劉益鋒, 邱嘉興, 張朋杰, 孫克強, 張憲臣, 趙珍玉, 梁潤梅

（中山海關(guān)技術(shù)中心, 廣東 中山 528400）

紙質(zhì)包裝由于其原料來源廣泛、制造成本低、性能優(yōu)良、環(huán)保等優(yōu)點在食品產(chǎn)業(yè)中得到越來越廣泛的應(yīng)用[1］。在生產(chǎn)加工和存儲過程中為了防止食品接觸用紙制品霉變, 常使用有機抗菌劑達到防腐、抑菌的效果, 以增加紙制包裝和食品的存儲和使用期限[2］。氯苯酚類藥物通常用于木材的防腐抗菌, 造紙制漿的漂白和氯化消毒過程中也會產(chǎn)生氯苯酚類藥物。由于氯苯酚類藥物具有致畸變和致癌性, 許多國家均對該類藥物的使用進行了嚴格限制[3］。對羥基苯甲酸酯類具有廣泛的抑菌作用及穩(wěn)定性, 但如果超出規(guī)定的安全使用范圍, 則可能影響消費者的身體健康[4］。因此, 建立食品接觸用紙制品中氯苯酚類和對羥基苯甲酸酯類等有機抗菌劑的檢測方法, 開展食品接觸用紙制品中有機抗菌劑含量監(jiān)測, 具有十分重要的意義。

目前, 已有檢測對羥基苯甲酸酯類和氯苯酚類物質(zhì)的標準[5-7］, 主要測定方法有氣相色譜法（GC）[8-9］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[10-11］、高效液相色譜法（HPLC）[12-13］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[14-15］等。現(xiàn)階段測定有機抗菌劑的前處理條件和儀器分析條件各有特色, 但同時測定上述23種有機抗菌劑少見報道。超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS）擁有定量能力強、分辨率高等優(yōu)點, 無需對多個目標物的相關(guān)參數(shù)進行逐一優(yōu)化, 通過采用母離子的精確分子量直接定量, 可以大大地縮短多個目標物的測試時間, 近年來在食品和工業(yè)品中有毒有害化合物的快速檢測中得到了廣泛使用[16-19］。本研究建立了UPLC-Orbitrap HRMS法同時快速測定食品接觸用紙中23種有機抗菌劑, 該方法簡單、便捷、實用性強, 適用于食品接觸用紙樣品的快速篩查與檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000Q-Exactive高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜UPLC-Orbitrap HRMS, 配有HESIⅡ離子源（美國Thermo Fisher公司）；渦旋震蕩器（德國IKA公司）；電子天平（BS323S, 德國賽多利斯公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；S300H超聲波水?。绹鳦REST公司）。

乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯（HPLC級, 德國Merck公司）；乙酸銨、乙酸（色譜純, 上海安譜公司）。23種抗菌劑標準品（純度≥95%, 上海安譜公司）。

1.2 溶液配制

每種標準物質(zhì)逐一用甲醇配制成1 000 mg/L的標準儲備液, 避光在4℃以下保存。準確吸取每種儲備液混合后, 用甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標準中間液, 或其他質(zhì)量濃度的標準中間液。稱取0. 385 g固體乙酸銨, 用超純水溶解并定容至1 000 mL, 配制成5 mmol/L乙酸銨溶液, 搖勻備用。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3柱（2. 1 mm×150 mm, 3μm）；流動相：甲醇（A）-5 mmol/L乙酸銨（含0. 4%乙酸）溶液（B）, 梯度洗脫條件：0～15 min, 30%～80%A；15～20 min, 80%A；20～20. 1 min, 80%～30%A；20. 1～25 min, 30%A。流速0. 3 mL/min；柱溫40℃；進樣量10μL。

電離模式為電噴霧負離子（ESI-）；毛細管電壓為-3. 2 kV；離子傳輸溫度為320℃；鞘氣壓力為40 unit。掃描模式為Full MS/dd-MS2：采集范圍為50～500 Da；一級分辨率為70 000, 二級分辨率為17 500, 其他質(zhì)譜信息見表1。

表1 23種有機抗菌劑的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 23 organic antibacterial agents

1.4 樣品前處理

將檢測樣品制成5 mm×5 mm以下碎片, 混合均勻。稱取0. 5 g（精確至1 mg）試樣放入樣品瓶中, 加入10 mL甲醇提取液后混勻, 常溫下超聲提取20 min, 取出后經(jīng)4 500 r/min離心5 min, 轉(zhuǎn)移至氮吹儀中吹干。加入1 mL甲醇渦旋溶解, 過0. 22μm濾膜, 待上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的優(yōu)化

本文測定的23種有機抗菌劑包含19種氯苯酚類化合物和4種對羥基苯甲酸酯類化合物, 其中19種氯酚類化合物中含有4組同分異構(gòu)體, 即3個一氯苯酚、6個二氯苯酚、6個三氯苯酚和3個四氯苯酚。由于同分異構(gòu)體間的物理化學(xué)性質(zhì)相似, 色譜行為差異較小, 因此完全分離同分異構(gòu)體的難度較大。

結(jié)合文獻報道[3, 15］, 分別在常規(guī)的負離子模式下對幾種水相和有機相的分離效果進行測試, 其中有機相采用甲醇和乙腈, 水相采用5 mmol/L乙酸銨和添加不同含量乙酸的5 mmol/L乙酸銨。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 有機相采用甲醇時分離效果和響應(yīng)強度明顯高于乙腈。水相采用5 mmol/L乙酸銨加入酸后的分離效果和響應(yīng)強度明顯增強, 但考慮到酸過多會對色譜柱和管路造成損害, 因此采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0. 4%乙酸）作為本方法的流動相。

2.2 色譜柱的選擇

分別考察了Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）、Atlantis dc18（2. 1 mm×150 mm, 5μm）、uctra AQ c18（2. 1 mm×150 mm, 3μm）色譜柱對23種有機抗菌劑的分離效果。結(jié)果表明, Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）在優(yōu)化色譜條件下能使23種有機抗菌劑的色譜峰響應(yīng)值高且具有較高的分離度, 可最大程度將氯苯酚同分異構(gòu)體分離。其他2種色譜柱均存在響應(yīng)值低, 分離效果較差等不足。因此, 本方法最終采用Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）對23種有機抗菌劑進行分離（見圖1）。可觀察到, 2, 3, 4, 6-四氯苯酚和2, 3, 5, 6-四氯苯酚峰完全重疊, 3-氯苯酚和4-氯苯酚、2, 4-二氯苯酚、3, 4-二氯苯酚和2, 5-二氯苯酚等同分異構(gòu)體峰部分重疊。

圖1 4種含對羥基苯甲酸酯類化合物（A）及19種含氯苯酚化合物（B）標準物質(zhì)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 4 parabens（A）and 19 chlorinated phenols（B）standard solutions the number denoted was the same as that in Table 1

2.3 提取溶劑的選擇

有機抗菌劑均可溶于多種有機溶劑。本研究選用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等溶劑對實際樣品進行加標回收實驗, 結(jié)果顯示, 9類分析物（其同分異構(gòu)體歸為1類）的回收率分別為71. 6%～109%、78. 0%～108%、63. 0%～106%、72. 0%～110%（見圖2）。數(shù)據(jù)表明以甲醇和乙腈為提取劑時9類分析物的加標回收率較高?？紤]到流動相為甲醇, 本方法采用甲醇作為最終提取溶劑。

圖2 提取溶劑對抗菌劑提取效果的影響Fig. 2 Effect of solvents on the extraction of antibacterial agent

2.4 線性范圍與定量下限

由于所測定的23種有機抗菌劑中包含多種同分異構(gòu)體, 液相色譜完全分離的難度大, 結(jié)合文獻, 本方法確定用同組同分異構(gòu)體的含量總和進行定量分析[15］。以有3種同分異構(gòu)體的二氯苯酚為例, 精確分子量均為126. 995 6（m/z）, 對3種二氯苯酚的色譜峰面積進行加和后計算二氯苯酚的總含量。

由于高分辨質(zhì)譜的基線噪音很低, 不能采用傳統(tǒng)信噪比方法計算檢出限, 而是采用10倍空白實驗的標準偏差除以線性方程的斜率確定定量下限（LOQ）。用甲醇將混合標準中間液稀釋成一系列質(zhì)量濃度梯度的標準工作液, 按“1. 3”條件依次進行測定。結(jié)果表明, 9組化合物的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好, 相關(guān)系數(shù)均大于0. 997（見表2）。

2.5 回收率與相對標準偏差

空白基質(zhì)樣品采用不含待測物質(zhì)的食品接觸用紙, 通過添加不同濃度混合標準工作液進行回收率和相對標準偏差（RSD）實驗。選取0. 05、0. 5、2μg/kg對羥基苯甲酸酯類和0. 05、0. 5、2 mg/kg氯苯酚類3個不同加標濃度（見表3）, 每個加標水平平行測試6次, 測得9種組分的加標回收率為81. 7%～119%, RSD為2. 0%～8. 8%（見表3）。方法的回收率和RSD在合理范圍內(nèi), 實際可行。

表3 方法的回收率與相對標準偏差Table 3 Recovery and RSD of the method

2.6 實際樣品的測定

收集市場上不同品牌、不同用途的食品接觸用紙制品15批次, 利用本方法進行測試。結(jié)果顯示, 所有樣品均未檢出氯苯酚類有機抗菌劑, 1批次樣品檢出對羥基苯甲酸甲酯, 含量為0. 13μg/kg。表明對羥基苯甲酸甲酯在市場上的食品接觸用紙制品中有檢出, 市場監(jiān)管部門需要加強對食品接觸用紙制品中有機抗菌劑使用的監(jiān)管力度。

3 結(jié) 論

本文采用甲醇為提取溶劑, 超聲提取, 建立了超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜同時快速測定食品接觸用紙中23種有機抗菌劑的方法。結(jié)果顯示, 該方法簡單、便捷, 可用于食品接觸用紙中多種有機抗菌劑的篩查和確證。