楊正鋒,陳薪宇,崔一丹,楊金清,湯丹瑜,趙正雄,保志娟,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南昆明 650202;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,云南昆明650201)

脂質(zhì)類化合物是生物體中的一類化合物,包括油脂和類脂。脂質(zhì)類化合物通常采用石油醚進(jìn)行提取,因?yàn)樘崛〕龅奈镔|(zhì)除了油脂、類脂、甾醇和萜類等高分子的脂質(zhì)類,還包括一些低分子的揮發(fā)油、色素、醛等成分,因此也常稱為粗脂肪或石油醚提取物[1]。煙草的粗脂肪與煙草的香味和協(xié)調(diào)性密切相關(guān),是衡量煙草香味的重要指標(biāo)之一[2-4]?？緹熎贩N、部位、顏色、栽培技術(shù)及生態(tài)條件都會(huì)影響煙草粗脂肪的含量[5-9],因此研究煙草中粗脂肪的含量具有一定的意義。目前食品中粗脂肪測(cè)定多采用索氏提取法[10-12],煙草粗脂肪的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T 176-2003也是基于此原理[13]。該方法中所使用的器皿和樣品皆需要干燥,整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間要16 h以上才能完成[14],不適用于批量煙草樣品的快速分析測(cè)定。為了縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,一些研究者對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)。邵金良等將樣品提前浸泡過夜,并將稱量介質(zhì)由索氏提取器的接受瓶改為濾紙筒,該方法顯著減少了設(shè)備、試劑用量和能耗,但整個(gè)實(shí)驗(yàn)除去浸泡時(shí)間,仍然需要12 h[15]。也有研究者用超聲波輔助索氏提取粗脂肪[16-17],或是將索氏提取改為直接萃取,手動(dòng)提取改為自動(dòng)萃取儀提取[18-19],極大的減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。雖然粗脂肪的提取已經(jīng)有了一些改進(jìn),但是經(jīng)典的索氏提取法仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化。

一般條件下,粗脂肪的測(cè)定是將索氏提取的殘留物烘干冷卻稱重。這個(gè)步驟雖然操作簡便,但也要耗時(shí)3～4 h。近年來,有研究者采用近紅外光譜法進(jìn)行粗脂肪的快速測(cè)定[20-22],但該方法存在建模困難的問題,且對(duì)小規(guī)模樣品分析有一定的局限性[18]。紫外可見吸收光譜法具有操作簡單、快速和成本低的優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于各種成分的分析和油脂的鑒定[23-25]。煙葉的粗脂肪中包含甾醇、萜類和色素等化合物,故粗脂肪的石油醚溶液會(huì)吸收特定波長的光,可以考慮利用其產(chǎn)生的紫外-可見吸收光譜進(jìn)行測(cè)定以提高效率。

響應(yīng)面分析是一種解決多變量問題的統(tǒng)計(jì)方法,已經(jīng)在各種提取工藝優(yōu)化中得到了應(yīng)用[26-29]?；陧憫?yīng)面分析和粗脂肪的吸收光譜,本研究采用索氏法提取粗脂肪,以稱樣量、回流時(shí)間、烘干時(shí)間為考察因素,研究了不同提取參數(shù)對(duì)粗脂肪含量的影響,通過Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件;并利用烤煙粗脂肪溶液在不同波長處的吸光度值與濃度成正比的關(guān)系,建立一種快速測(cè)量粗脂肪含量的光譜方法,以期為煙草粗脂肪的分析研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烘烤煙葉 來自云南玉溪的4種云煙87和2種K326(初次烘烤),剔除主脈剪碎于40 ℃烘箱內(nèi)干燥2～3 h,用粉碎機(jī)粉碎,過40目篩,密封避光保存;石油醚(沸程30～60 ℃) 國產(chǎn)分析純。

UV-6100A紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;BS210S電子天平(感量0.1 mg) Sartorius公司;WGLL-230BE恒溫干燥箱(室溫～300 ℃) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烘烤煙葉粗脂肪的提取及含量計(jì)算 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的煙葉粉末樣品,分成兩份并用脫脂濾紙包好,放入105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重后,將樣品放入索氏提取器中,加入200 mL石油醚,在(75±1) ℃水浴加熱回流提取一定時(shí)間后,回收石油醚,并將接收瓶外部洗凈于105 ℃烘箱內(nèi)烘干1～3.5 h后,放置于干燥器中冷卻至恒重進(jìn)行稱重。粗脂肪的含量計(jì)算公式:

式中:m2表示接受瓶加粗脂肪的質(zhì)量,g;m1表示接受瓶質(zhì)量,g;m樣表示煙樣取樣量,g;w表示樣品含水率,%。

1.2.2 煙葉粗脂肪提取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在回流6 h,105 ℃烘干2 h的條件下,考察稱樣量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g)對(duì)煙葉粗脂肪含量的影響;在稱量樣為2.0 g,在105 ℃烘干2 h的條件下,考察回流時(shí)間(4、5、6、7、8、9 h)對(duì)煙葉粗脂肪含量的影響;在稱量樣為2.0 g,回流6 h的條件下,考察烘干時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)對(duì)煙葉粗脂肪含量的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以上述3個(gè)因素為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)自變量,以粗脂肪含量為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值,優(yōu)化煙葉粗脂肪提取工藝條件。響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

1.2.3 煙葉粗脂肪的光譜測(cè)定 在最優(yōu)條件下提取煙葉粗脂肪,測(cè)定粗脂肪的質(zhì)量(同時(shí)采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[13]進(jìn)行質(zhì)量確認(rèn))后,加入石油醚溶解并定容于50 mL干燥的容量瓶中,作為測(cè)定的母液,取部分母液用石油醚稀釋為不同的溶液;以石油醚作為空白,經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描后得到各梯度溶液和母液的紫外吸收光譜。選擇最佳的工作波長,測(cè)定烤煙粗脂肪梯度溶液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí),取1份云煙87和2份K326樣品按照優(yōu)化的條件進(jìn)行測(cè)定,考察光譜測(cè)定方法的適用性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Microsoft Excel 2013、Design-Expert.V8.0.6和Origin 6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉粗脂肪提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 稱樣量對(duì)粗脂肪提取的影響 固定其它條件,改變一個(gè)提取因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),每個(gè)條件平行3次,考察稱樣量對(duì)粗脂肪含量的影響。圖1所示,隨著稱樣量的增加,粗脂肪含量呈先升高后降低的趨勢(shì),在3.0 g處達(dá)到最大值。但是樣品量大于3.5 g后,粗脂肪提取不完全,故測(cè)定的脂肪含量降低。因此實(shí)驗(yàn)選定2.5、3.0、3.5 g煙樣重量為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖1 稱樣量對(duì)粗脂肪提取的影響

2.1.2 回流時(shí)間對(duì)粗脂肪提取的影響 圖2是回流時(shí)間對(duì)粗脂肪提取的影響。從圖2中可以看出,回流時(shí)間為4～7 h時(shí),粗脂肪的含量隨時(shí)間增加而增加,超過7 h后粗脂肪的含量變化較小,這表明7 h以后粗脂肪不再溶出?？紤]到回流時(shí)間過長,會(huì)抽提出更多的雜質(zhì),因此實(shí)驗(yàn)以7 h作為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的零水平。

圖2 回流時(shí)間對(duì)粗脂肪提取的影響

2.1.3 烘干時(shí)間對(duì)粗脂肪提取的影響 固定其它提取條件,考察了不同烘干時(shí)間對(duì)粗脂肪含量的影響。從圖3可以看出,烘干時(shí)間在1.0～3.0 h,隨著烘干時(shí)間的增加粗脂肪含量不斷下降,當(dāng)烘干時(shí)間大于3 h后,粗脂肪的含量變化較小?？紤]到烘干時(shí)間不夠,會(huì)導(dǎo)致提取物未完全干燥,而烘干時(shí)間過久會(huì)造成提取物揮發(fā)損失,因此實(shí)驗(yàn)參考前人研究[19]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[13],以2 h為干燥時(shí)間的0水平。

圖3 烘干時(shí)間對(duì)粗脂肪提取的影響

2.2 煙葉粗脂肪提取工藝優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),并利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,優(yōu)化粗脂肪的提取工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)粗脂肪試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 利用軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得粗脂肪含量(Y)對(duì)自變量—稱樣量(A)、回流時(shí)間(B)、烘干時(shí)間(C)的二次多元回歸模型方程:Y=6.07-0.024A-0.096B-0.017C-0.023AB-0.020AC+0.14BC-0.059A2+0.031B2+(3.75×10-3)C2。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述,能直接反應(yīng)各因素與響應(yīng)值的關(guān)系及各個(gè)因素間的交互作用。曲面坡度陡峭、等高線呈橢圓形表示兩因素交互影響大,而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[30]。圖4直觀反映了稱樣量、回流時(shí)間、烘干時(shí)間兩兩交互作用對(duì)粗脂肪含量的影響。從圖4a中可以看出,回流時(shí)間(B)和稱樣量(A)的交互作用顯著性較弱,回流時(shí)間在高水平時(shí),粗脂肪含量的響應(yīng)面拋物曲線的最高點(diǎn)處于較低水平,隨著回流時(shí)間的下降,粗脂肪含量的響應(yīng)拋物曲線最高點(diǎn)向高水平方向移動(dòng)。稱樣量比較低時(shí),粗脂肪含量的響應(yīng)面拋物曲線的最高點(diǎn)處于較高水平。由圖4b可知,粗脂肪含量的響應(yīng)面坡度比較平緩,表明稱樣量和烘干時(shí)間的交互作用較弱,且稱樣量的影響因素大于烘干時(shí)間。由圖4c可知,粗脂肪含量的響應(yīng)面坡度比較陡峭,回流時(shí)間和烘干時(shí)間的交互作用顯著,且響應(yīng)面的響應(yīng)值在回流時(shí)間和烘干時(shí)間較短時(shí)較高,這與回歸分析結(jié)果相一致。

圖4 兩因素交互作用對(duì)粗脂肪含量影響的響應(yīng)面圖

表4 煙葉粗脂肪傳統(tǒng)方法與本法測(cè)定結(jié)果比較

2.2.4 模型優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn) 由Design-Expert. V8.0.6軟件回歸模型分析,得出的粗脂肪的最佳提取條件是:稱樣量3.08 g,回流時(shí)間6 h,烘干時(shí)間1.5 h,此時(shí)粗脂肪含量的預(yù)測(cè)值為6.355%。在此條件下做了五次驗(yàn)證試驗(yàn),得粗脂肪含量品平均值為6.27%,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.34%<5%,說明該模型較好地預(yù)測(cè)實(shí)際提取量。

分別取3種云煙87煙樣,用標(biāo)準(zhǔn)YC/T 176-2003的索氏提取法和本方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表4所示。從表中可以看出來,標(biāo)準(zhǔn)法和本法的測(cè)定結(jié)果之間沒有顯著性差異(F

2.3 煙葉粗脂肪光譜測(cè)定方法

2.3.1 煙葉粗脂肪的紫外可見吸收光譜 將濃度為2.763 g/L的粗脂肪母液用石油醚稀釋為0.276、0.55、1.105、1.658、2.211 g/L的溶液,分別掃描6個(gè)溶液在200～600 nm 波長范圍內(nèi)的吸收光譜。在圖5中,在280～500 nm的波長范圍,各溶液的光譜顯示有5個(gè)明顯的吸收峰,最大吸收波長分別為298.5、326、415、435、475 nm。其中298.5 nm的吸收峰隨著溶液濃度的增加藍(lán)移至290 nm。

圖5 煙葉粗脂肪溶液的紫外可見光譜

2.3.2 工作波長的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線 將濃度為2.763 g/L的粗脂肪溶液配制成系列濃度的工作液,分別測(cè)定290、298.5、326、415、435、475 nm處的吸光度,以粗脂肪濃度為橫坐標(biāo),溶液吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,得到的回歸方程如表5所示。在一定的濃度范圍內(nèi),各波長下溶液的吸光度值與濃度線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2值在0.9938～0.9996。按公式LOD=3.3 σ/S,LOQ=10 σ/S求出各波長下的檢出限和定量限,其中σ指回歸工作曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差,S指回歸方程的斜率。計(jì)算各波長的檢出限為0.074～0.238 g/L,定量限為0.223～0.721 g/L。隨著波長的增加,擬合曲線的相關(guān)系數(shù)增加,樣品的檢出限和定量限減小。考慮到樣品濃度較低時(shí),長波長下吸光度值測(cè)定的準(zhǔn)確性,因此工作波長在326～475 nm較好。

表5 烤煙粗脂肪的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.3.3 方法的重復(fù)性 重復(fù)性試驗(yàn)取云煙87樣品,按1.2.3下進(jìn)行處理,平行測(cè)定6次,求得各波長下吸光度的RSD分別為1.56%、1.77%、2.02%、2.73%、2.44%和2.94%,皆<3%(表6)。結(jié)果表明,本方法的重復(fù)性良好。

表6 粗脂肪溶液吸光度的重復(fù)性(n=6)

2.3.4 光譜方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 選取了3個(gè)煙葉樣品,參照YC/T 176-2003方法提取粗脂肪,測(cè)定準(zhǔn)確質(zhì)量后,加入石油醚定容一定體積,用上述光譜試驗(yàn)方法測(cè)定粗脂肪含量,每份樣品平行測(cè)定3次,結(jié)果見表7。從表中可以看出,不同波長測(cè)定樣品的相對(duì)誤差不同。其中,用326和415 nm波長處吸光度計(jì)算的3種樣品粗脂肪溶液濃度與實(shí)際濃度的相對(duì)誤差在-8.4%～7.7%之間,并且云煙87樣品的吻合度較好。而K326樣品因?yàn)楹械某煞植煌?用其它波長測(cè)量的相對(duì)誤差較大。因此,有多品種樣品同時(shí)測(cè)定時(shí),采用326和415 nm波長處的吸光度定量較好;但若只有相同品種煙樣時(shí),建議采用較長的波長,如475 nm等進(jìn)行測(cè)定,方法的檢測(cè)限較低。

表7 不同樣品粗脂肪的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法對(duì)烤煙中粗脂肪的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,最佳條件為:稱樣量3.08 g,回流時(shí)間6 h,烘干時(shí)間1.5 h,此時(shí)粗脂肪含量為6.27%。與傳統(tǒng)索氏提取方法相比,優(yōu)化的方法縮短了測(cè)定時(shí)間,且方法的重復(fù)性和精密度較好,具有較好的可行性和實(shí)用價(jià)值。

利用烤煙粗脂肪溶液在290、298.5、326、415、435、475 nm波長處的吸光度值與濃度正比的關(guān)系,建立了一種快速測(cè)量粗脂肪含量的光譜方法。煙葉粗脂肪溶液的濃度在0.276～2.211或 0.276～2.763 g/L范圍內(nèi)與吸光度有較好的線性關(guān)系。在多品種煙葉樣品測(cè)試中,選用326和415 nm波長來進(jìn)行測(cè)定較佳。本方法與索氏法相比,粗脂肪不需要干燥,因此比較簡便和省時(shí),且適合大批量煙葉粗脂肪的分析測(cè)定。另外,進(jìn)一步研究后,本方法也有望發(fā)展成為煙葉粗脂肪的鑒定方法。