涂聞君， 曾政， 趙明， 候峰清，蔣兵， 方仁東，4， 蔣佳利，

1. 西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物健康與動(dòng)物性食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400715；2. 重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120； 3. 重慶市江北區(qū)畜牧獸醫(yī)中心， 重慶 400020；4. 草食動(dòng)物科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400715

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes， LM)簡稱單增李斯特菌， 為兼性厭氧侵襲性胞內(nèi)菌， 為重要的食源性人畜共患病原菌． LM的致病性與毒力基因密切相關(guān)， 主要由兩個(gè)毒力島群構(gòu)成： 毒力島1主要與胞內(nèi)感染有關(guān)， 由6個(gè)主要的毒力基因(prfA-plcA-hly-mpl-actA-plcB)編碼組成； 毒力島2主要負(fù)責(zé)黏附與侵襲， 由內(nèi)化素家族(in1A，in1B，in1C到inlH)組成[1]． 病原菌在in1A和in1B的幫助下可穿越胎盤屏障、 血腦屏障和腸道屏障[2]， 并在各毒力因子的協(xié)調(diào)下引發(fā)流產(chǎn)、 早產(chǎn)、 胎兒發(fā)育障礙以及腦膜炎、 胃腸炎和敗血癥等臨床癥狀． 雖然LM感染引起的疾病發(fā)生率不高， 但據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道李斯特菌病死亡率卻高達(dá)23.6%[3]． 目前， 臨床上主要應(yīng)用抗生素對(duì)李斯特菌病進(jìn)行治療， 但抗生素的廣泛應(yīng)用和不合理使用， 使得LM的耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重， 甚至出現(xiàn)多重耐藥菌株[4]． LM的致病性也與血清型和基因型的差異密切相關(guān)． LM的血清型共分為13種， 其中 1/2a，1/2b，1/2c和4b血清型最易引起人類感染李斯特菌?。?MLST分型主要有16種， 包括ST9，ST1，ST2，ST3，ST5，ST87，ST121，ST8，ST7，ST59，ST4，ST6，ST122，ST155，ST101和ST199[5-6]． 其中， ST5，ST8，ST9和ST87既是引起李斯特菌病暴發(fā)的常見ST型， 又是我國耐藥菌株的常見ST型[7-8]． 致病性血清型、 MLST分型以及耐藥性之間是否具有一定的聯(lián)系， 還需進(jìn)一步的研究． 已有研究發(fā)現(xiàn)LM的進(jìn)化主要是菌株不斷突變的結(jié)果[9]， 因此對(duì)發(fā)生在食品鏈中LM進(jìn)行生物學(xué)分型檢測， 并根據(jù)分離株的耐藥譜、 血清型和基因型的分布情況繪制進(jìn)化樹， 能有效對(duì)污染源進(jìn)行追蹤， 從根源上防止單增李斯特菌病的暴發(fā)， 對(duì)保護(hù)人類身體健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義． 本研究關(guān)于重慶地區(qū)超市雞肉中LM的污染情況調(diào)查、 耐藥表型分析、 血清型分型和MLST分子分型方法的應(yīng)用將為監(jiān)測程序的建立提供一定的數(shù)據(jù)支撐．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2018年6月至7月之間， 24株來自重慶地區(qū)超市雞肉中分離到的LM， 均根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789.30-2010)中《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)方法檢測確認(rèn)． 標(biāo)準(zhǔn)菌株是單增李斯特菌C53005， 大腸桿菌ATCC25922， 金黃色葡萄球菌ATCC25923， 沙門氏菌ATCC50115， 菌株購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心．

1.1.2 試劑與儀器

2×Taq PCR MasterMix(含染料)， 100 bp DNA Ladder， ddH2O購自北京Tiangen公司； 單增李斯特菌分離所需各種肉湯和試劑， 均購自北京路橋技術(shù)有限公司； 19種抗生素藥敏紙片購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司； 10對(duì)毒力基因引物由重慶奧哲公司合成， 引物信息見表1．

表1 單增李斯特菌毒力基因引物

1.2 方法

1.2.1 毒力基因的檢測

煮沸法提取菌液DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR的反應(yīng)條件： ① 25 μL反應(yīng)體系： 2×Taq PCR MasterMix(含染料)10 μL， 正、 反向引物(5 μmol/L)各1 μL， DNA模板2 μL， 加ddH2O至25 μL； ② 反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性50 s； 退火(表1)； 72 ℃延伸50 s (30個(gè)循環(huán))； 72 ℃終延伸10 min．

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI)推薦的單增李斯特菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)， 結(jié)合臨床用藥選擇青霉素(P， 10 units)、 苯唑西林(OX， 30 μg)、 氨芐西林(AMP， 10 μg)、 頭孢噻吩(KF， 30 μg)、 頭孢哌酮(CFP， 75 μg)、 頭孢噻肟(CTX， 30 μg)、 紅霉素(E， 15 μg)、 鏈霉素(S， 10 μg)、 慶大霉素(CN， 10 μg)、 萬古霉素(VA， 30 μg)、 多粘菌素B (PB， 300 units)、 四環(huán)素(TE， 30 μg)、 多西環(huán)素(DO， 30 μg)、 氯霉素(C， 30 μg)、 環(huán)丙沙星(CIP， 5 μg)、 阿米卡星(AK， 30 μg)、 磺胺/甲氧芐胺嘧啶(SXT， 25 μg)、 利福平(RD， 5 μg)及呋喃妥因(F， 300 μg)共19種抗生素， 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)． 同時(shí)用大腸桿菌(ATCC25922)、 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和沙門氏菌(ATCC50115)作質(zhì)量控制， 對(duì)每種抗菌藥物敏感、 中敏和耐藥的結(jié)果判斷參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)(2013版)中葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行．

1.2.3 血清學(xué)分型

采用M Doumith介紹的多重PCR法對(duì)LM的血清型進(jìn)行檢測[13]．

1.2.4 MLST分型

采用法國巴斯德數(shù)據(jù)庫提供的用于單增李斯特菌的MLST分型方法[14]． 擴(kuò)增產(chǎn)物先經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證， 之后送往上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司純化并進(jìn)行測序， 測序結(jié)果利用DNAStar軟件進(jìn)行拼接， 剪取成對(duì)應(yīng)管家基因的長度， 提交MLST數(shù)據(jù)庫得到7個(gè)管家基因的等位基因編碼(http： //www.pasteur.fr/recherche/ genopole/ PF8/mlst/Lmono.html)， 然后將每株菌7個(gè)管家基因等位基因編碼按相應(yīng)順序排列， 提交數(shù)據(jù)庫后便可獲得ST型．

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 重慶地區(qū)雞肉中LM的分離情況

2018年6月至7月之間， 從重慶江北區(qū)、 北碚區(qū)、 江津區(qū)、 南岸區(qū)、 合川區(qū)等5個(gè)區(qū)超市的雞肉中采集108份樣品， 共分離出24株LM， 分離率為22.2%．

2.2 24株LM分離株毒力基因的檢測結(jié)果

利用PCR法對(duì)24株LM進(jìn)行毒力基因檢測， 結(jié)果23株分離株均檢測出10個(gè)毒力基因， 僅1株在inlB基因上出現(xiàn)了基因缺失(表2)， 菌株攜帶毒力基因普遍， 暗示超市雞肉中存在潛在威脅， 需引起重視．

表2 24株LM分離株毒力基因分布情況

2.3 24株LM分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明， 分離株對(duì)苯唑西林(96.0%)、 頭孢噻肟(41.7%)和多粘菌素B(37.5%)的耐藥率較高， 而對(duì)其余藥物耐藥率低， 其中對(duì)頭孢噻吩、 環(huán)丙沙星、 阿米卡星和呋喃妥因完全敏感． 24株LM中耐2種以上的抗生素有7株， 多重耐藥率為29.2%， 并發(fā)現(xiàn)1株對(duì)11種抗生素(AMP-OX-P-E-S-CN-VA-TE-C-SXT-RD)耐藥的超級(jí)耐藥菌， 具體結(jié)果見表3．

表3 24株LM分離株對(duì)19種抗生素的藥敏結(jié)果

2.4 24株LM分離株血清學(xué)分型結(jié)果

血清學(xué)分型結(jié)果顯示， 24株LM共檢出4種血清型， 分別為1/2a，1/2b，1/2c和4b型(圖1)． 1/2b型和4b型所占比例分別為25.0%和16.6%， 屬于譜系I， 共10株； 1/2a型和1/2c型所占比例均為29.2%， 屬于譜系II， 共14株． 多重PCR電泳圖(圖2)顯示： 泳道1為單增李斯特菌陽性對(duì)照C53005 4b型(4b， 4d， 4e)； 泳道2為4b型于597 bp，474 bp，370 bp處有擴(kuò)增片段， 屬于單增李斯特菌血清組4b， 4d， 4e； 泳道3為1/2b型于474 bp，370 bp處有擴(kuò)增片段， 屬于單增李斯特菌血清組1/2b， 3b， 7； 泳道4為1/2c型于906 bp，691 bp，370 bp處有擴(kuò)增片段， 屬于單增李斯特菌血清組1/2c， 3c； 泳道5為1/2a型于691 bp，370 bp處有擴(kuò)增片段， 屬于單增李斯特菌血清組1/2a， 3a； 泳道6為陰性對(duì)照．

圖1 24株LM分離株血清型分布圖

圖2 分子血清型多重PCR電泳圖

2.5 24株LM分離株MLST基因分型結(jié)果

MLST分型共鑒定出11個(gè)序列型(Sequence type， ST)， 其中易引起單增李斯特菌病的常見ST型(ST87， ST9， ST2)菌株占50%(12/24)， 并發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的ST型， 即ST1011， 目前已提交巴斯德研究所MLST數(shù)據(jù)庫． ST87分布最為廣泛， 其次是ST705， ST9和ST2， 具體分布見圖3．

圖3 24株LM分離株ST型結(jié)果分布圖

2.6 24株LM分離株耐藥譜與血清型、 ST型UPGMA tree分析結(jié)果

進(jìn)化樹結(jié)果顯示： 血清型相同的菌株， 其親緣關(guān)系較近． 首先， 血清型和ST型之間對(duì)應(yīng)關(guān)系緊密， 如ST87與1/2b型單增李斯特菌對(duì)應(yīng)， ST2與4b型LM對(duì)應(yīng)． 此外， 部分ST型可對(duì)應(yīng)于同一血清型， 例如ST705和ST9對(duì)應(yīng)于1/2c型LM； ST155，ST11，ST101，ST121和ST8都對(duì)應(yīng)于1/2a型LM． 其次， 耐受苯唑西林和同時(shí)耐受苯唑西林—頭孢噻肟的單增李斯特菌MLST分型有明顯集中趨勢， 主要集中在 ST705，ST87和ST2上． 江北區(qū)(JB)、 江津區(qū)(JJ)、 南岸區(qū)(NA)、 合川區(qū)(HC)分離到的菌株同源性較高， 大多數(shù)耐受苯唑西林， 且血清型均為譜系II； 而北碚區(qū)(BB)分離到的菌株大多耐受苯唑西林—頭孢噻肟， 且血清型均為譜系I， 具體分布見圖4．

圖4 耐藥譜與血清型、 ST型UPGMA tree 分析圖

3 討論

單增李斯特菌廣泛存在于自然界中， 食入被LM污染的食品是單增李斯特菌病暴發(fā)的主要原因． 在對(duì)國內(nèi)已報(bào)道的肉品中LM污染情況分析發(fā)現(xiàn)， 雖然2010年后單增李斯特菌總體分離率較此前有所下降， 但肉品中LM的污染率仍然處在較高水平[15]． 且在各類肉品檢測結(jié)果中， 雞肉中LM污染率顯著高于其他各類肉品[16]． 因此， 鑒定和監(jiān)測超市雞肉中LM的污染情況， 可以確定適當(dāng)?shù)姆揽卮胧?最大限度地減少雞肉中LM的存在， 這對(duì)于公共衛(wèi)生安全極為重要． 在本研究中， LM的分離率為22.2%(24/108)， 該結(jié)果低于蔣興祥等[17]的報(bào)道(53.3%， 16/30)， 高于烏日娜等[18]的報(bào)道(8.33%， 10/120)， 而與吳曉芳等[19]的報(bào)道基本一致(25%， 10/40)．

LM的血清型共分為13種． 其中， 血清型1/2a，1/2b，1/2c和4b最易引起人類感染李斯特菌病， 也是中國食品中分離LM菌株的優(yōu)勢血清型[20]． 有研究顯示， 超過95%的人類李斯特菌病是由血清型4b，1/2a和1/2b造成的[21]． 本試驗(yàn)中24株LM大多為1/2a，1/2b和1/2c型， 另有4株致病性較強(qiáng)的4b型菌株， 該結(jié)果與Sosnowski等[22]報(bào)道的基本一致． 雖然雞肉中致病性 LM 血清型污染率很高， 但目前我國李斯特菌病報(bào)道的較少， 可能與我國對(duì)該菌的監(jiān)測系統(tǒng)和檢測水平不高有關(guān)．

由于血清型對(duì)LM的分辨能力過低， 因此， 它不能對(duì)該菌進(jìn)行準(zhǔn)確溯源． 而多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法， 是在多位點(diǎn)酶切電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上為研究菌群基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的一種高分辨率分型技術(shù)． 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， ST5，ST8，ST9和ST87是引起食源性LM暴發(fā)的主要ST型， 常造成人類感染單增李斯特菌病[7-8]． 在本次試驗(yàn)中， 24株LM鑒定出11個(gè)ST型， 其中易引起單增李斯特菌病的常見ST型(ST87，ST9，ST2)菌株占50%(12/24)， 并發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的ST型， 即ST1011． 進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示分離株血清型相同的菌株， 親緣關(guān)系較近． 首先對(duì)比MLST與血清型發(fā)現(xiàn)， LM血清型和ST型之間都有著十分緊密的對(duì)應(yīng)關(guān)系， 并且大部分ST型與血清型存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系， 如ST87與1/2b型對(duì)應(yīng)， ST2與4b型對(duì)應(yīng)； 但也有2種或以上ST型可對(duì)應(yīng)于同一血清型， 例如ST705和ST9對(duì)應(yīng)于1/2c型， ST155，ST11，ST101，ST121和ST8都對(duì)應(yīng)于1/2a型． 其次， 耐受苯唑西林和同時(shí)耐受苯唑西林—頭孢噻肟的單增李斯特菌MLST分型有明顯集中趨勢， 主要集中在ST705，ST87和ST2上； 而Wu等[14]的結(jié)果與該試驗(yàn)不一致， 它主要集中在ST8，ST1和ST87上． MLST分型技術(shù)可以較好地用于肉品中單增李斯特菌污染的分子溯源， 但本研究僅從雞肉中分離到LM并做MLST分型分析其危害性， 未能對(duì)雞肉中LM污染的來源進(jìn)行深入研究． 后續(xù)可從超市環(huán)境中和雞的屠宰加工車間采樣分離LM， 與雞肉中分離的LM進(jìn)行分子分型研究， 找出雞肉中LM污染的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)， 為進(jìn)一步降低雞肉中LM的污染提供技術(shù)支持．

近年來， 食品中分離出的LM對(duì)抗生素的耐藥現(xiàn)象愈加嚴(yán)重， 這無疑給食品安全帶來了潛在性威脅． 抗生素的廣泛使用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生， 刀麗梅等[23]和周瑤琴等[24]發(fā)現(xiàn)雞源和牛源分離株中耐藥菌占大部分， 且表現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)象． 本試驗(yàn)中 LM 主要耐受苯唑西林、 頭孢噻肟和多粘菌素B； 對(duì)四環(huán)素、 紅霉素、 氯霉素、 環(huán)丙沙星敏感性較高， 這與閆韶飛等[25]和趙悅等[26]的報(bào)道恰恰相反， 與Chen等[27]的報(bào)道結(jié)果不完全一致， 而與王紅等[28]報(bào)道的結(jié)果較一致． 另外， 在本試驗(yàn)中部分菌株已對(duì)一線藥物氨芐西林和青霉素產(chǎn)生了耐藥性． 24株分離株中耐2種以上抗生素的有7株， 多重耐藥率為 29.2%， 該結(jié)果與 Sosnowski等[22]的報(bào)道基本一致(27.4%， 40/146)， 而高于 Wieczorek等[29]的報(bào)道(3.5%， 2/57)． 值得注意的是， 這些耐藥菌株大多分布在我國常見LM的ST型(ST87，ST705，ST9和ST2)中． 其中， 在ST9型菌株中發(fā)現(xiàn)1株對(duì)11種抗生素耐藥的超級(jí)耐藥菌， 這與之前研究報(bào)道的ST9型菌株多重耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重相符[30]． 應(yīng)對(duì)該超級(jí)耐藥菌株做進(jìn)一步研究， 這將有助于闡明ST9型菌株與多重耐藥的關(guān)系． 本研究還發(fā)現(xiàn)， 分離株血清型相同的菌株， 其耐藥株ST型和引起單增李斯特菌病常見ST型具有相近的流行趨勢， 均主要分布在ST87，ST9，ST705型中， 這三者之間是否具有一定的遺傳進(jìn)化關(guān)系， 還需要做進(jìn)一步研究．

目前， 關(guān)于LM在雞肉中致病性的研究較少， 毒力基因編碼的毒力因子是LM致病的分子基礎(chǔ)． 通過檢測毒力基因， 可以了解這些基因在重慶LM中的分布． LM感染宿主的每一步均有特定的毒力基因編碼的毒力因子的精確調(diào)控．prfA是毒力島上一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因， 對(duì)島上其他基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控， 它的缺失將直接導(dǎo)致LM毒力的下降[31]． 因此， LM毒力基因攜帶率越高， 其致病性也將越強(qiáng)， 反之則導(dǎo)致致病性的消失或下降． 本試驗(yàn)24株分離株中， 23株均檢測出10個(gè)毒力基因， 僅1株在inlB基因上出現(xiàn)基因缺失． 這與宮照龍等[11]和廖興廣等[32]的研究結(jié)果基本一致． 但有文獻(xiàn)報(bào)道， LM為了更好地適應(yīng)環(huán)境， 其毒力基因在自然條件下都存在不同程度的缺失[10，33]． 因此， 我們在對(duì)LM毒力基因建立檢測時(shí)， 要考慮到毒力基因缺失導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性的問題， 從而更好地防控李斯特菌病的暴發(fā)．