盛 偉，吳欣池，梁 浩，李慈云，馬艷艷，張靖雪，丁西朋，李欣勇，劉國道

（1. 海南大學熱帶作物學院, 海南 ?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所, 海南 儋州 571737）

土壤鹽漬化是一種非生物脅迫，極大地限制了作物的種子萌發(fā)、產(chǎn)量及品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了諸多不便[1]。我國鹽堿化耕地面積已達到3.417 ×107hm2，篩選和種植耐鹽作物是合理利用鹽堿土的有效措施之一[2]。木豆(Cajanus cajan)為豆科牧草，用途廣泛，可作糧食和飼料[3]，在藥理活性[4]方面也具有極大潛力，在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)普遍栽培[5]。因此，開展木豆耐鹽種質(zhì)資源的挖掘及耐鹽機制研究，可為常規(guī)育種工作奠定基礎，為急需改善的鹽堿化耕地提供發(fā)展思路。

目前，關(guān)于木豆品種的篩選鑒定和耐鹽機制的研究仍在起步階段，李拴林等[6]發(fā)現(xiàn)在不同鹽脅迫濃度下木豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根和胚芽，隨鹽濃度的增大而降低。Garg 和Sharma[7]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可降低植物生物量、增加對根的負面效應。不同木豆種質(zhì)資源在形態(tài)指標和物候期方面存在較大變異[8]。在對耐鹽性關(guān)鍵指標的篩選中，已在扁蓿豆(Medicago ruthenica)[9]、偃麥草(Elytrigia repens)[10]、苜蓿(M. sativa)[11]、白三葉(Trifolium repens)[12]和白花草木樨(Melilotus alba)[13]中已經(jīng)明確，但對不同基因型木豆種質(zhì)耐鹽性關(guān)鍵指標的篩選和耐鹽性綜合評價鮮見報道，嚴重影響了木豆在鹽堿地的推廣應用。

本研究以41 份木豆種質(zhì)資源為材料，利用NaCl模擬鹽脅迫，運用變異系數(shù)分析、相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析和聚類分析評價方法，確定木豆萌發(fā)期耐鹽性評價指標，篩選萌發(fā)期耐鹽種質(zhì)，并探討不同基因型木豆種質(zhì)萌發(fā)期鹽脅迫的生理耐受響應機制，旨在為木豆大規(guī)模耐鹽性鑒定和耐鹽機制研究，提供鑒定方法和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料41 份木豆種質(zhì)均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所種質(zhì)資源庫提供(表1)。

表1 41 份木豆種質(zhì)資源基本信息Table 1 Basic information of the 41 pigeon pea varieties

1.2 試驗方法

為確定參試木豆材料萌發(fā)期耐鹽性評價的適宜脅迫濃度，提前從參試材料中隨機選取6 份木豆種質(zhì)材料，分別在NaCl 質(zhì)量分數(shù)梯度為0 (CK)、0.15%、0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50% 時預試驗。結(jié)果表明，NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0.90% 時，6 份木豆材料發(fā)芽率和幼苗生長受到明顯抑制，且材料間差異顯著，因此最終選擇0.90% 的NaCl 溶液用以評價41份木豆材料萌發(fā)期的耐鹽性。

選取大小均勻一致、飽滿、無病蟲害的種子，利用無水乙醇進行浸泡消毒(20 min)，隨后用蒸餾水將種子清洗干凈待用。采用紙上發(fā)芽法，對照組和處理組各設3 次重復，每重復50 粒，每培養(yǎng)皿鋪2 層濾紙，分別施加10 mL 對應溶液。將種子均勻置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在人工氣候箱進行恒溫培養(yǎng)(25 ℃)，相對濕度為50%，第10 天發(fā)芽結(jié)束。

1.3 觀測指標

1.3.1形態(tài)指標的測定

每隔24 h 觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)，以胚根或胚芽突破種皮并長于種子長度為發(fā)芽標準，計算種子的發(fā)芽率(%)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。計算公式如下：

公式(2)中，Gt為第t日種子的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽試驗天數(shù)。

試驗結(jié)束時，每處理隨機選取10 株幼苗，用清水洗凈，稱量鮮重，隨后利用LA-S 根系掃描軟件(杭州萬深檢測科技有限公司)進行掃描分析，獲得幼苗的根長(cm)、苗長(cm)、根長/苗長、根系表面積(cm2)、根系體積(cm3)、根系平均直徑(mm)。

1.3.2 生理指標的測定

在萌發(fā)期耐鹽性不同的各類別中，挑選代表性材料在幼苗第10 天時，進行取樣。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用NBT 光還原法測定[14]；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[15]；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用紫外吸收法測定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2007 進行數(shù)據(jù)錄入和作圖表，SPSS 23軟件進行數(shù)據(jù)分析。使用變異系數(shù)分析、相關(guān)性分析和因子主成分分析，對木豆萌發(fā)期耐鹽性評價指標進行篩選；根據(jù)隸屬函數(shù)分析和聚類分析，對41 份木豆材料萌發(fā)期耐鹽性綜合評價。同時，為減少各材料間指標性狀固有性差異，各指標值均使用相對值來進行分析。

公式(5)為正向隸屬函數(shù)公式，公式(6)為反向隸屬函數(shù)公式，式中：R(Xi) 為各指標隸屬函數(shù)值，Xi為指標測定值，Xmin、Xmax為所有參試材料某一指標的最小值和最大值；Wj為第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度及權(quán)重大?。籔j表示各品種第j個綜合指標的貢獻率；D值表示在鹽脅迫下各品種耐鹽能力的綜合評價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對木豆種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

如表2 所列，鹽脅迫下，木豆種子萌發(fā)期10 項觀測指標的變異系數(shù)在0.178～0.790，說明41 份木豆材料的各指標性狀之間存在差異。其中，相對根系表面積、相對根系體積、相對根長、相對苗長、相對根冠比的變異系數(shù)均在0.500 以上，分別為0.790、0.645、0.621、0.551 和0.580，說明這5 項指標在鹽脅迫后的變化更大。相對根系平均直徑、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)和相對鮮重的變異系數(shù)均未超過0.300，分別為0.253、0.178、0.202、0.293和0.293，說明這5 項指標受鹽脅迫的影響較小。

表2 鹽脅迫下41 份木豆材料的10 項相對指標Table 2 Variation in 10 physiological response indices for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.2 鹽脅迫下木豆種子萌發(fā)期指標的相關(guān)性

如表3 所列，相對根系表面積與相對根系平均直徑極顯著負相關(guān)(P＜ 0.01)，與相對根系體積、相對根長極顯著正相關(guān)；相對根系平均直徑與相對根長顯著負相關(guān)(P＜ 0.05)；相對根系體積與相對活力指數(shù)、相對鮮重、相對根冠比顯著正相關(guān)，與相對根長極顯著正相關(guān)；相對發(fā)芽率與相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)極顯著正相關(guān)；相對發(fā)芽指數(shù)與相對活力指數(shù)顯著正相關(guān)，與相對鮮重顯著負相關(guān)；相對活力指數(shù)與相對根長、相對苗長顯著正相關(guān)，與相對鮮重極顯著正相關(guān)；相對根長與相對苗長顯著正相關(guān)，與相對鮮重和相對根冠比則極顯著正相關(guān)；相對苗長與相對鮮重極顯著正相關(guān)，與相對根冠比極顯著負相關(guān)。這說明10 項觀測指標間密切程度高，進一步通過主成分分析來確定木豆萌發(fā)期耐鹽性評價指標。

表3 鹽脅迫下41 份木豆材料各指標間相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson’s correlation coefficients of 10 physiological response indices for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.3 耐鹽性評價指標篩選

主成分分析(表4) 表明，前4 個主成分的累加貢獻率達80.14%，特征值都大于1，因此將前4 個成分作為41 份木豆材料耐鹽性評價的主要因子。第1 主成分對應特征向量中載荷排名前3 的指標是相對根長、相對根系體積和相對根系表面積，分別為0.790、0.738 和0.718；第2 主成分對應特征向量載荷排名前3 的指標是相對根冠比、相對苗長和相對鮮重，分別為-0.811、0.736 和0.512；第3 主成分對應特征向量載荷排名前3 的指標是相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽率和相對活力指數(shù)，分別為0.903、0.770和0.392；第4 主成分對應特征向量載荷排名前3 的指標是相對根系平均直徑、相對根系體積和相對苗長，分別為0.795、0.365 和-0.322。綜合相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果，選擇4 個主成分中與其他指標存在極顯著相關(guān)性且特征向量絕對值最大的指標(相對根長、相對根冠比、相對發(fā)芽指數(shù)和相對根系平均直徑)作為木豆種子萌發(fā)期耐鹽評價指標。

表4 4 個主成分的貢獻率及載荷矩陣Table 4 Principal component analysis coefficients and cumulative contributions of the 10 physiological response indices used for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.4 41 份木豆耐鹽性綜合評價

綜合隸屬函數(shù)值結(jié)果(表5)表明，41 份木豆材料種子萌發(fā)期耐鹽能力存在明顯差異，排在前3 位的耐鹽綜合隸屬函數(shù)值分別為0.620、0.558 和0.527，都在0.5 以上，表明這3 份材料耐鹽性較強；排在最后3 位的隸屬函數(shù)值都在0.3 以下，分別為0.292、0.289 和0.259，表明耐鹽性較弱。

表5 41 份木豆材料耐鹽隸屬函數(shù)值Table 5 Subordinate function value analysis of 41 pigeon pea varieties under salt stress

聚類分析(圖1) 結(jié)果表明，在歐式距離5 處可將41 份木豆材料劃分為4 個類群：第1 類群為高耐鹽型種質(zhì)，含有1 份種質(zhì)，約占總材料的2.44%；第2 類群為耐鹽型種質(zhì)，含有10 份種質(zhì)，占總材料的24.39%；第3 類群為中間型種質(zhì)，含有23 份種質(zhì)，占總材料的56.10%；第4 類群為鹽敏感型種質(zhì)，含有7 份種質(zhì)，占總材料的17.07%。

圖1 41 份木豆材料耐鹽性聚類分析圖Figure 1 Cluster analysis plot of 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.5 不同耐鹽性木豆在鹽脅迫下的生理響應分析

從耐鹽性結(jié)果得到的4 種不同耐鹽性類群中，分別選擇代表性材料(高耐鹽型“34”、耐鹽型“3”和“9”、中間型“37”和“8”、鹽敏感型“35”和“22”)進行生理指標測定分析。結(jié)果表明，0.9%鹽脅迫處理下不同耐鹽性木豆的SOD 活性均不同程度下降(除鹽敏感型“35”外)，其中，耐鹽型“9”、中間型“8”和鹽敏感型“22”顯著低于對照(P＜ 0.05)，高耐鹽型木豆的SOD 活性高于鹽敏感型(圖2)，表明高耐鹽型木豆較鹽敏感型清除活性氧的能力更強，對細胞膜系統(tǒng)損害的抵抗力更強。0.9% 鹽脅迫處理下的高耐鹽型、中間型和鹽敏感型木豆的POD 活性均顯著高于對照(P＜ 0.05)，分別為對照的3.80 倍、1.91 倍、2.05 倍、4.36 倍、2.91 倍和4.57 倍，高耐鹽型木豆的POD 活性高于耐鹽型、中間型和鹽敏感型；中間型和鹽敏感型木豆在鹽脅迫處理下，其POD 活性呈上升趨勢，表明植株對鹽敏感的程度越高，對細胞損傷程度越高。在0.9% 鹽脅迫處理下，CAT 活性與對照相比變化較小，僅高耐鹽型“34”和耐鹽型“3”顯著高于對照(P＜ 0.05)，但高耐鹽型、耐鹽型同鹽敏感型的CAT 變化趨勢有所不同；高耐鹽型“34”和耐鹽型木豆“3”和“9”的CAT 分別較對照提升了37.02%、97.31% 和11.58%，鹽敏感型木豆“35”和“22”的CAT 較對照降低了34.31%和11.67%。

圖2 不同耐鹽性木豆在鹽脅迫下的超氧化物歧化、過氧化物酶和過氧化氫酶活性Figure 2 Superoxide dismutase (SOD), peroxisome (POD), and catalase (CAT) activities of the different salt-tolerant pigeon pea varieties under salt stress

3 討論

3.1 木豆種子萌發(fā)期耐鹽性評價

本研究發(fā)現(xiàn)，在0.9%鹽脅迫下，41 份木豆種子萌發(fā)期耐鹽性具有明顯差異，可分為高耐鹽型(2.44%)、耐鹽型(24.39%)、中間型(56.10%) 和鹽敏感型(17.07%)。通常情況下，鹽脅迫可顯著降低植物種子發(fā)芽率[9-10,12,17]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，0.9%鹽脅迫對木豆種子的發(fā)芽抑制不顯著，這可能是由于木豆種子發(fā)芽速率快，導致鹽脅迫對其影響不顯著，但是鹽脅迫可顯著抑制木豆幼苗的生長。這一研究結(jié)果與低鹽濃度脅迫能促進草木樨[18]、沙打旺(Astragalus adsurgens)[19]種子發(fā)芽相似。作物的耐鹽性，在不同的生長發(fā)育階段存在差異，木豆在萌發(fā)期表現(xiàn)出較好的耐鹽性種質(zhì)，在苗期是否具有相同的特性有待進一步研究。

3.2 木豆種子萌發(fā)期耐鹽性指標篩選

作物種質(zhì)資源對環(huán)境的可塑性是培育品種的基礎[20]，在逆境條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定性和優(yōu)異性的特點，是培育優(yōu)良品種的關(guān)鍵[21]。在作物的萌發(fā)期進行耐鹽性鑒定，具有周期性短、效率性高和可操作性強的特點，是鑒定作物出苗率和成苗率的關(guān)鍵時期[22]。作物材料間具有差異，一般發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長、苗長作為作物萌發(fā)期耐鹽鑒定的重要指標[23]。

已有研究表明，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)可作為紫花苜蓿(Medicago sativa)種質(zhì)資源萌發(fā)期耐鹽性評價指標[24]。此外，地上部鮮重、根鮮重、根干重、根長、根體積和根分枝數(shù)可作為綠豆(Vigna radiata)苗期耐鹽性評價指標[25]；同時，葉面積、葉綠素熒光、根冠比和SPAD 可作為苜蓿苗期耐鹽性鑒定指標[26]。本研究結(jié)果表明，相對根長、相對根冠比、相對發(fā)芽指數(shù)和相對根系平均直徑可作為41 份木豆材料耐鹽性評價指標。通過隸屬函數(shù)分析和聚類分析得到41 份木豆材料的耐鹽性排序。目前該方法已在大豆(Glycine max)[27]、水稻(Oryza sativa)[28]等作物中應用。

本研究表明，鹽脅迫對木豆種子萌發(fā)的影響主要在表觀形態(tài)方面，體現(xiàn)在幼苗地上部與地下部的生長差異，未來可進一步對木豆苗期進行耐鹽性評價，和耐鹽性評價指標的篩選。

3.3 木豆幼苗耐鹽性生理響應評價

抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)，可有效清除植物在非生物脅迫下，積累過多的活性氧和維持氧化還原系統(tǒng)動態(tài)平衡[29]。SOD 主要通過降低氧自由基，清除活性氧，達到緩解細胞膜系統(tǒng)損害[30]。POD 和 CAT 則是降低細胞內(nèi)過氧化氫的積累，從而保護細胞膜的完整性，提高逆境耐受能力[31]。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫處理下，隨著木豆種子對鹽敏感的增加，SOD 活性呈下降趨勢，POD 活性則呈上升趨勢；CAT 活性與對照相比變化較小，但高耐鹽型、耐鹽型同鹽敏感型的變化趨勢有所不同，較對照呈下降趨勢。總的來說，高耐鹽型和耐鹽型木豆幼苗在鹽脅迫下生理響應中，能夠及時促發(fā)體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)，而中間型和鹽敏感型木豆更能受到鹽離子的侵害。這一研究結(jié)果與鹽脅迫下耐鹽型谷子(Setaria italica)[32]和燕麥(Avena sativa)[33]較鹽敏感型種質(zhì)生理耐受性更強一致。

4 結(jié)論

對41 份木豆種質(zhì)資源萌發(fā)期耐鹽性評價，根據(jù)耐鹽性的強弱可分為高耐鹽型、耐鹽型、中間型和鹽敏感型4 種不同類型。其中，相對根長、相對根冠比、相對發(fā)芽指數(shù)和相對根系平均直徑可作為后期木豆種質(zhì)篩選主要評價指標。本研究為木豆耐鹽種質(zhì)評價和耐鹽育種提供理論依據(jù)。