜橙基因組中分別檢測(cè)到289和272個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)， 資陽香橙的CcFRO1啟動(dòng)子序列中轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)和其他品種存在較大差異， ARR-B， BBR-BPC， BES1和TALE等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)只存在于資陽香橙CcFRO1基因上游調(diào)控序列中(圖4a)． 而CcFRO3啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)， 在Citrusclementina和Citrussinesis基因組中分別檢測(cè)到169和151個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)， 在耐缺鐵和敏感類型砧木品種間存在5個(gè)差異的結(jié)合位點(diǎn)， 其中僅在耐缺鐵砧木品種啟動(dòng)子序列存在轉(zhuǎn)錄因子E2F/DP， BBR-BPC和bZIP結(jié)合位點(diǎn)， 在敏感型砧木品種啟動(dòng)子序列中存在轉(zhuǎn)錄因子GRAS和EIL結(jié)合位點(diǎn)(圖4b)． 作為調(diào)控鐵吸收關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FIT的結(jié)合位點(diǎn)E-box 特征序列(5′-CANNTG-3′)， 在敏感類型品種中最多的存在2個(gè)， 在耐缺鐵品種中存在2～5個(gè)， 其中資陽香橙CcFRO1啟動(dòng)子區(qū)存在E-box序列最多， 為5個(gè)．

為進(jìn)一步了解柑橘砧木CcFRO1和CcFRO3啟動(dòng)子序列和其耐缺鐵特性的關(guān)系， 用生物學(xué)軟件MegAlign比較分析了所研究柑橘砧木的啟動(dòng)子序列． 結(jié)果(圖4c)顯示， 不同柑橘砧木的啟動(dòng)子序列存在較大的差異．CcFRO1啟動(dòng)子序列中第IV類枳柚的差異最大， 有702 bp的缺失， 在不同位置分別有45 bp和101 bp的插入； 第II類的酸橘(SH)和蘭卜萊檬(RL)也存在較大的差異， 均有498 bp缺失； 第III類的枳橙(CC)、 枳(TO)和枳雀(ZQ)在多個(gè)位置存在堿基的缺失和插入； 第I類的汕頭酸橘(SS)、 莽山野柑(MY)、 紅橘(BL)、 朱橘(EH)等砧木的序列同源性較高， 不同砧木之間只有少數(shù)堿基的差異(資陽香橙CcFRO1啟動(dòng)子片段經(jīng)多次擴(kuò)增未能成功， 圖中未對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì))．CcFRO3啟動(dòng)子序列中差異最大的是第III類的枳橙(CC)、 朱橘(EH)、 土橘(CH)、 枳(TO)、 皺皮橘(VH)和第IV類的枸頭橙(AL)， 分別缺失了826 bp和822 bp， 并且這6個(gè)品種的pFRO3序列同源性較高； 其次第IV類的枳柚(ZY)和枳雀(ZQ)的差異較大， 在多個(gè)位置存在幾十個(gè)堿基的缺失和插入， 且枳雀(ZQ)和枳柚(ZY)的pFRO3序列同源性較高； 汕頭酸橘(SS)、 酸橘(SH)、 扁平橘(SW)、 資陽香橙(ZX)和興義大紅袍(XD)之間的pFRO3序列同源性較高， 都在同一位置缺失了16 bp的序列(圖4d)．

CC為枳橙， MY為莽山野柑， SS為汕頭酸橘， BL為紅橘， EH為朱橘， SH為酸橘， RL為蘭卜萊檬， SW為扁平橘， AL為枸頭橙， CH為土橘， TO為枳， ZY為枳柚， ZX為資陽香橙， XD為興義大紅袍， VH為皺皮橘， ZQ為枳雀， HL為黃木黎檬； “┅”表示缺失的序列， “━”表示沒有差異的序列， “←→”表示插入的序列， “+”表示插入的堿基數(shù)， “-”表示缺失的堿基數(shù)．

2.3.2CcFRO1和CcFRO3基因上游調(diào)控區(qū)序列的啟動(dòng)特性

構(gòu)建各類型啟動(dòng)子控制GUS基因表達(dá)的植物表達(dá)載體， 并獲得相應(yīng)T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系， 組織化學(xué)染色結(jié)果顯示： 來源于不同砧木品種CcFRO1基因啟動(dòng)子表達(dá)特性存在很大差異， 如來源于敏感型砧木莽山野柑的啟動(dòng)子信號(hào)很弱， 而來源于酸橘的啟動(dòng)子在根、 莖、 葉中均有很強(qiáng)的信號(hào)， 資陽香橙的啟動(dòng)子在根尖有很強(qiáng)的信號(hào)， 來源于枳柚的啟動(dòng)子未見明顯的組織化學(xué)染色． 但在鐵充足和缺乏情況下， 不同砧木品種的CcFRO1基因啟動(dòng)子的表達(dá)均未見明顯差異．

在鐵充足條件下， 來源于敏感型砧木品種的CcFRO3基因啟動(dòng)子在根和地上組織器官中無明顯的藍(lán)色， 來源于耐缺鐵砧木品種CcFRO3基因啟動(dòng)子在根尖、 側(cè)根和地上部分生長中心和葉柄中呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的藍(lán)色， 來源于中間型砧木品種CcFRO3基因啟動(dòng)子僅在地上部分生長中心和葉柄中有藍(lán)色出現(xiàn)(圖5)． 在缺鐵條件下， 敏感型和中間型品種啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株在地上部分生長中心出現(xiàn)較淡的藍(lán)色， 而耐缺鐵品種啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株在整個(gè)根系、 莖中出現(xiàn)很強(qiáng)的藍(lán)色， 特別是主根根冠、 伸長區(qū)以及成熟區(qū)藍(lán)色都加深， 在地上部分生長中心藍(lán)色較鐵充足條件下變淺(圖5)． 這些結(jié)果表明在缺鐵條件下， 來源于敏感型和中間型砧木品種的CcFRO3基因啟動(dòng)子表達(dá)活性變化較弱， 耐缺鐵砧木品種該基因啟動(dòng)子表達(dá)活性增強(qiáng)， 有較強(qiáng)的缺鐵誘導(dǎo)特性．

鐵充足為鐵營養(yǎng)充足(20 μmol/L EDTA-Fe2+)， 鐵缺乏為鐵營養(yǎng)欠缺(2 μmol/L EDTA-Fe2+)； pFRO3-S幼苗為敏感型啟動(dòng)子植株幼苗， pFRO3-M幼苗為中間型啟動(dòng)子植株幼苗， pFRO3-T幼苗為耐受型啟動(dòng)子植株幼苗， pFRO3-T根為耐受型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株根部．

3 討論

3.1 CcFRO基因在柑橘砧木缺鐵脅迫中的作用

AtFRO基因家族成員在植物各組織器官的金屬離子穩(wěn)態(tài)中起作用， 其中AtFRO2基因編碼缺鐵誘導(dǎo)的鐵螯合還原酶， 負(fù)責(zé)還原根表面的三價(jià)鐵， 隨后被還原的二價(jià)鐵通過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)[4， 18]． 本文用擬南芥的8個(gè)AtFRO基因的氨基酸序列作為參考， 檢索和克隆了柑橘的5個(gè)FRO同源基因． 根據(jù)CcFROs轉(zhuǎn)錄水平以及缺鐵誘導(dǎo)特性， 表明CcFRO1，CcFRO2和CcFRO3基因能夠響應(yīng)柑橘砧木缺鐵脅迫． 根據(jù)與擬南芥的AtFROs基因親緣關(guān)系推測(cè)，CcFRO1參與柑橘砧木葉綠體中的鐵還原過程，CcFRO2參與種子中的鐵還原過程，CcFRO3負(fù)責(zé)根部的鐵還原過程，CcFRO4和CcFRO5則可能在維持細(xì)胞內(nèi)金屬離子的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用， 至于具體的作用和機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)．

3.2 轉(zhuǎn)錄因子參與柑橘對(duì)鐵的吸收過程

轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用． 其中bHLH類FIT轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控雙子葉植物鐵吸收關(guān)鍵基因FRO2，IRT1等的表達(dá)， 參與鐵吸收過程． 在擬南芥中，AtFRO2的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子FIT與AtbHLH38， AtbHLH39， AtbHLH100和AtbHLH101的共同調(diào)節(jié)[19-20]． 在本研究的柑橘砧木對(duì)鐵響應(yīng)的CcFRO1和CcFRO3啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)bHLH結(jié)合位點(diǎn)和E-box特征序列(5′-CANNTG-3′)， 但是柑橘基因組中所預(yù)測(cè)的能結(jié)合CcFRO1和CcFRO3啟動(dòng)子的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子中并沒有包括同屬于bHLH類的FIT轉(zhuǎn)錄因子． 這表明柑橘基因組中調(diào)控鐵吸收的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子可能不是FIT， 而是其他bHLH類轉(zhuǎn)錄因子．

在耐缺鐵柑橘砧木品種的CcFRO1和CcFRO3啟動(dòng)子區(qū)特異存在有E2F/DP， TALE， ARR-B， BBR-BPC， BES1， CAMTA和bZIP結(jié)合位點(diǎn)， 其中E2F/DP和BBR-BPC在耐缺鐵柑橘品種的CcFRO1和CcFRO3啟動(dòng)子序列中都存在． 這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞增殖[21]、 分生組織形成[22]、 以及CK[23]， GA[24]， BR[25]等激素信號(hào)和鈣信號(hào)[26-27]的響應(yīng)過程等． 暗示缺鐵過程中， 耐缺鐵柑橘品種會(huì)調(diào)配激素信號(hào)來刺激或激活根發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)， 從而提升植物根系吸收鐵的能力． 而在敏感型品種中特異存在GRAS和EIL兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)， EIL1與FIT直接作用保持FIT蛋白水平來參與乙烯對(duì)缺鐵的響應(yīng)過程[28]， GRAS在植物根、 莖頂端以及莖的頂端分生組織發(fā)育階段中發(fā)揮作用[29]， 這時(shí)轉(zhuǎn)錄因子在敏感砧木中可能起負(fù)調(diào)控作用． 這些分析結(jié)果表明多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與柑橘砧木缺鐵響應(yīng)過程， 為下一步深入研究提供了重要的線索．