陳睿智，袁 玖*，楊默晗，旦增久美，張鴻鑫，萬欣杰

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅正合生物科技有限公司)

傳統(tǒng)的概略養(yǎng)分分析法測定飼料粗脂肪采用索氏浸提法，通過無水乙醚反復(fù)浸提飼料樣品，最后稱量脂肪瓶的增重量或?yàn)V紙包的減重量，即為飼料中粗脂肪含量。使用脂肪瓶增重法(又稱油重法)，一套索氏提取器一次只能測定一個(gè)樣品，而且浸提后脂肪瓶中的脂肪遇空氣易發(fā)生氧化，脂肪瓶不易恒重；使用濾紙包減重法 (又稱殘余法)， 濾紙包的空隙大，會(huì)快速吸收空氣中的水分。為探索兩種方法是否對(duì)飼料粗脂肪測定結(jié)果有影響，本研究選用11種飼料樣品，同時(shí)進(jìn)行了油重法和殘余法測定，為實(shí)驗(yàn)室中粗脂肪的測定工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

待測定粗脂肪的飼料樣品包括玉米皮、油渣、玉米、豆粕、棉籽粕、麩皮6種單一飼料和育肥豬濃縮料、乳豬膨化顆粒料、母豬濃縮料、肉羊濃縮料、青年雞育肥料5種混合飼料,共11種飼料樣品。各樣品干燥、粉碎，通過40目樣品分級(jí)篩。11種飼料樣品均由蘭州聯(lián)邦飼料有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備

分析天平(感量0.000 1 g)，電熱式恒溫水浴鍋(室溫～100 ℃)，電熱式恒溫烘箱，鋁盒，干燥器(用變色硅膠或氯化鈣作干燥劑)，定性濾紙(中速，12.5 cm，脫脂)，索氏脂肪提取器(100或150 mL)等。

1.3 試劑

石油醚，分析純。

1.4 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

采用對(duì)比試驗(yàn),分為脂肪瓶增重法和濾紙包減重法。為避免不同批次試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)造成誤差，本研究將脂肪瓶增重法和濾紙包減重法同時(shí)進(jìn)行，即對(duì)每個(gè)飼料樣品測定粗脂肪時(shí)，既要稱量濾紙包在浸提前后的減少的重量，同時(shí)也稱量脂肪瓶在浸提前后增加的重量。試驗(yàn)全程所有樣品使用同一臺(tái)分析天平稱重。

1.5 測定步驟

1.5.1 樣品的稱量及烘干 飼料樣品粉碎，通過40目(0.45 mm孔徑)分級(jí)篩。每種樣品3個(gè)重復(fù)，同時(shí)進(jìn)行兩種粗脂肪方法的測定。分析天平準(zhǔn)確稱取 2 g(W)左右(準(zhǔn)確至0.0001 g)樣品，置于105 ℃烘箱中半開蓋烘6 h，取出，蓋好鋁盒蓋，干燥器中冷卻30 min，稱重。再置烘箱105 ℃烘干1 h，冷卻30 min，稱重，直至兩次稱重之差小于0.001 g為恒重。

1.5.2 脂肪瓶的恒重 洗凈脂肪瓶，置于105 ℃烘箱中烘30 min，干燥器中冷卻30 min，稱重。再同樣烘干15 min，冷卻，稱重，直至兩次稱重之差小于0.001 g為恒重，取最小值為W1，記錄。

1.5.3 濾紙包的準(zhǔn)備 選用中速定性脫脂濾紙。洗凈雙手，按正規(guī)方法折疊好濾紙包。

1.5.4 樣品的浸泡 將上述鋁盒中的樣品無損失移入濾紙包中折疊好，保證不會(huì)漏料。用鉛筆在濾紙包上編號(hào)，分析天平稱重W1’(濾紙+脫水樣品)，記錄。濾紙包放入浸提管，其長度要低于虹吸管高度。在浸提管中加入適量無水乙醚至淹沒濾紙包，但不超過虹吸管。浸泡過夜。

1.5.5 粗脂肪的浸提、分離 打開水浴鍋，溫度調(diào)至60～75 ℃，浸提管中添加無水乙醚至超過虹吸管高度，使之回流到脂肪瓶中。此條件下，反復(fù)浸提6～8 h左右，檢測是否浸提干凈(當(dāng)浸提管中的乙醚超過虹吸管高度開始流入脂肪瓶時(shí)，用干凈的表面皿在浸提管下端口接最后1滴乙醚，若液滴周圍無油漬證明已浸提干凈，否則繼續(xù)浸提)。

工作原理：乙醚的沸點(diǎn)為35 ℃左右，水浴條件下，乙醚在脂肪瓶中蒸發(fā)，乙醚蒸氣至冷凝管處冷凝為液體，再次流入浸提管中，浸提、溶解飼料樣品中的脂溶性物質(zhì)，當(dāng)浸提管中乙醚達(dá)到相當(dāng)高度后，即由虹吸管回流入脂肪瓶中。水浴加熱后，乙醚又揮發(fā)，脂溶性物質(zhì)則留在了脂肪瓶中。如此，反復(fù)回流、浸提，直至樣品中粗脂肪浸提干凈。粗脂肪浸提時(shí)間為4～16 h(樣品不同，粗脂肪含量不同)。乙醚易燃燒，實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格禁煙，禁明火。

1.5.6 浸提后處理 浸提干凈后，取出濾紙包至干凈的瓷盤中，讓乙醚空回流一次，以沖洗浸提管中余留的脂肪，然后繼續(xù)蒸餾?；厥找颐阎猎噭┢恐?。脂肪瓶中只有粗脂肪及少量乙醚。

1.5.7 濾紙包和脂肪瓶的烘干和恒重 ①脂肪瓶增重法：用蒸餾水洗瓶洗凈脂肪瓶的瓶底、瓶壁，濾紙擦干。用坩堝鉗或墊干凈濾紙移動(dòng)脂肪瓶，置105 ℃烘箱烘1～2 h(剛放入烘箱時(shí)，將烘箱門半開，以免乙醚蒸氣燃燒起火)。干燥器冷卻30 min，稱重。再烘干30 min，冷卻，稱重，直至兩次稱重之差小于0.001 g為恒重，取最小值為W2。②濾紙包減重法：樣本濾紙包經(jīng)乙醚浸提后，放入干凈的已知重量的鋁盒中，置105 ℃烘箱中，鋁盒半開蓋烘1～2 h，干燥器中鋁盒蓋好蓋冷卻30 min后，迅速稱重。再同樣烘干30 min，冷卻，稱重，直至兩次稱重之差小于0.001 g為恒重，取最小值為W2’。

1.6 結(jié)果計(jì)算

①脂肪瓶增重法：粗脂肪=(W2-W1)/W*100%，式中：W1為空脂肪瓶重(g)；W2為脂肪瓶和脫水樣品粗脂肪重(g)；W為風(fēng)干飼料樣品重(g)。

②濾紙包減重法：粗脂肪=(W1’-W2’)/W*100%，式中：W1’為濾紙包和脫水飼料樣品重，W2’為濾紙包和脫水脫脂后飼料樣品重；W為風(fēng)干飼料樣品重(g)。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中配對(duì)樣本t檢驗(yàn)法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

各種飼料樣品使用濾紙包減重法和脂肪瓶增重法測定測出的粗脂肪值見表1。

表1 不同稱重方法對(duì)各種飼料粗脂肪測定的影響 %

當(dāng)飼料樣品的脂肪含量分別在8%以上、4%～8%、0%～4%時(shí)，其三個(gè)平行的相對(duì)偏差依次均應(yīng)低于0.5%、1%、5%。由表1可見，本試驗(yàn)所有粗脂肪數(shù)據(jù)的相對(duì)偏差均在有效范圍內(nèi)，為有效數(shù)據(jù)，可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1可見，青年雞育肥料、麩皮的t值分別為4.891和7.13，均小于學(xué)生氏t值表中的t0.01(2)=9.925, 大于t0.05(2)=4.303，即濾紙包減重法測得粗脂肪值顯著高于脂肪瓶增重法(P<0.05)；玉米、棉粕、肉羊濃縮料的t值分別是10.881、16.692和10.15，均大于t0.01(2)=9.925，即濾紙包減重法測得粗脂肪值極顯著高于脂肪瓶增重法(P<0.01)；育肥豬濃縮料、玉米皮、油渣、乳豬膨化顆粒料、豆粕、母豬濃縮料6種樣品的t值，均小于t0.05(2)=4.303，即脂肪瓶增重法和濾紙包減重法測得的粗脂肪值差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

目前，飼料中粗脂肪含量的測定普遍使用國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T6433—2006 飼料中粗脂肪的測定》，采用索氏(Soxhlet)抽提原理進(jìn)行測定。采用傳統(tǒng)脂肪瓶增重法測定粗脂肪時(shí)，將試樣在索氏抽提管中反復(fù)抽提，直至脂肪抽提干凈，抽提瓶的增重即為樣品所含粗脂肪重量。該方法能夠完全被抽提瓶回收樣品含有的粗脂肪，可進(jìn)一步分析樣品脂肪酸組成及脂肪酸品質(zhì)。但是抽提結(jié)束后對(duì)抽提瓶進(jìn)行烘干時(shí)，粗脂肪有可能發(fā)生氧化而增重，使抽提瓶不易達(dá)到恒重狀態(tài)，或經(jīng)過長時(shí)間烘干，會(huì)在恒重之后又增重。而且，在試驗(yàn)過程中，脂肪瓶增重法測定粗脂肪，若一次進(jìn)行多個(gè)樣品的測定或做多組重復(fù)時(shí)，需要的提取器相應(yīng)增多，不利于同時(shí)進(jìn)行。濾紙包減重法是試樣在索氏抽提管中反復(fù)抽提，直到粗脂肪抽提干凈，濾紙包的減重即為樣品所含粗脂肪重量。采用濾紙包減重法，一個(gè)抽提管可同時(shí)盛放多個(gè)濾紙包(需在濾紙包上用鉛筆標(biāo)號(hào))同時(shí)進(jìn)行浸提。

本研究結(jié)果表明，5種飼料樣品采用濾紙包減重法測定的粗脂肪值顯著或極顯著高于脂肪瓶增重法，分析本次試驗(yàn)過程的操作細(xì)節(jié)得出，導(dǎo)致濾紙包減重法數(shù)值顯著大的原因如下：

3.1 濾紙包試驗(yàn)前后的處理法不同導(dǎo)致系統(tǒng)誤差

浸提前對(duì)空濾紙包和脫水樣品進(jìn)行稱重時(shí)，濾紙包沒有跟飼料樣品同時(shí)進(jìn)行烘干脫水、干燥器冷卻30 min等處理步驟；而脂肪浸提結(jié)束后，卻事先考慮了為防止濾紙包從干燥器移出會(huì)快速吸收空氣中的水分導(dǎo)致稱重?cái)?shù)據(jù)偏大，所以采用了將濾紙包放在已經(jīng)恒重的鋁盒里一起稱重的方法，致使浸提前后稱量脂肪包的條件不一致，浸提前濾紙包中水分含量與空氣中一致，濾紙包的稱重值偏大，浸提后濾紙包烘干、冷卻都是在加蓋的鋁盒內(nèi)，稱重值比浸提前偏小，代入公式，濾紙包減重法(是偏大的值-偏小的值)，計(jì)算粗脂肪值偏大。

3.2 選擇分析的飼料樣品數(shù)據(jù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差

脂肪瓶增重法中，飼料樣品脫水后從鋁盒往濾紙包轉(zhuǎn)移時(shí)，樣品或多或少肯定會(huì)有損失，但代入公式計(jì)算粗脂肪時(shí)，卻是按照飼料樣品脫水前的原來稱重進(jìn)行計(jì)算，致使脂肪瓶增重法最后的粗脂肪結(jié)果比實(shí)際值偏小。

3.3 分析純?cè)噭┐娣藕椭貜?fù)使用造成的誤差

浸提試驗(yàn)使用的無水乙醚不是新的，而是重復(fù)利用乙醚，可能對(duì)飼料中粗脂肪的浸提不徹底，導(dǎo)致濾紙包減重法測定值比實(shí)際值偏大。

3.4 未恒重容量瓶導(dǎo)致誤差

脂肪瓶增重法測定過程中沒有對(duì)空脂肪瓶進(jìn)行恒重，浸提結(jié)束后對(duì)脂肪瓶進(jìn)行烘干時(shí)，粗脂肪有可能發(fā)生氧化而增重，使脂肪瓶不要達(dá)到恒重狀態(tài)，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

鑒于本研究結(jié)果，脂肪瓶增重法和濾紙包減重法測定的粗脂肪值差異為顯著或極顯著，為求證是否是試驗(yàn)過程中操作不當(dāng)或乙醚試劑不純等造成的，還是兩種試驗(yàn)方法的差異，本研究需要進(jìn)行后續(xù)研究。

4 結(jié)論

11種飼料樣品中，5種飼料用濾紙包減重法測定的粗脂肪值顯著或極顯著高于脂肪瓶增重法。