岳倩倩，王先桂，田 多

（茅臺(tái)學(xué)院，貴州仁懷 564507）

紅曲霉是一種絲狀腐生真菌，在分類學(xué)地位上，其隸屬于真菌門子囊菌亞門不整囊菌綱散囊菌目紅曲菌科[1]。因在生產(chǎn)過程中能產(chǎn)生色素、淀粉酶等代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已被廣泛研究。由于紅曲霉的代謝產(chǎn)物紅曲色素具有安全性和穩(wěn)定性，人們將其應(yīng)用于肉制品、豆腐乳制品或釀酒行業(yè)[2-5]。同時(shí)，紅曲霉在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的糖化酶、酯化酶、蛋白酶等酶類，在相互作用下，可生成核苷酸、氨基酸、單糖等呈味物質(zhì)和酯類、醇類等香氣物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味起著重要作用[6]。在醫(yī)藥方面，有研究表明，紅曲霉生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物洛伐他汀具有降低血脂和降膽固醇的作用；γ-氨基丁酸具有降血壓、助睡眠、抗驚厥等作用[7]。

現(xiàn)階段，人們將大米作為紅曲霉的發(fā)酵基質(zhì)，最終以紅曲米的形式在市面上進(jìn)行銷售。有研究表明，在用大米作為紅曲霉發(fā)酵基質(zhì)時(shí)，以粳米為基質(zhì)發(fā)酵更利于產(chǎn)生黃色素和紅色素[8]。但是，現(xiàn)存于市面上的紅曲米產(chǎn)品眾多，人們?nèi)绾卧诒姸嗟漠a(chǎn)品中挑選合適的產(chǎn)品就顯得尤為困難。因此，本文從網(wǎng)上隨機(jī)挑選3款紅曲產(chǎn)品，利用微生物實(shí)驗(yàn)方法和試劑盒法，對(duì)3款紅曲產(chǎn)品中紅曲霉所產(chǎn)色素含量、淀粉酶活性進(jìn)行研究，以期通過上述實(shí)驗(yàn)的開展，選出優(yōu)質(zhì)的紅曲產(chǎn)品，為人們?cè)谔暨x和購(gòu)買紅曲產(chǎn)品時(shí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從淘寶網(wǎng)上隨機(jī)挑選3款紅曲產(chǎn)品，品牌為某本紅曲米、某杰紅曲米和某田紅曲米，通過分離純化，得到3株紅曲霉菌株，命名為MN-1、MN-2和MN-3。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

麥芽糖，山東綠英化工科技有限公司；蛋白胨，青島青藥生物工程有限公司；酵母膏，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖，重慶萬(wàn)盛川東化工有限公司；無水乙醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；淀粉酶試劑盒，索萊寶生物有限公司；沙氏培養(yǎng)基（酵母膏 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，麥芽糖 5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂 20 g·L-1，121 ℃滅菌 25 min）。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；醫(yī)用離心機(jī)，曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；752-Pro紫外可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；XS-212-202雙目生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；HH-8恒溫水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化

將3種紅曲米分別放入研缽進(jìn)行粉碎處理，然后稱取紅曲粉10 g于250 mL三角瓶中，加入100 mL無菌水，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，28 ℃、80 r·min-1的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h使紅曲霉菌種活化。

1.4.2 菌種分離

用稀釋涂布法將已活化的紅曲霉菌液接種到滅菌的沙氏培養(yǎng)基上，放置30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中10 d后取出，挑選紅曲霉單菌落菌株，然后轉(zhuǎn)接到沙氏斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 形態(tài)觀察

將保存在斜面培養(yǎng)基上的紅曲霉菌株分別點(diǎn)種在沙氏平板培養(yǎng)基上，然后放置到28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后取出,觀察菌落形態(tài)、隆起度及變色時(shí)間，并用直尺測(cè)量菌落直徑。

1.4.4 孢子懸液制備

將已活化的紅曲霉菌株用無菌水洗下后，經(jīng)4層濾紙過濾到無菌三角瓶中，然后將濾液分裝于10 mL無菌離心管中進(jìn)行3次離心，條件為4 000 r·min-1，10 min，然后分別接種到30 mL的液體培養(yǎng)基中，每樣本3個(gè)平行，孢子液終濃度大約為4×105CFU·mL-1，置于搖床上振蕩培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為 30 ℃，230 r·min-1。

1.4.5 色素測(cè)定方法

取適量菌液和菌絲，研磨混勻后，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至10 mL，顛倒混勻后置于恒溫水浴鍋中浸提30 min。浸提結(jié)束后，取出冷卻至室溫。經(jīng)過濾后，用70%乙醇稀釋濾液至適當(dāng)倍數(shù)，以70%乙醇為對(duì)照，在505 nm下測(cè)定吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算色價(jià)。色價(jià)計(jì)算公式為色價(jià)=吸光度值×稀釋倍數(shù)。

1.4.6 淀粉酶活性檢測(cè)

根據(jù)淀粉酶試劑盒說明書分別處理說明書中的試劑一、試劑二和制備10 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，然后將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為1.000 00 mg·mL-1、 0.200 00 mg·mL-1、0.100 00 mg·mL-1、0.050 00 mg·mL-1、0.025 00 mg·mL-1、0.012 50 mg·mL-1和0.006 25 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取兩支EP管分別加入250 μL淀粉酶原液和淀粉酶稀釋液，沸水浴5 min，分別作α-淀粉酶和β-淀粉酶對(duì)照管，并依次加入MN-1、MN-2、MN-3這3種菌液，于540 nm處測(cè)定吸光度值。

α-淀粉酶活性計(jì)算公式為

式中：x1為α-淀粉酶濃度，mg·mL-1；x2為總淀粉酶濃度，mg·mL-1；W為樣品重量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)品中紅曲霉菌落形態(tài)差異性比較

由圖1可知，在3種紅曲霉菌株中，MN-1菌落形態(tài)為棉絮狀，氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈放射狀，在培養(yǎng)至第8 d時(shí)，平板中產(chǎn)生大量色素，且中間凸起有褶皺，邊緣整齊，菌落直徑可達(dá)69 nm；MN-2菌落形態(tài)為棉絮狀，氣生菌絲較為發(fā)達(dá)，呈放射狀，在培養(yǎng)至第8 d時(shí)，平板中產(chǎn)生大量色素，中間凸起，邊緣整齊，菌落直徑可達(dá)57 mm；MN-3菌落形態(tài)為棉絮狀，氣生菌絲較為發(fā)達(dá)，呈放射狀，在培養(yǎng)至第8 d時(shí)，平板中產(chǎn)生色素，中間凸起，邊緣整齊，菌落直徑可達(dá)49 mm；因此，在相同的培養(yǎng)時(shí)間下，菌株MN-1生長(zhǎng)較好。

圖1 不同產(chǎn)品中紅曲霉菌落形態(tài)

2.2 不同產(chǎn)品中紅曲霉色素含量的測(cè)定

對(duì)于紅曲霉色素的產(chǎn)生，現(xiàn)已有研究表明，紅曲霉產(chǎn)生的色素有非水溶性和水溶性兩種。非水溶性色素為胞內(nèi)累計(jì)，存在于菌絲內(nèi)，需用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取；水溶性色素為胞外蓄積，存在于發(fā)酵液中。當(dāng)色素吸收波長(zhǎng)在410 nm時(shí)定義為黃色素，在470 nm時(shí)定義為橘色素，在510 nm時(shí)定義為紅色素。根據(jù)1.4.5方法，測(cè)定3種品牌中紅曲霉產(chǎn)色素含量的差異。由表1可知，在所測(cè)胞外色素含量中，MN-2菌株生成的色素含量最高，色價(jià)為9.61 U·mL-1；其次為MN-1菌株，生成的色素色價(jià)為8.53 U·mL-1；菌株MN-3生成的色素量最低，色價(jià)為6.44 U·mL-1。在所測(cè)胞內(nèi)色素含量中，MN-2菌株生成的色素含量最高，色價(jià)為8.71 U·mL-1;其次為MN-1菌株，生成的色素色價(jià)為8.42 U·mL-1；色素生成量最低的為菌株MN-3，色價(jià)為6.12 U·mL-1。經(jīng)過整體分析可知，色素含量最高的菌株為MN-2，其色價(jià)為18.32 U·mL-1。

表1 不同產(chǎn)品中紅曲霉吸光度值和色價(jià)的測(cè)定

2.3 淀粉酶溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，是目前發(fā)酵工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一類酶。通過采用1.4.6方法，制作淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2結(jié)果，以淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程為Y=0.347 7X+0.034 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。因此，淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.006 25～1.000 00 mg·mL-1線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)淀粉酶濃度的計(jì)算。

表2 淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度值

2.4 不同產(chǎn)品中紅曲霉淀粉酶活性含量的測(cè)定

紅曲霉在生長(zhǎng)過程中可代謝產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶等酶活力，通過采用1.4.6方法，測(cè)定MN-1、MN-2和MN-3中紅曲霉在波長(zhǎng)540 nm下的吸光度值，根據(jù)1.4.6中的公式計(jì)算淀粉酶活性，結(jié)果如表3所示。

表3 不同產(chǎn)品中紅曲霉淀粉酶活性

由表3可知，在測(cè)定的3種紅曲產(chǎn)品中，α-淀粉酶活性產(chǎn)量最高的菌株為MN-1，其淀粉酶活性為10.8 U·g-1；β-淀粉酶活性產(chǎn)量最高的菌株MN-3，淀粉酶活性為13.5 U·g-1；總淀粉酶活性最高的菌株為MN-1，總淀粉酶活性為22.6 U·g-1，菌株MN-2總淀粉酶活性最低。

3 結(jié)論

通過采用分光光度法和淀粉酶試劑盒法，對(duì)3種紅曲霉產(chǎn)品進(jìn)行色素含量和淀粉酶活性的測(cè)定。結(jié)果表明，在選取的3種產(chǎn)品中，色素含量最高的菌株為MN-2，最低的為菌株MN-3。α-淀粉酶活性最高的菌株為MN-1，β-淀粉酶活性最高的菌株為MN-3，總淀粉酶活性最高的菌株為MN-1。因此，在生活中，如需選擇紅曲霉產(chǎn)品用作食品著色劑時(shí)，可選擇菌株MN-2；如需選擇紅曲霉提高白酒釀造過程中的原料出酒率，則可以選擇菌株MN-1。本實(shí)驗(yàn)的開展不僅可以豐富紅曲霉理論研究知識(shí)，還可為紅曲霉在食品和工業(yè)上的應(yīng)用提供參考，具有實(shí)際意義。