王東旭, 王新財(cái), 胡奇杰, 王鳳麗, 厲 芬

（湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院, 浙江 湖州 313000）

含乳飲料是指以乳或乳制品為原料, 加入水及適量輔料經(jīng)配制或發(fā)酵而成的飲料制品[1］。研究表明, 含乳飲料是城市年輕人群僅次于礦泉水之外銷量最高的飲品[2］。飲料包裝較多使用聚丙烯（PP）、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）、高密度聚乙烯（HDPE）等材質(zhì), 受環(huán)境等因素影響, 塑料中的單體可能從包裝材料遷移到飲料中, 從而損害人體健康[3］。鄰苯二甲酸酯（PAEs）是其中應(yīng)用最為廣泛的一類增塑劑, 每年全球產(chǎn)量接近600萬(wàn)噸, 其中中國(guó)消耗量接近220萬(wàn)噸[4-6］。毒理學(xué)研究表明, PAEs分子與雌激素部分結(jié)構(gòu)具有相似性, 對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有干擾作用, 具有潛在的生物毒性、腎毒性和致畸性[7-9］。目前, 美國(guó)環(huán)?？偩忠褜⑧彵蕉姿岫柞ィ―MP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）列入“優(yōu)先污染物名單”；歐盟將DBP、DEP列為第2類生殖毒性化合物[10］。我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)也對(duì)食品、食品添加劑中的DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）和DBP的最大殘留量做了限值規(guī)定[11］。

目前食品中PAEs的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[12］、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14］、液相色譜法[15-16］以及液相色譜-質(zhì)譜法[17-18］等。由于食品基質(zhì)較復(fù)雜, 其中PAEs的濃度往往較低, 因此選擇合適的富集和純化前處理技術(shù)必不可少[12］。常見(jiàn)的前處理技術(shù)主要有液液萃取法[19］、固相萃取法[20］、固相微萃取法[21］、分散液液微萃取法[22］、磁性固相萃取法[23］等。含乳飲料含有較高的脂肪和蛋白質(zhì), 前處理的關(guān)鍵在于去除脂肪和蛋白質(zhì), 目前采用的前處理方法以固相萃取法[24］為主, 但該法檢驗(yàn)成本高, 操作相對(duì)繁瑣, 不適合高通量檢測(cè)。鹽析輔助液液萃取法（SALLE）通過(guò)向樣品溶液與萃取溶劑混合物中加入適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽, 可促進(jìn)萃取溶劑更好地從混合物中分離[25-26］。該方法具有操作簡(jiǎn)便、有機(jī)試劑消耗少、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)。本研究以12種典型的PAEs為檢測(cè)目標(biāo), 采用鹽析輔助液液萃取法對(duì)含乳飲料中PAEs進(jìn)行前處理, 結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）, 建立了一種前處理快速簡(jiǎn)單、成本低的含乳飲料中12種PAEs的檢測(cè)方法, 可為含乳飲料中PAEs的高通量檢測(cè)提供技術(shù)參考。同時(shí)基于該方法考察了不同溫度及光照條件下PET包裝材質(zhì)的含乳飲料中PAEs的遷移規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

ACQUITYTM超高效液相色譜和XevoTMTQD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特斯公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Genius 3漩渦混合器（德國(guó)艾卡公司）；Allegra X-12R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）；DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；針式濾膜過(guò)濾器：0. 22μm聚醚砜濾膜（PES）、0. 22μm尼龍濾膜（Nylon）、0. 22μm玻璃纖維濾膜（MCE）、聚丙烯濾膜（PP）、0. 22μm聚四氟乙烯濾膜（PTFE）、0. 22μm聚偏氟乙烯濾膜（PVDF）（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：DMP、DEP、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、DBP、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、BBP、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、DEHP、DNOP、DINP, 質(zhì)量濃度均為1 000μg/mL, 購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、丙酮、四氫呋喃、乙醇（色譜純, 德國(guó)默克公司）；甲酸、氯化鈉（NaCl）、碳酸鈉（Na2CO3）、硫酸鈉（Na2SO4）、硫酸銨（（NH4）2SO4）、硫酸鎂（MgSO4）（分析純, 上海麥克林生化科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水, 10批次含乳飲料購(gòu)于湖州市超市。

1.2 溶液制備

1.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確吸取各PAEs標(biāo)準(zhǔn)溶液適量, 用乙腈稀釋, 配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, -20℃下避光保存。吸取PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量, 經(jīng)空白基質(zhì)溶液稀釋, 配制質(zhì)量濃度分別為0、5. 00、10. 0、50. 0、100、200μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取1. 00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)0. 22μm聚四氟乙烯濾膜后供儀器分析。

1.2.2 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取5. 00 g含乳飲料（精確至0. 01 g）置于15 mL離心管中, 依次加入2. 0 g硫酸銨和1. 5 mL乙腈, 渦旋至硫酸銨固體完全溶解（約1 min）, 以10 000 r/min離心5 min。移取0. 75 mL上層有機(jī)層置于1. 00 mL容量瓶中, 加水定容至刻度, 混勻, 過(guò)0. 22μm聚四氟乙烯濾膜后供儀器分析?？瞻讓?shí)驗(yàn)未加入樣品, 其他步驟相同。

1.3 測(cè)定方法

精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各5μL進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè), 以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X, μg/L）為橫坐標(biāo), 定量離子對(duì)峰面積（Y）為縱坐標(biāo), 繪制12種PAEs基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。供試品溶液在相同條件下測(cè)定, 采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH phenyl（50 mm×2. 1 mm, 1. 7μm）；流動(dòng)相：A為甲醇, B為0. 05%甲酸水溶液；流速為0. 3 mL/min；進(jìn)樣體積為5μL；柱溫為35℃。梯度洗脫程序：0. 0～1. 0 min, 50%～60% A；1. 0～2. 5 min, 60%～70% A；2. 5～4. 0 min, 70% A；4. 0～4. 5 min, 70%～80% A；4. 5～6. 0 min, 80%A；6. 0～7. 0 min, 80%～90%A；7. 0～12. 0 min, 90%A；12. 0～12. 1 min, 90%～50%A；12. 1～18 min, 50%A。為抑制儀器管路中的塑化劑本底干擾[27］, 在混合池與六通閥之間加裝Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4. 6 mm×150 mm, 5μm）。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（ESI）源, 正離子模式掃描, 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓為0. 5 kV；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣溫度為350℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣為氬氣；PAEs的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 待測(cè)物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及最佳質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Selected transitions and optimized mass spectrum parameters of the target compounds

1.5 基質(zhì)效應(yīng)

采用相對(duì)響應(yīng)值法考察基質(zhì)效應(yīng)（ME）的影響, 計(jì)算公式為：ME=k2/k1×100%。式中：k1為空白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；k2為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

李嶠汝越想越覺(jué)得母親確實(shí)有精神問(wèn)題。母親不太說(shuō)話，要按城里人的標(biāo)準(zhǔn)，就是自閉。自閉的人總在心里琢磨事，這還不算抑郁？抑郁，就是精神層面的問(wèn)題了。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

在鹽析輔助液液萃取法中影響萃取效率的因素主要有萃取溶劑、鹽析劑的種類及用量等。萃取溶劑一般選擇既能溶于水又能在鹽析劑作用下與水分層的溶劑, 因此本研究考察了乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和四氫呋喃5種常見(jiàn)萃取溶劑的效果。結(jié)果表明, 加入硫酸銨后, 除甲醇外, 其余4種溶劑均發(fā)生了有機(jī)相和水相的分離, 4種溶劑中PAEs的萃取回收率大小順序?yàn)橐译妫颈疽掖迹舅臍溥秽? 考慮到乙腈有沉淀蛋白的作用, 所以選擇乙腈作為萃取溶劑。

實(shí)驗(yàn)還考察了氯化鈉、碳酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂5種常見(jiàn)鹽析劑的效果。結(jié)果表明硫酸銨的萃取回收率最高, 其原因可能由于硫酸銨具有更好的水溶性和更強(qiáng)的鹽析能力, 因此選擇鹽析劑為硫酸銨。進(jìn)一步對(duì)乙腈和硫酸銨的用量進(jìn)行了優(yōu)化, 結(jié)果見(jiàn)圖1。綜合考慮萃取回收率和節(jié)省試劑, 得到優(yōu)化的前處理?xiàng)l件為：5. 00 g含乳飲料中添加1. 5 mL乙腈和2. 0 g硫酸銨。

圖1 乙腈（A）與硫酸銨（B）用量的影響（n=3）Fig. 1 Effects of the dosage of acetonitrile（A）and（NH4）2SO4（B）（n=3）

2.2 背景消除

由于環(huán)境中無(wú)處不在的塑化劑和來(lái)自于分析系統(tǒng)本身的干擾, PAEs檢測(cè)過(guò)程中的本底干擾非常高, 本實(shí)驗(yàn)在混合池與六通閥間加裝C18反相色譜柱, 能很好地消除系統(tǒng)背景中塑化劑的干擾。同時(shí), 檢測(cè)時(shí)要扣除試劑空白帶來(lái)的本底, 以保證定性和定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn), 常見(jiàn)濾膜會(huì)引入PAEs, 實(shí)驗(yàn)篩選了聚醚砜濾膜、尼龍濾膜、玻璃纖維濾膜、聚丙烯濾膜、聚四氟乙烯濾膜、聚偏氟乙烯濾膜6種濾膜, 每種濾膜過(guò)濾相同體積的空白樣液, 發(fā)現(xiàn)聚四氟乙烯濾膜可以有效避免PAEs的引入。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

鑒于含乳飲料基質(zhì)較為復(fù)雜, 本研究按照“1. 5”方法考察基質(zhì)效應(yīng)的影響, 若基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間, 說(shuō)明可忽略基質(zhì)的影響, 采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量即可；反之, 則應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示, 12種PAEs的ME為33. 5%～55. 3%（見(jiàn)表2）, 存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。通常消除基質(zhì)效應(yīng)的方法有同位素內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法, 考慮到12種PAEs的同位素內(nèi)標(biāo)獲取難度大, 成本較高, 因此本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

將“1. 2. 1”中系列質(zhì)量濃度的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次按照本方法進(jìn)行測(cè)定, 繪制12種PAEs的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)表2）。結(jié)果顯示, 12種目標(biāo)物的線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)（r2）不小于0. 997。12種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（10. 0μg/L）的色譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn), 12種PAEs分離完全, 峰形對(duì)稱, 無(wú)雜峰干擾, 可以滿足定量檢測(cè)要求。采用在空白含乳飲料中添加3倍預(yù)估檢出限濃度目標(biāo)組分的方法, 以信噪比S/N=3和S/N=10分別確定各組分的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結(jié)果表明, 12種PAEs的檢出限為0. 03～0. 6μg/kg, 定量下限為0. 1～2. 0μg/kg（見(jiàn)表2）。GB 5009. 271-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鄰苯二甲酸酯的測(cè)定》國(guó)標(biāo)方法中PAEs的定量下限最低為0. 3 mg/kg[28］, 因此本方法的靈敏度優(yōu)于或與國(guó)標(biāo)方法相當(dāng), 且本方法檢測(cè)時(shí)間縮短10 min, 并降低了有機(jī)試劑用量。

圖2 PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖（10. 0μg/L）Fig. 2 Chromatograms for mixed standard solution of PAEs（10. 0μg/L）

表2 12種PAEs的線性關(guān)系、檢出限、定量下限及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear relations, limits of detection（LODs）, limits of quantitation（LOQs）and matrix effects（MEs）of 12 PAEs

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

在空白含乳飲料樣品中分別加入低、中、高及LOQ 4種濃度的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 按照本方法重復(fù)測(cè)定6次, 得到加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）, 結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知, 12種PAEs的加標(biāo)回收率為70. 8%～111%, RSD為0. 30%～7. 2%, 準(zhǔn)確度和精密度均能滿足定量檢測(cè)要求。

表3 12種PAEs的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Mean recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 12 PAEs（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采集當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)隨機(jī)抽取的含乳飲料樣品共10批, 采用本方法進(jìn)行前處理并檢測(cè)12種PAEs的含量。結(jié)果有4批次樣品檢出DMP、DIBP、DBP、DEHP、DINP, 檢 出 率 為40%, 含 量 為0. 83～49. 6μg/kg（見(jiàn)表4）；其余7種PAEs均未檢出。典型陽(yáng)性樣品的色譜圖見(jiàn)圖3。我國(guó)GB 9685-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定DEHP、DINP和DBP的最大殘留量分別為1. 5、9. 0、0. 3 mg/kg[11］, 因此上述10批次樣品為合格樣品。

表4 含乳飲料陽(yáng)性樣品中PAEs的檢出結(jié)果（μg/kg）Table 4 Detected results of PAEs in positive milk beverage samples（μg/kg）

圖3 陽(yáng)性樣品的色譜圖（樣品2）Fig. 3 Chromatograms for the positive sample（sample 2）

2.7 溫度及光照因素考察

對(duì)PAEs在不同溫度及光照下的遷移行為進(jìn)行了研究, 以空白含乳飲料樣品（塑料瓶材質(zhì)為PET）為例, 分別選取40、60、80℃避光及60 W光照4個(gè)條件, 在48 h內(nèi)定期檢測(cè)樣品中12種PAEs的含量。結(jié)果表明, 80℃下短時(shí)間內(nèi)DBP的遷移最為顯著, 最高遷移量達(dá)到7. 82μg/kg, 40℃和60℃下短時(shí)間內(nèi)遷移并不明顯；值得注意的是, 60 W光照下, 短時(shí)間內(nèi)DBP也產(chǎn)生了部分遷移（如圖4）。其他11種PAEs則未發(fā)現(xiàn)含量變化。我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 9685-2016規(guī)定[11］, PET材質(zhì)包裝DBP的允許遷移量為0. 3 mg/kg, 本研究中DBP在48 h內(nèi)的最大遷移量遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn), 因此短時(shí)間內(nèi)的高溫和光照下12種PAEs的污染風(fēng)險(xiǎn)較小。

圖4 不同溫度及光照下DBP的遷移量對(duì)比（n=3）Fig. 4 Comparison of DBP migration under different temperatures and lighting condition（n=3）

3 結(jié) 論

本文建立了檢測(cè)含乳飲料中12種PAEs的鹽析輔助液液萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。與GB 5009. 271-2016國(guó)標(biāo)方法[28］相比, 該方法的檢出限優(yōu)于或達(dá)到現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn), 檢測(cè)時(shí)間縮短10 min, 有機(jī)試劑用量減少, 成本大大降低, 且操作簡(jiǎn)單快捷, 實(shí)用性強(qiáng), 非常適合含乳飲料中PAEs含量的高通量檢測(cè)。此外, 部分PAEs在80℃或60 W光照下短時(shí)間內(nèi)會(huì)微量從塑料瓶中遷移至飲料中, 因此瓶裝含乳飲料長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)應(yīng)避免高溫光照, 以降低污染風(fēng)險(xiǎn)。