盛 偉，吳欣池，梁 浩，李慈云，馬艷艷，張靖雪，丁西朋，李欣勇，劉國(guó)道

（1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院, 海南 ?？?570228；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所, 海南 儋州 571737）

土壤鹽漬化是一種非生物脅迫，極大地限制了作物的種子萌發(fā)、產(chǎn)量及品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了諸多不便[1]。我國(guó)鹽堿化耕地面積已達(dá)到3.417 ×107hm2，篩選和種植耐鹽作物是合理利用鹽堿土的有效措施之一[2]。木豆(Cajanus cajan)為豆科牧草，用途廣泛，可作糧食和飼料[3]，在藥理活性[4]方面也具有極大潛力，在我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)普遍栽培[5]。因此，開展木豆耐鹽種質(zhì)資源的挖掘及耐鹽機(jī)制研究，可為常規(guī)育種工作奠定基礎(chǔ)，為急需改善的鹽堿化耕地提供發(fā)展思路。

目前，關(guān)于木豆品種的篩選鑒定和耐鹽機(jī)制的研究仍在起步階段，李拴林等[6]發(fā)現(xiàn)在不同鹽脅迫濃度下木豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根和胚芽，隨鹽濃度的增大而降低。Garg 和Sharma[7]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可降低植物生物量、增加對(duì)根的負(fù)面效應(yīng)。不同木豆種質(zhì)資源在形態(tài)指標(biāo)和物候期方面存在較大變異[8]。在對(duì)耐鹽性關(guān)鍵指標(biāo)的篩選中，已在扁蓿豆(Medicago ruthenica)[9]、偃麥草(Elytrigia repens)[10]、苜蓿(M. sativa)[11]、白三葉(Trifolium repens)[12]和白花草木樨(Melilotus alba)[13]中已經(jīng)明確，但對(duì)不同基因型木豆種質(zhì)耐鹽性關(guān)鍵指標(biāo)的篩選和耐鹽性綜合評(píng)價(jià)鮮見報(bào)道，嚴(yán)重影響了木豆在鹽堿地的推廣應(yīng)用。

本研究以41 份木豆種質(zhì)資源為材料，利用NaCl模擬鹽脅迫，運(yùn)用變異系數(shù)分析、相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析和聚類分析評(píng)價(jià)方法，確定木豆萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選萌發(fā)期耐鹽種質(zhì)，并探討不同基因型木豆種質(zhì)萌發(fā)期鹽脅迫的生理耐受響應(yīng)機(jī)制，旨在為木豆大規(guī)模耐鹽性鑒定和耐鹽機(jī)制研究，提供鑒定方法和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料41 份木豆種質(zhì)均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所種質(zhì)資源庫(kù)提供(表1)。

表1 41 份木豆種質(zhì)資源基本信息Table 1 Basic information of the 41 pigeon pea varieties

1.2 試驗(yàn)方法

為確定參試木豆材料萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)的適宜脅迫濃度，提前從參試材料中隨機(jī)選取6 份木豆種質(zhì)材料，分別在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為0 (CK)、0.15%、0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50% 時(shí)預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.90% 時(shí)，6 份木豆材料發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)受到明顯抑制，且材料間差異顯著，因此最終選擇0.90% 的NaCl 溶液用以評(píng)價(jià)41份木豆材料萌發(fā)期的耐鹽性。

選取大小均勻一致、飽滿、無病蟲害的種子，利用無水乙醇進(jìn)行浸泡消毒(20 min)，隨后用蒸餾水將種子清洗干凈待用。采用紙上發(fā)芽法，對(duì)照組和處理組各設(shè)3 次重復(fù)，每重復(fù)50 粒，每培養(yǎng)皿鋪2 層濾紙，分別施加10 mL 對(duì)應(yīng)溶液。將種子均勻置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在人工氣候箱進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(25 ℃)，相對(duì)濕度為50%，第10 天發(fā)芽結(jié)束。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

每隔24 h 觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)，以胚根或胚芽突破種皮并長(zhǎng)于種子長(zhǎng)度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算種子的發(fā)芽率(%)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。計(jì)算公式如下：

公式(2)中，Gt為第t日種子的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽試驗(yàn)天數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每處理隨機(jī)選取10 株幼苗，用清水洗凈，稱量鮮重，隨后利用LA-S 根系掃描軟件(杭州萬深檢測(cè)科技有限公司)進(jìn)行掃描分析，獲得幼苗的根長(zhǎng)(cm)、苗長(zhǎng)(cm)、根長(zhǎng)/苗長(zhǎng)、根系表面積(cm2)、根系體積(cm3)、根系平均直徑(mm)。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

在萌發(fā)期耐鹽性不同的各類別中，挑選代表性材料在幼苗第10 天時(shí)，進(jìn)行取樣。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用NBT 光還原法測(cè)定[14]；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[15]；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和作圖表，SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用變異系數(shù)分析、相關(guān)性分析和因子主成分分析，對(duì)木豆萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行篩選；根據(jù)隸屬函數(shù)分析和聚類分析，對(duì)41 份木豆材料萌發(fā)期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)。同時(shí)，為減少各材料間指標(biāo)性狀固有性差異，各指標(biāo)值均使用相對(duì)值來進(jìn)行分析。

公式(5)為正向隸屬函數(shù)公式，公式(6)為反向隸屬函數(shù)公式，式中：R(Xi) 為各指標(biāo)隸屬函數(shù)值，Xi為指標(biāo)測(cè)定值，Xmin、Xmax為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值；Wj為第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度及權(quán)重大??；Pj表示各品種第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率；D值表示在鹽脅迫下各品種耐鹽能力的綜合評(píng)價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)木豆種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響

如表2 所列，鹽脅迫下，木豆種子萌發(fā)期10 項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)的變異系數(shù)在0.178～0.790，說明41 份木豆材料的各指標(biāo)性狀之間存在差異。其中，相對(duì)根系表面積、相對(duì)根系體積、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗長(zhǎng)、相對(duì)根冠比的變異系數(shù)均在0.500 以上，分別為0.790、0.645、0.621、0.551 和0.580，說明這5 項(xiàng)指標(biāo)在鹽脅迫后的變化更大。相對(duì)根系平均直徑、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)和相對(duì)鮮重的變異系數(shù)均未超過0.300，分別為0.253、0.178、0.202、0.293和0.293，說明這5 項(xiàng)指標(biāo)受鹽脅迫的影響較小。

表2 鹽脅迫下41 份木豆材料的10 項(xiàng)相對(duì)指標(biāo)Table 2 Variation in 10 physiological response indices for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.2 鹽脅迫下木豆種子萌發(fā)期指標(biāo)的相關(guān)性

如表3 所列，相對(duì)根系表面積與相對(duì)根系平均直徑極顯著負(fù)相關(guān)(P＜ 0.01)，與相對(duì)根系體積、相對(duì)根長(zhǎng)極顯著正相關(guān)；相對(duì)根系平均直徑與相對(duì)根長(zhǎng)顯著負(fù)相關(guān)(P＜ 0.05)；相對(duì)根系體積與相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)鮮重、相對(duì)根冠比顯著正相關(guān)，與相對(duì)根長(zhǎng)極顯著正相關(guān)；相對(duì)發(fā)芽率與相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)極顯著正相關(guān)；相對(duì)發(fā)芽指數(shù)與相對(duì)活力指數(shù)顯著正相關(guān)，與相對(duì)鮮重顯著負(fù)相關(guān)；相對(duì)活力指數(shù)與相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗長(zhǎng)顯著正相關(guān)，與相對(duì)鮮重極顯著正相關(guān)；相對(duì)根長(zhǎng)與相對(duì)苗長(zhǎng)顯著正相關(guān)，與相對(duì)鮮重和相對(duì)根冠比則極顯著正相關(guān)；相對(duì)苗長(zhǎng)與相對(duì)鮮重極顯著正相關(guān)，與相對(duì)根冠比極顯著負(fù)相關(guān)。這說明10 項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)間密切程度高，進(jìn)一步通過主成分分析來確定木豆萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表3 鹽脅迫下41 份木豆材料各指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson’s correlation coefficients of 10 physiological response indices for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.3 耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

主成分分析(表4) 表明，前4 個(gè)主成分的累加貢獻(xiàn)率達(dá)80.14%，特征值都大于1，因此將前4 個(gè)成分作為41 份木豆材料耐鹽性評(píng)價(jià)的主要因子。第1 主成分對(duì)應(yīng)特征向量中載荷排名前3 的指標(biāo)是相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)根系體積和相對(duì)根系表面積，分別為0.790、0.738 和0.718；第2 主成分對(duì)應(yīng)特征向量載荷排名前3 的指標(biāo)是相對(duì)根冠比、相對(duì)苗長(zhǎng)和相對(duì)鮮重，分別為-0.811、0.736 和0.512；第3 主成分對(duì)應(yīng)特征向量載荷排名前3 的指標(biāo)是相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)活力指數(shù)，分別為0.903、0.770和0.392；第4 主成分對(duì)應(yīng)特征向量載荷排名前3 的指標(biāo)是相對(duì)根系平均直徑、相對(duì)根系體積和相對(duì)苗長(zhǎng)，分別為0.795、0.365 和-0.322。綜合相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果，選擇4 個(gè)主成分中與其他指標(biāo)存在極顯著相關(guān)性且特征向量絕對(duì)值最大的指標(biāo)(相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)根冠比、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)根系平均直徑)作為木豆種子萌發(fā)期耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表4 4 個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率及載荷矩陣Table 4 Principal component analysis coefficients and cumulative contributions of the 10 physiological response indices used for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.4 41 份木豆耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

綜合隸屬函數(shù)值結(jié)果(表5)表明，41 份木豆材料種子萌發(fā)期耐鹽能力存在明顯差異，排在前3 位的耐鹽綜合隸屬函數(shù)值分別為0.620、0.558 和0.527，都在0.5 以上，表明這3 份材料耐鹽性較強(qiáng)；排在最后3 位的隸屬函數(shù)值都在0.3 以下，分別為0.292、0.289 和0.259，表明耐鹽性較弱。

表5 41 份木豆材料耐鹽隸屬函數(shù)值Table 5 Subordinate function value analysis of 41 pigeon pea varieties under salt stress

聚類分析(圖1) 結(jié)果表明，在歐式距離5 處可將41 份木豆材料劃分為4 個(gè)類群：第1 類群為高耐鹽型種質(zhì)，含有1 份種質(zhì)，約占總材料的2.44%；第2 類群為耐鹽型種質(zhì)，含有10 份種質(zhì)，占總材料的24.39%；第3 類群為中間型種質(zhì)，含有23 份種質(zhì)，占總材料的56.10%；第4 類群為鹽敏感型種質(zhì)，含有7 份種質(zhì)，占總材料的17.07%。

圖1 41 份木豆材料耐鹽性聚類分析圖Figure 1 Cluster analysis plot of 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.5 不同耐鹽性木豆在鹽脅迫下的生理響應(yīng)分析

從耐鹽性結(jié)果得到的4 種不同耐鹽性類群中，分別選擇代表性材料(高耐鹽型“34”、耐鹽型“3”和“9”、中間型“37”和“8”、鹽敏感型“35”和“22”)進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定分析。結(jié)果表明，0.9%鹽脅迫處理下不同耐鹽性木豆的SOD 活性均不同程度下降(除鹽敏感型“35”外)，其中，耐鹽型“9”、中間型“8”和鹽敏感型“22”顯著低于對(duì)照(P＜ 0.05)，高耐鹽型木豆的SOD 活性高于鹽敏感型(圖2)，表明高耐鹽型木豆較鹽敏感型清除活性氧的能力更強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)損害的抵抗力更強(qiáng)。0.9% 鹽脅迫處理下的高耐鹽型、中間型和鹽敏感型木豆的POD 活性均顯著高于對(duì)照(P＜ 0.05)，分別為對(duì)照的3.80 倍、1.91 倍、2.05 倍、4.36 倍、2.91 倍和4.57 倍，高耐鹽型木豆的POD 活性高于耐鹽型、中間型和鹽敏感型；中間型和鹽敏感型木豆在鹽脅迫處理下，其POD 活性呈上升趨勢(shì)，表明植株對(duì)鹽敏感的程度越高，對(duì)細(xì)胞損傷程度越高。在0.9% 鹽脅迫處理下，CAT 活性與對(duì)照相比變化較小，僅高耐鹽型“34”和耐鹽型“3”顯著高于對(duì)照(P＜ 0.05)，但高耐鹽型、耐鹽型同鹽敏感型的CAT 變化趨勢(shì)有所不同；高耐鹽型“34”和耐鹽型木豆“3”和“9”的CAT 分別較對(duì)照提升了37.02%、97.31% 和11.58%，鹽敏感型木豆“35”和“22”的CAT 較對(duì)照降低了34.31%和11.67%。

圖2 不同耐鹽性木豆在鹽脅迫下的超氧化物歧化、過氧化物酶和過氧化氫酶活性Figure 2 Superoxide dismutase (SOD), peroxisome (POD), and catalase (CAT) activities of the different salt-tolerant pigeon pea varieties under salt stress

3 討論

3.1 木豆種子萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)

本研究發(fā)現(xiàn)，在0.9%鹽脅迫下，41 份木豆種子萌發(fā)期耐鹽性具有明顯差異，可分為高耐鹽型(2.44%)、耐鹽型(24.39%)、中間型(56.10%) 和鹽敏感型(17.07%)。通常情況下，鹽脅迫可顯著降低植物種子發(fā)芽率[9-10,12,17]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，0.9%鹽脅迫對(duì)木豆種子的發(fā)芽抑制不顯著，這可能是由于木豆種子發(fā)芽速率快，導(dǎo)致鹽脅迫對(duì)其影響不顯著，但是鹽脅迫可顯著抑制木豆幼苗的生長(zhǎng)。這一研究結(jié)果與低鹽濃度脅迫能促進(jìn)草木樨[18]、沙打旺(Astragalus adsurgens)[19]種子發(fā)芽相似。作物的耐鹽性，在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段存在差異，木豆在萌發(fā)期表現(xiàn)出較好的耐鹽性種質(zhì)，在苗期是否具有相同的特性有待進(jìn)一步研究。

3.2 木豆種子萌發(fā)期耐鹽性指標(biāo)篩選

作物種質(zhì)資源對(duì)環(huán)境的可塑性是培育品種的基礎(chǔ)[20]，在逆境條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定性和優(yōu)異性的特點(diǎn)，是培育優(yōu)良品種的關(guān)鍵[21]。在作物的萌發(fā)期進(jìn)行耐鹽性鑒定，具有周期性短、效率性高和可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，是鑒定作物出苗率和成苗率的關(guān)鍵時(shí)期[22]。作物材料間具有差異，一般發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)作為作物萌發(fā)期耐鹽鑒定的重要指標(biāo)[23]。

已有研究表明，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)可作為紫花苜蓿(Medicago sativa)種質(zhì)資源萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)[24]。此外，地上部鮮重、根鮮重、根干重、根長(zhǎng)、根體積和根分枝數(shù)可作為綠豆(Vigna radiata)苗期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)[25]；同時(shí)，葉面積、葉綠素?zé)晒?、根冠比和SPAD 可作為苜蓿苗期耐鹽性鑒定指標(biāo)[26]。本研究結(jié)果表明，相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)根冠比、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)根系平均直徑可作為41 份木豆材料耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過隸屬函數(shù)分析和聚類分析得到41 份木豆材料的耐鹽性排序。目前該方法已在大豆(Glycine max)[27]、水稻(Oryza sativa)[28]等作物中應(yīng)用。

本研究表明，鹽脅迫對(duì)木豆種子萌發(fā)的影響主要在表觀形態(tài)方面，體現(xiàn)在幼苗地上部與地下部的生長(zhǎng)差異，未來可進(jìn)一步對(duì)木豆苗期進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，和耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選。

3.3 木豆幼苗耐鹽性生理響應(yīng)評(píng)價(jià)

抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)，可有效清除植物在非生物脅迫下，積累過多的活性氧和維持氧化還原系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡[29]。SOD 主要通過降低氧自由基，清除活性氧，達(dá)到緩解細(xì)胞膜系統(tǒng)損害[30]。POD 和 CAT 則是降低細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的積累，從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，提高逆境耐受能力[31]。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫處理下，隨著木豆種子對(duì)鹽敏感的增加，SOD 活性呈下降趨勢(shì)，POD 活性則呈上升趨勢(shì)；CAT 活性與對(duì)照相比變化較小，但高耐鹽型、耐鹽型同鹽敏感型的變化趨勢(shì)有所不同，較對(duì)照呈下降趨勢(shì)?？偟膩碚f，高耐鹽型和耐鹽型木豆幼苗在鹽脅迫下生理響應(yīng)中，能夠及時(shí)促發(fā)體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)，而中間型和鹽敏感型木豆更能受到鹽離子的侵害。這一研究結(jié)果與鹽脅迫下耐鹽型谷子(Setaria italica)[32]和燕麥(Avena sativa)[33]較鹽敏感型種質(zhì)生理耐受性更強(qiáng)一致。

4 結(jié)論

對(duì)41 份木豆種質(zhì)資源萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)，根據(jù)耐鹽性的強(qiáng)弱可分為高耐鹽型、耐鹽型、中間型和鹽敏感型4 種不同類型。其中，相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)根冠比、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)根系平均直徑可作為后期木豆種質(zhì)篩選主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究為木豆耐鹽種質(zhì)評(píng)價(jià)和耐鹽育種提供理論依據(jù)。